The NK cell is a large granular lymphocyte that plays a key role in protecting the body against numerous pathogens including parasites, intracellular bacteria, viral infections, as well as showing anti-tumor activity and playing a role in the rejection of allogeneic BM. Unlike other lymphocytic cell types, that utilize rearranging receptors, NK cells are regulated by a complex array of germ line encoded activating and inhibitory receptors. NK cells are often described as a front line or rapid defense given their response to stimuli can be immediate, although they also maintain functions that extend their role well into the adaptive immune system. Inhibitory receptors that recognize MHC class I molecules regulate NK cell responses and self-tolerance. Recent evidence indicates self-ligands not present in the MHC locus can also modulate NK function. We previously demonstrated that the NK receptor repertoire is disrupted by SHIP-deficiency. Here we show that an inhibitory receptor, 2B4, that recognizes an MHC-independent ligand is over expressed in NK cells of SHIP-/- mice at all stages of NK development and differentiation. Overexpression of 2B4 compromises key cytolytic NK functions, including killing of allogeneic, tumor and viral targets. These results demonstrate that in SHIP-/- NK cell 2B4 is the dominant inhibitory receptor. We then furthered this finding by examining the molecular basis of 2B4 dominance. We show that in SHIP-/- NK cells there is increased 2B4 expression as well as a strong bias towards the 2B4L isoform. We have also identified a greater than tenfold increase in SHP1 recruitment to 2B4. Consistent with this SHP1 over recruitment,both a broad and a selective SHP1 inhibitor restore SHIP-/- NK killing of complex targets.Through this study we have identified the molecular mechanism of 2B4 receptor dominance as SHP1 over-recruitment.In addition we have utilized protein array technology to explore NK signaling through the determination of the NK kinome. To this end we have been able to identify multiple pathways that may mark crucial differences between the mature and immature NK cell.

La família del CD150, està formada per receptors de la superfamília de les immunoglobulines, expressats en la membrana de cèl·lules del sistema immune. Es caracteritzen per compartir una elevada homologia estructural i localitzar en la mateixa posició 23 del braç llarg del cromosoma 1. Els membres de la família CD84, CD150, CD229, CD244, CD319 i NTB-A presenten una regió intracel·lular amb, com a mínim, un motiu tirosina del tipus T-V/I-Y-XX-V/I. Aquest és el motiu consens d'unió d'una família de molècules adaptadores anomenades SAP i EAT-2. En humans, deficiències en SAP, són responsables d'una immunodeficiència primària lligada al cromosoma X, caracteritzada per una extrema susceptibilitat al virus de l'Epstein-Barr, amb mononucleosi infecciosa fulminant. L'objectiu d'aquesta tesi ha estat identificar nous lligands intracel·lulars pel receptor CD244 i poder així, comprendre millor les funcions derivades de l'activació d'aquest membre de la família. L'activació del CD244 (o 2B4) comporta una activació de la citotoxicitat i increment de la producció de l'IFN-gamma de les cèl·lules NK i limfòcits T citotòxics CD8+. Mitjançant la tècnica del triple híbrid en llevats, hem trobat que la molècula 3BP2 interacciona directament ambla regió intracel·lular el CD244 en condicions de fosforilació. El 3BP2 és una molècula adaptadora d'expressió preferent en el cèl·lules de llinatge hematopoètic, que sense tenir cap activitat catalítica, té la capacitat de reclutar diferents proteïnes, formant un signalosoma i participant positivament en l'activació de cèl·lules hematopoiètiques. En humans, mutacions puntuals en el 3BP2, són responsables d'una malaltia autosòmica dominant anomenada querubisme, caracteritzada per una degradació dels ossos de les maxil·les, relacionat amb una disfunció dels osteoclasts. El primer objectiu de la tesi, va ser verificar i caracteritzar la interacció entre el receptor CD244 i l'adaptador 3BP2 en cèl·lules humanes de NK. En condicions d'activació, es detectà interacció (coprecipitació i col·localització) entre ambdues proteïnes en la línia de cèl·lules NK,YT, en la què hem sobreexpressat el 3BP2 en pauta amb la proteïna verda fluorescent (EGFP). Aquesta interacció també la detectem en cèl·lules humanes de NK obtingudes de sang perifèrica seguint un protocol d'enriquiment, selecció i expansió amb IL-2. En aquest cas i per tal de detectar la proteïna endògena del 3BP2, fos necessària la producció d'un anticòs monoclonal seguint un protocol de immunització de ratolins amb un pèptid del 3BP2. Seguidament passàrem a caracteritzar les vies de senyalització i respostes funcionals de l'activació del CD244 en un context d'implicació del 3BP2. Demostrem que el 3BP2 està afectant i potenciant la via d'ERK i la capacitat lítica de la cèl·lula NK. En canvi, ni l'activitat de la p38 ni la producció d'IFN-gamma es veuen alterades per la presència o absència del 3BP2. Proposem el 3BP2 com a la molècula que dicta la dicotomia de la resposta de la cèl·lula NK. També analitzàrem la interacció directe del 3BP2 amb els altres membres de la família del CD150, mitjançant al tècnica del triple híbrid. Trobàrem que la regió intracel·lular del receptor CD229 (o Ly9) interacciona directament amb el 3BP2 en condicions de fosforilació. S'ha descrit que el CD229 juga un paper atenuador en l'activació del TCR de la via d'ERK i del factor de transcripció NFAT en el limfòcit T. Els estudis realitzats en aquesta tesis, indiquen que el 3BP2 potencia la inhibició del CD229 mediada sobre l'activació del TCR.Aquesta tesis ha caracteritzat la importància bioquímica i funcional de la molècula adaptadora 3BP2 en la senyalització de dos receptors de la família del CD150. Per una banda, al interaccionar amb el CD244 potencia la capacitat lítica de la cèl·lula NK. Per l'altra, a l'associar-se amb el CD229, l'adaptador 3BP2 incrementa l'atenuació de l'activació del limfòcit T. Per tant, en funció les parelles d'unió que estableix durant l'activació d'aquests receptors, el 3BP2 pot jugar un paper positiu o negatiu en la resposta d'aquests dos tipus cel·lulars. / "ROLE OF THE ADAPTOR MOLECULE 3BP2 REGULATING CD150 LEUKOCYTE RECEPTOR FAMILY FUNCTION" TEXT: CD84, CD150, CD229, CD244, CD319 and NTB-A are members of CD150 family of leukocyte receptors, with the capacity to associate with the family of adaptors SAP and EAT-2 through a tyrosine motif in their cytosolic tail. In humans, SAP deficiencies are responsible for an immunodeficiency called X-linked lymphoprolipherative syndrome (XLP syndrome) characterized by an extreme susceptibility to Epstein-Bar virus. The main goal of this thesis was to identify and characterize new intracellular partners for CD244 (2B4) receptor. This receptor activates NK cell cytotoxicity and IFN-gamma production. Using three-hybrid system, we identified 3BP2 as a binding partner for the receptor. 3BP2 is an adaptor molecule, whose deficiency is linked to a human disease called querubisme, characterized by a degradation of maxillary bones related to osteoclast dysfunction. The interaction between the receptor and the adaptor was bioquemically characterized in an NK cell line and in NK cells from peripheral blood. Next, we studied the implications of 3BP2 during CD244 activation in NK cells. We demonstrated that 3BP2 potentates ERK pathway and cytotoxicity. However, p38 activation and IFN-gamma are not influenced by the adaptor. 3BP2 is established to be the molecule responsible for the dichotomy function of CD244. We also analyzed the interaction between 3BP2 and the other members of CD150 family using three-hybrid system. We found that CD229 (Ly9) can recruit the adaptor. It has been described that CD229 attenuates ERK and NFAT activation during TCR triggering in T lymphocytes. The studies developed in this thesis, indicate that 3BP2 enhances CD229 inhibition during TCR activation. So, this thesis has bioquemically and functionally characterized the implication of the adaptor molecule 3BP2 in regulating the activation of two members of CD150 family of receptors. In one hand, by interacting with CD244, the adaptor enhances NK cytotoxicity. On the other, by associating with CD229, 3BP2 enhances the attenuation of T lymphocyte activation. So, 3BP2 depending on the signalosma complex that creates, positively or negatively regulates these types of cells response.