Thèse doctorat : Biologie-Santé : Lille 1 : 2003. / Trois articles publiés en anglais reproduits dans la thèse. N° d'ordre (Lille 1) : 3398. Résumé. Bibliogr. p. 133-156.

Thesis (Ph. D.)--University of Alabama at Birmingham, 2008. / Title from first page of PDF file (viewed Sept. 19, 2008). Includes bibliographical references.

Thesis (M.S.)--University of Southern California, 1998. / eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references.

Thesis (Ph.D. in Clinical Sciences) -- University of Colorado at Denver and Health Sciences Center, 2005. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 88-108).

Thesis (M.S.)--University of Southern California, 1998. / Includes bibliographical references.

Antikörper, die gegen eine klinisch relevante Gruppe von Rezeptoren innerhalb der Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Superfamilie (TNFRSF) gerichtet sind, darunter CD40 und CD95 (Fas/Apo-1), benötigen ebenfalls eine Bindung an Fc-Gamma-Rezeptoren (FcγRs), um eine starke agonistische Wirkung zu entfalten. Diese FcγR-Abhängigkeit beruht weitgehend auf der bloßen zellulären Verankerung durch die Fc-Domäne des Antikörpers und benötigt dabei kein FcγR-Signalling. Ziel dieser Doktorarbeit war es, das agonistische Potenzial von αCD40- und αCD95-Antikörpern unabhängig von der Bindung an FcγRs durch die Verankerung an Myelomzellen zu entfalten. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Antikörpervarianten (IgG1, IgG1-N297A, Fab2) gegen die TNFRSF-Mitglieder CD40 und CD95 genetisch mit einem einzelkettig kodierten B-Zell-aktivierenden Faktor (scBaff) Trimer als C-terminale myelom-spezifische Verankerungsdomäne fusioniert, welche die Fc-Domäne-vermittelte FcγR-Bindung ersetzt. Diese bispezifischen Antikörper-scBaff-Fusionsproteine wurden in Bindungsstudien und funktionellen Assays mit Tumorzelllinien untersucht, die einen oder mehrere der drei Baff-Rezeptoren exprimieren: BaffR, Transmembran-Aktivator und CAML-Interaktor (TACI) und B-Zell-Reifungsantigen (BCMA). Zelluläre Bindungsstudien zeigten, dass die Bindungseigenschaften der verschiedenen Domänen innerhalb der Antikörper-scBaff-Fusionen gegenüber der Zielantigene vollständig intakt blieben. In Ko-Kulturversuchen von CD40- und CD95-responsiven Zellen mit BaffR-, BCMA- oder TACI-exprimierenden Verankerungszellen zeigten die Antikörper-Fusionsproteine einen starken Agonismus, während in Ko-Kulturen mit Zellen ohne Expression von Baff-interagierenden Rezeptoren nur eine geringe Rezeptorstimulation beobachtet wurde. Die hier vorgestellten αCD40- und αCD95-Antikörper-scBaff-Fusionsproteine zeigen also Myelom-spezifische Aktivität und versprechen im Vergleich zu herkömmlichen CD40- und CD95-Agonisten geringere systemische Nebenwirkungen. / Antibodies that target a clinically relevant group of receptors within the tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRSF), including CD40 and CD95 (Fas/Apo-1), also require binding to Fc gamma receptors (FcγRs) to elicit a strong agonistic activity. This FcγR dependency largely relies on the mere cellular anchoring through the antibody's Fc domain and does not involve the engagement of FcγR signaling. The aim of this doctoral thesis was to elicit agonistic activity from αCD40 and αCD95 antibodies in a myeloma cell anchoring-controlled FcγR-independent manner. For this purpose, various antibody variants (IgG1, IgG1-N297A, Fab2) against the TNFRSF members CD40 and CD95 were genetically fused to a single-chain-encoded B-cell activating factor (scBaff) trimer as a C-terminal myeloma-specific anchoring domain substituting for Fc domain-mediated FcγR binding. These bispecific antibody-scBaff fusion proteins were evaluated in binding studies and functional assays using tumor cell lines expressing one or more of the three receptors of Baff: BaffR, transmembrane activator and CAML interactor (TACI) and B-cell maturation antigen (BCMA). Cellular binding studies showed that the binding properties of the different domains within the fusion proteins remained fully intact in the antibody-scBaff fusion proteins. In co-culture assays of CD40- and CD95-responsive cells with BaffR, BCMA or TACI expressing anchoring cells, the antibody fusion proteins displayed strong agonism while only minor receptor stimulation was observed in co-cultures with cells without expression of Baff-interacting receptors. Thus, the herein presented αCD40 and αCD95 antibody fusion proteins display myeloma cell-dependent activity and promise reduced systemic side effects compared to conventional CD40 and CD95 agonists.

Die Identifizierung von Apoptose-modifizierten Proteinen erfolgte durch Proteomanalyse per 2D-Gelelektrophorese und Massenspektrometrie. Zunächst wurde eine 2DE-Datenbank errichtet, die im Internet zugänglich ist. Die Identifikation von Proteinen durch Peptidmassenfingerabdruck konnte durch Verwendung einer zweiten Matrix verbessert werden. Die Analyse ausgelassener tryptischer Spaltstellen, N-terminaler Pyroglutamatbildung und Oxidation von Tryptophan konnte die Identifikation von Proteinen mittels Peptidmassenfingerabdruck verbessern. Die Apoptose wurde über den Fas-Rezeptor-Signalweg oder durch DNA-Schädigung mittels Cis-Platin eingeleitet und das Totallysat oder die Kompartimente von Jurkat T-Zellen der Proteomanalyse unterworfen. Große Übereinstimmungen der beiden Prozesse wurden festgestellt. 95 Apoptose-modifizierte Proteine wurden identifiziert, wovon 78 Proteine bisher unbekannt für den Apoptoseprozess waren. Auffällig war, dass 40 % der Proteine RNA-Bindungsmotive enthielten und das 21 Onkoprotein oder Onkoprotein-interagierende Proteine identifiziert wurden. Für 39 Proteine konnten bisher proteolytische Spaltungen vorausgesagt werden. Eine Fülle von Informationen wurde über putative Translokationen der Proteine erhalten. Für das Protein p54nrb wurden drei Caspase-3 Spaltstellen durch die Einführung von Mutationen und die Abhängigkeit der Caspase-3 Spaltung von RNA bewiesen. Mitochondriale ribosomale Proteine von Mensch, Maus und Ratte wurden durch Abgleichung von EST-Datenbanken mit partiellen Aminosäuresequenzen aus dem Rind bestimmt. Die Konservierung der Sequenzen der Säugetierproteine der mitochondrialen ribosomalen Proteinen war geringer als von den bekannten cytosolischen ribosomalen Proteinen. Weiterhin wurden unterschiedliche Ergebnisse bzgl. der mitochondrialen Signalsequenzen der Proteine gefunden. RNA-Protein-Wechselwirkungen im Ribosom wurden nach Quervernetzung auf einzelne Aminosäuen bzw. Nukleotide bestimmt. Die Daten wurden zur Verbesserung von ribosomalen Modellen verwendet. Die mittlerweile erhaltenen Kristallstrukturen des Ribosoms zeigten, dass die Ergebnisse der Quervernetzungsexperimente mit den tatsächlichen RNA-Protein-Wechselwirkungen weitgehend übereinstimmen. Die Affinität von verschiedenen Komponenten zu einem Zielmolekül zur Bildung von nicht-kovalenten RNA-Peptid-Wechselwirkungen wurde mit Hilfe von MALDI-MS ermittelt. Die Interaktionen sind stark abhängig von der Anzahl der Arginine. / Apoptosis-modified proteins were identified by proteome analysis via 2D gel electrophoresis and mass spectrometry. First, a internet-accessible 2DE database was rendered. The identification of the proteins by peptide mass fingerprinting was improved using a second matrix. The analysis of missed tryptic cleavage sites, the formation of N-terminal pyroglutamine and oxidation of tryptophan could improve the identification of proteins by peptide mass fingerprinting. Apoptosis was induced via the Fas-receptor signaling pathway or by means of DNA damage by cis-platin. The total lysate and the compartments of Jurkat T cells were analyzed by proteome analysis. High similarities between both processes were observed. 95 apoptosis-modified proteins were identified, 78 of these were until now unknown to be involved in apoptosis. Noticeable, 40% of the proteins include a RNA-binding motif and 21 oncogene or oncogene-interacting proteins were identified. A proteolytic cleavage could be predicted for 39 proteins. Some information was received about the putative translocation of the proteins. Three caspase-3 cleavage sites were shown for the protein p54nrb with the incorporation of mutations. Furthermore, the caspase-3 cleavage was dependent on the occurrence of RNA. Mitochondrial ribosomal proteins of human, mouse and rat were determined by screening of EST-databases with partial amino acid sequences from bovine. The conservation of sequences of mammalian proteins of the mitochondrial ribosomal proteins was less than for known cytosolic ribosomal proteins. Furthermore, different results were obtained considering mitochondrial signal sequences. RNA-protein interaction within the ribosome were determined on single amino acids and nucleotides, respectively, after cross-linking. These data were used to improve models of the ribosome. The in the meantime obtained 3D-structures of the ribosome showed high consistency with the revealed RNA-protein interaction sites after cross-linking. The affinity of different components to a target molecule to form RNA-peptide interactions was determined by MALDI-MS. The interactions were strongly dependent on the number of arginines.

No description available.

Le récepteur de mort CD95 participe à de nombreuses fonctions physiologiques en transmettant des signaux apoptotiques. Son ligand membranaire, CD95L, est principalement exprimé à la surface des lymphocytes et contrôle ainsi l’homéostasie cellulaire et l’élimination des cellules infectées ou transformées. Certaines situations pathologiques conduisent à une expression ectopique du CD95L par d’autres types cellulaires,associé à son clivage par des métalloprotéases (cl-CD95L). La forme soluble ainsi libérée perd sa capacité à transmettre l’apoptose mais déclenche l’activation de voies non-apoptotiques induisant l’inflammation dans des maladies inflammatoires chroniques comme le lupus érythémateux systémique (LES) ou encore les formes métastatiques du cancer du sein. Dans ces deux pathologies, de fortes quantités de cl-CD95L sont détectées dans le sérum de ces patients et ont été associés à la progression des pathologies. Dans le LES, nous établissons que cl-CD95L contribue au processus inflammatoireen favorisant la transmigration endothéliale des lymphocytes Th17. Cette migration cellulaire dépendante de CD95 nécessitele recrutement de la PLCγ1 sur le domaine juxta-membranaire de CD95 qui induitl’activation du signal calcique. Pour identifier d’autres partenaires moléculaires de CD95, une analyse protéomique a été réalisée et a permis d’identifier une association entre CD95 et la machinerie traductionnelle. Cette interaction nécessite le recrutement d’eIF4A1 au niveau du domaine juxta-membranaire de CD95. Nous avons par ailleurs montré que dans des lignées cancéreuses mammaires, eIF4A1 participe à la traduction de certaines protéines comme la sérine-thréonine kinase Akt pour faciliter l’activation de la voie de signalisation PI3K et la migration cellulaire induite par CD95. Cette étude a donc mis en évidence l’implication d’un nouveau domaine de CD95 dans l’induction des signaux non-apoptotiques. Ce domaine juxta-membranaire a été nommé CID pour « calcium inducing domain ». De plus, ce domaine fusionné à un peptide perméant provenant de la protéine TAT appelé TAT-CIDa montré son efficacité pour inhiber la migration lymphocytaire chez les souris lupiques et offre de nouvelles perspectives pour le développement de traitements améliorants les symptômes inflammatoires du LES. / The death ligand CD95L, mainly expressed by immune cells, contributes to the elimination ofinfected and transformed cells. In pathological contexts, CD95L can be expressed by others cell types such as endothelial cells.CD95L can be cleaved by metalloproteases to generate a soluble CD95L (cl-CD95L) failing to trigger the apoptotic signaling pathwaybutinducing non-pro-apoptotic signaling pathways. cl-CD95L promotes inflammation in chronic inflammatory disorders such as systemic lupus erythematosus (SLE) and increases risks of metastatic dissemination in breast cancer patients. In SLE patients, we established that high amounts of cl-CD95L fuels inflammation by promoting endothelial transmigration of activated Th17 cells. This CD95-drivencell migration requires PLCγ1 recruitment by CD95 and the subsequentimplementation of the calcium signal. To identify in an exhaustive fashion, all molecular partners of CD95, a global proteomic analysis was undertaken. This TAP-Tag approach highlighted a strong association between the translational machinery and CD95. This analysis was confirmed by a two-hybrid approach revealingthat the translation initiation factor eIF4A1 directly interactedwith CD95.In breast cancer cells, we established that eIF4A1 was instrumental in the translation of certain genes such as Akt contributing to the implementation of the CD95-mediated PI3K signaling pathway and cell migration. In this study, we identifiedthe CD95 domaininvolved in the induction of the non-apoptotic signaling pathway. This domain was named CID for “calcium inducing domain”.Moreover, wegenerated a therapeutic molecule consisting of theCID fused to the cationic cell-penetrating HIV TAT domain. TAT-CID prevented the accumulation of Th17 cells in inflamed organs of lupus-prone mice and could turn out to be an original therapeutic molecule to alleviate clinical symptoms in SLE patients.

<p>Multiple myeloma (MM) is a virtually incurable B cell malignancy of the bone marrow. One important part of tumor progression and an obstacle for successful therapy is resistance to apoptosis. To combat this resistance, the mechanisms of apoptosis and survival in MM must be better defined. </p><p>In this thesis, we identified Fas up-regulation as a mechanism underlying interferon (IFN)-mediated sensitization to Fas-induced apoptosis in the MM cell line U-266-1970. IFN treatment induced activation of signal transducer and activator of transcription (Stat)1 but, intriguingly, also attenuated activation of MM survival factor Stat3. </p><p>Exploring the role of Stat1 further, we established sub-lines of U-266-1970 with a stable over-expression of Stat1 and of its active mutant Stat1C. These sub-lines displayed a decreased expression and activation of Stat3, and an altered expression of apoptosis-related genes Harakiri, Bcl-2 and Mcl-1. In a drug library screening, Stat1 over-expression was associated with an increased sensitivity to Fas-induced apoptosis and, conversely, an increased resistance to several drugs, including the cyclin dependent kinase (cdk)1 inhibitor CGP74514A. We conclude that Stat1 over-expression does not confer a general resistance or sensitivity to apoptosis in MM, but may strongly affect the response to some specific drugs.</p><p>We also explored the effects of picropodophyllin (PPP), an inhibitor of the insulin-like growth factor I (IGF-I) receptor tyrosine kinase (RTK), in MM. PPP selectively inhibited the IGF-I RTK activity without inhibiting the insulin RTK activity. Furthermore, PPP potently induced cell cycle arrest and apoptosis in all MM cell lines and patient samples tested, also in the presence of survival factors IGF-I and IL-6. We conclude that PPP has great therapeutic potential in MM </p><p>Finally, we examined the expression and regulation of the inhibitors of apoptosis proteins (IAPs) in a panel of MM cell lines and patient samples. The glucocorticoid dexamethasone, which is used in MM therapy, induced a transient up-regulation and a subsequent down-regulation of c-IAP2, as well as a down-regulation of XIAP, possibly influencing the sensitivity to apoptosis induced by this drug. Supporting this notion, abrogation of IGF-IR signaling by PPP, which sensitizes MM cells to dexamethasone-induced apoptosis, enhanced the down-regulation of c-IAP2 and XIAP.</p>