Hepatitis B Virus (HBV) Infektionen verursachen entzündliche Erkrankungen der Leber. Insbesondere die frühen Phasen des HBV Lebenszyklus sind noch nicht geklärt, so ist z.B. der Rezeptorkomplex an den HBV bindet unbekannt. Mittlerweile stehen neue Infektionsmodelle zur Verfügung um den HBV Lebenszyklus zu untersuchen. Dies erfordert eine effiziente Zellkultur basierende Methode um große Mengen infektiöser Partikel zu generieren. Ein Ziel der Arbeit war durch Kultivierung auf Mikrocarrier die HBV Produktion der Zelllinie HepG2.2.15 zu steigern. Die Analyse von Protein und HBV Sekretion, Infektiösität und MAP Signalübertragung ergab eine 18x höhere HBV Produktion bei einer reduzierten Sekretion von subviralen Partikeln durch HepG2.2.15 die auf Mikrocarrier kultiviert wurden. Der Anstieg der Virusproduktion korreliert mit einer verstärkten Aktivierung der MAP Kinase ERK-2, die mit HBV Replikation in Verbindung steht. Ein weiterer wenig verstandener Teil des HBV Lebenszyklus ist der Kernimport des HBV Genoms. Spuren der viralen Polymerase finden sich im Zellkern von HBV infizierten Zellen. Ziel der Arbeit war, Motive in der HBV Polymerase zu finden, die in der Lage sind Zelllokalisation zu beeinflussen. Durch Sequenzvergleich wurde eine konservierte zweiseitige Kernlokalisationssequenz im Terminalen Protein der HBV Polymerase identifiziert, die eine Proteinkinase CKII Erkennungsstelle enthält. Inhibition der CKII Aktivität in HBV infizierten primären Hepatozyten sowie die Zerstörung der CKII Erkennungsstelle im Terminalen Protein inhibieren die HBV Replikation. Die Funktionalität der Kernlokalisationssequenz wurde durch Fusion an GFP bestätigt und war Abhängig von CKII Aktivität in der Zelle. Dies wurde in vitro durch Bindung des Adapterproteins Karyopherin-alpha an CKII-phosphoryliertes Terminales Protein bestätigt. Die HBV Polymerase enthält eine konservierte zweiseitige Kernlokalisationssequenz deren Funktionalität durch CKII Phosphorilierung vermittelt wird. / Hepatitis B virus (HBV) infection causes acute and chronic liver inflammation. Especially the early phase of the HBV life cycle is not clearly understood. For example the receptor complex that mediates viral entry is not known. Novel infection models to study the HBV lifecycle are described that demand for a large amount of cell culture generated infectious HBV particles. One aim was to enhance HBV production of the cell line HepG2.2.15 by cultivation on microcarrier substrate. Analysis of protein and viral particle secretion, infectivity, and cellular MAP kinase signaling revealed an up to 18x increased HBV production and a decreased subviral particle secretion by HepG2.2.15 when cultivated on microcarrier. The observed effect was due to an enhanced phospho-activation of MAP kinase ERK-2 that is tightly associated with HBV replication. Another poorly understood part of the HBV lifecycle is the mechanism that delivers the HBV genome into the nucleus. Traces of HBV polymerase can be found in HBV infected cells. The second objective was to identify motifs on the HBV polymerase that determine its subcellular localization. By sequence alignment a conserved bipartite nuclear localization signal was found in the terminal protein of the HBV polymerase encompassing a protein kinase CKII recognition site. Inhibition of CKII kinase in infected primary hepatocytes and destruction of the identified CKII recognition site in the viral polymerase impaired virus production. The functionality of the putative nuclear localization signal was confirmed by fusion to GFP. Moreover, its functionality was depended on CKII activity that was verified by in vitro binding experiments of terminal protein to the import adaptor karyopherin-alpha. This data identified a nuclear localization signal in the HBV polymerase, which functionality is mediated by CKII phosphorylation.

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Les gènes des doigts WIP-zinc provenaient de l'établissement de l'évolution rapide du clade Viridiplantae de bryophytes et ptéridophytes. Depuis les bryophytes ancestrales des premières plantes terrestres deux clades principaux ont evolveld, basé sur notre analyse cladistique de la partie C-terminale des WIP. Le thème commun et le caractère démontré par les protéines à doigts de zinc AtWIP sont mis en évidence par leurs découvertes dans des rôles régulateurs de croissance et de développement orgue. Cependant, la protéine moléculaire interagissant partenaires et les mécanismes par lesquels les fonctions de WIP sont orchestrés restent encore inconnues. Ici, nous montrons les interactions entre protéines moléculaires et des modes de localisation sub-cellulaire de CmWIP1 et ses interacteurs pour élucider son rôle de régulateur dans le sexe détermination Cucumis melo fleurs. Sur la base des interactions levures deux écran hybride de protéine-protéine de la banque d'ADNc de melon généré, nous déclarons que la protéine interagit physiquement CmWIP1 très fortement avec CmbZIP et CmLHP1. Aussi interaction n'a été observée avec le complexe CKII en C. melo qui se compose de CmCKIIα, CmCKIIβ1 et CmCKIIβ2 sous-unités. Approches de génétique inverse ont été utilisées pour tenter de valider fonctionnellement les interacteurs clés in planta. Le passage d'homme à fleurs femelles en traits gynoïques résultats de répression épigénétique de l'expression d'un facteur de doigt de zinc de type de transcription, CmWIP1 situé au niveau des loci g dans Cucumis melo. Lorsqu'elle est exprimée, CmWIP1 est responsable de l'avortement carpien entraînant simples fleurs mâles sexués d'une origine bisexuel initial. La surexpression de CmWIP1 (sous promoteur 35SCaMV) chez Arabidopsis thaliana a donné lieu à des plantes présentant un retard de croissance global du-et-dessus des parties sous-sol plantes, feuilles dentelées vrais, des anomalies de croissance floraux et sillique ainsi que médiocre rendement des semences. 35S: CmWIP1 lignées d'insertion développés ont été surveillés en permanence et phénotypées sur T1 à T4 générations pour la stabilité de la dentelure phénotype feuilles. Fait intéressant, deux autres lignes sur-expression portant AtWIP1 et AtWIP2 causés dentelures des feuilles semblables à celles de CmWIP1 surexpression tout sous promoteurs 35SCaMV. Deux lignées stables homozygote pour 35S: CmWIP1 insertion ont été sélectionnés à la génération T4 et muté à 0,3% EMS. Un millier de vracs lignées familiales m2 (5 plants par vrac) ont été examinés pour les personnes réversion avec des feuilles non dentelée et taux de croissance restaurés. Écrans stade végétatif révélé deux révertants putatifs et 7% albinos. Les écrans suivants pour révertants ont été réalisées à des stades de reproduction et également pour les essais de la longueur des racines primaires ont été réalisées afin de valider révertants putatifs. Révertants putatifs familles ont encore été validés en tant que candidats pour la cartographie suppresseur par séquençage Sanger de la 35S :: CmWIP1 insertion par le dépistage de la séquence des mutations qui pourraient être la mutation causale. / The WIP-zinc finger genes originated from the early evolutionary establishment of the Viridiplantae clade from bryophytes and pteridophytes. From the ancestral bryophytes the first terrestrial plants two main clades have evolveld, based on our cladistic analysis of the C-terminal part of the WIPs. From the in silico analysis, CmWIP1 encodes are largely bi-partite protein in nature with the N-terminal acquired for protein-protein interactions whilst the C-terminal part is possibly mainly for DNA binding and some unknown processes involved in chromatin modulation/regulation (the presence of POST-SET domains). The common theme and character demonstrated by the AtWIP-Zinc finger proteins are highlighted by their discoveries in regulatory roles of organ growth and development. However, the molecular protein interacting partners and mechanisms by which the WIP functions are orchestrated still remain unknown. Here we show molecular protein interactions and sub-cellular localization patterns of CmWIP1 and its interactors to elucidate its regulatory role in the sex determination Cucumis melo flowers. Based on the protein-protein interactions yeast two hybrid screen of the melon cDNA library generated, we report that CmWIP1 protein physically interacts very strongly with CmbZIP and CmLHP1. Also interactions were observed with the CKII complex in C. melo which is made up of CmCKIIα, CmCKIIβ1 and CmCKIIβ2 subunits. CmWIP1 also interacts with CmTHF1 and CmPTR. Reverse genetic approaches were utilized in attempts to functionally validate the key interactors in planta. The transition from male to female flowers in gynoecious lines results from epigenetic repression of the expression of a zinc finger type transcription factor, CmWIP1 located at the g loci in Cucumis melo. When expressed, CmWIP1 is responsible for carpel abortion resulting in single sexed male flowers from an initial bisexual origin. Over-expression of CmWIP1 (under 35SCaMV promoter) in Arabidopsis thaliana resulted in plants with overall growth retardation of above- and under-ground plant parts, serrated true leaves, floral and sillique growth abnormalities as well as poor seed yield. 35S:CmWIP1 insertion lines developed were continuously monitored and phenotyped over T1 to T4 generations for stability of the leaf serration phenotype. Interestingly, two other over-expression lines carrying AtWIP1 and AtWIP2 caused leaf serrations similar to that of CmWIP1 overexpression all under 35SCaMV promoters. Two stable lines homozygote for 35S:CmWIP1 insertion were selected at the T4 generation and mutagenized with 0.3 % EMS. A thousand bulks of M2 family lines (5 plants per bulk) were screened for revertant individuals with unserrated leaves and restored growth rates. Vegetative stage screens revealed both putative revertants and 7 % albinos. Subsequent screens for revertants were carried out at the reproductive stages and also for primary root length assays were carried out to validate putative revertants. Putative revertants families were further validated as candidates for suppressor mapping via Sanger sequencing of the 35S::CmWIP1 insert by screening of the sequence for mutations which could be the causative mutation.

La modification post-traductionnelle par les « Small Ubiquitin-Like MOdifyers (SUMOs) » est un processus majeur de régulation qui influence plus d’une centaine de protéines. Cette modification (SUMOylation) touche plusieurs fonctions nucléaires telles que la réparation de l’ADN, la réplication et la transcription. La SUMOylation affecte une protéine le plus souvent en permettant la formation de nouvelles interactions protéine-protéines avec des facteurs de régulations qui possèdent un court segment hydrophobe dans leur séquence connu sous le nom de « SUMO interacting motif (SIM) ». Bien que les interactions SUMO-SIMs soient bien documentées, la description de leur régulation n’est pas complète. Cette thèse décrit des études fonctionnelles et structurales sur différents mécanismes de régulation des interactions SUMO-SIMs. Plus précisément, elle décrit les effets de l’acétylation et de la queue N-terminale des protéines SUMOs sur leur capacité à réguler les interactions entre SUMOs et les SIMs de trois protéines : le suppresseur de tumeur « promyelocytic leukemia (PML) », le corépresseur de transcription « Death Domain Associated Protein 6 (Daxx) » et « Protein Inhibitor of Activated STAT (PIAS) », une ligase E3 pour SUMO. La première étude décrit l’effet de l’acétylation de SUMO1 sur sa capacité à interagir avec les SIMs de PML et de Daxx. À partir d’expériences de titrage calorimétrique et d’études cristallographiques, nous avons démontré que l’acétylation précise de certains résidus conservés chez SUMO1 (K39 et K46) réduit fortement l’affinité avec les deux SIMs testés. En contraste, nous démontrons que l’acétylation du résidu K37 sur SUMO1 à un effet inhibiteur spécifique pour le SIM de Daxx. Les structures cristallographiques des complexes formés entre les variants acétylés de SUMO1 avec les SIMs concordent avec les données des titrages et suggère une plasticité dans la formation des liens sur la surface d’interaction. Partant de ce constat, nous postulons que la plasticité observée dans la structure des complexes acétylés démontre un mécanisme de régulation des interactions SUMO-SIMs par l’acétylation de résidus conservés chez SUMO1. Dans la deuxième étude, nous avons identifié un deuxième SIM à l’extrémité C-terminale de protéines de la famille (PIAS1-2-3). Nous démontrons que ce SIM est capable de lier SUMO1 et que structurellement la phosphorylation de résidus clés dans ce domaine ainsi que l’acétylation de SUMO1 peut contrôler cette interaction. Une comparaison avec le premier SIM des variants PIAS démontre que les deux SIMs sont affectés différemment par la phosphorylation et l’acétylation. En outre, nous avons déterminé que le nouveau SIM identifié joue un rôle important dans la formation d’un complexe ternaire répresseur de la transcription, formé des protéines PIAS, SUMO1 et de l’enzyme de conjugaison « UBiquitin Conjugating enzyme E2I (UBC9) ». Pris ensemble, ces résultats donnent une description atomique de l’interaction d’un nouveau SIM chez PIAS avec SUMO1 et décris comment la phosphorylation et l’acétylation peuvent sélectivement réguler la spécificité des SIM trouvés chez les variants PIAS. Finalement, dans la dernière étude, nous avons exploré le rôle de la queue N-terminale des paralogues SUMO1 et 2 sur sa capacité à moduler les interactions SUMO-SIMs. Nous avons démontré que la queue N-terminale de SUMO1, mais pas SUMO2, avait un effet auto-inhibiteur sur les interactions SUMO-SIMs et que cet effet dépendait de la présence de résidus chargés négativement présent dans le SIM. Aussi, nous avons démontré que l’effet auto-inhibiteur était spécifique à la surface d’interaction des SIMs sur SUMO1. De plus à partir d’études cristallographiques et de calorimétrie, nous avons démontré que l’effet auto-inhibiteur de la queue N-terminale de SUMO1 peut être neutralisé par la présence de zinc. La structure cristallographique du complexe entre SUMO1 et le SIM de PML démontre que le zinc stabilise la formation de liens entre des résidus chargés négativement du SIM et de la queue N-terminale de SUMO1. De plus, le zinc induit la formation d’une hélice α dans la queue N-terminale de SUMO1 qui est normalement intrinsèquement désordonnée. En résumé, cette étude donne une description atomique de l’effet de l’acétylation sur les interactions SUMO-SIMs, décris un nouveau SIM dans la famille de protéines PIAS et identifie un nouveau rôle de la queue N-terminale de SUMO1 ainsi que comment cette région peut définir la sélectivité des paralogues SUMOs. / Post-translational modification with the « Small Ubiquitin-Like MOdifyer (SUMO) » is a major regulatory process (commonly referred to as SUMOylation) that regulates hundreds of proteins associated with a diverse array of biological activities including several nuclear functions such as DNA repair, replication and transcription. SUMOylation of a protein can impact its function in many ways most often by providing an additional binding surface for forming protein-protein interactions with regulatory factors through short hydrophobic regions on their binding partners known as « SUMO interacting motif (SIM) ». Although SUMO-SIM interactions are well documented, there are nevertheless outstanding questions that still need to be addressed regarding their controlling mechanisms. This thesis reports functional and structural studies on the regulatory mechanisms that govern SUMO-SIM interactions. More precisely, we studied how acetylation and the amino-terminal tail of SUMO proteins affects the interaction of SUMO with model SIMs from three proteins: the « promyelocytic leukemia (PML) » tumor suppressor, the transcriptional corepressor « Death Domain Associated Protein 6 (Daxx) » and the SUMO E3 ligase « Protein Inhibitor of Activated STAT (PIAS) ». The first study reports the role that acetylation of SUMO1 plays on its binding to the SIMs of PML and Daxx. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) experiments demonstrated that acetylation of SUMO1 at conserved residues (K39 and K46) dramatically reduces the binding to the SIMs of PML and Daxx. In contrast, SUMO1 acetylation at K37 dramatically reduced binding to the SIM of Daxx but only had minimal impact on binding to the SIM of PML. Crystal structures of the SUMO1 acetylated variants bound to the two SIMs support the ITC titrations and suggest that there is plasticity in SUMO-SIM interactions. The plasticity observed in the structures of these complexes would provide a robust mechanism for regulating SUMO-SIM interactions using a combination of signalling mechanisms that control post-translational modifications. In the second study, we identified and characterized a novel SIM at the C-terminal extremity of three of the four known variants of the PIAS-family proteins (PIAS1-2-3). We demonstrated that this SIM binds to SUMO1 and structurally show that phosphorylation of the SIM or acetylation at select lysine residues of SUMO1 alters this interaction. In addition, we determined that it plays an important role in the formation of ternary complex made of SUMO1, PIAS1 and the « UBiquitin Conjugating enzyme E2I (UBC9) » in human cells. Together, these results provide an atomic description of the interaction between the C-terminal SIM of PIAS proteins and SUMO1 as well as important insight into how posttranslational modifications selectively regulate the specificity of the SIMs found in PIAS1-2-3. Finally, our third study explores the intrinsically disordered N-terminal tail of SUMO paralogs and their ability to regulate SUMO-SIM interactions. We demonstrate that the N-terminal region of SUMO1, but not SUMO2, has an auto-inhibitory effect on the binding to SIMs and that this effect is dependent on the presence of acidic or phosphorylated residues that within the SIM. In addition, we also determined that this inhibition does not affect the interaction of SUMO1 with its E2 conjugating enzyme UBC9. Using titration calorimetry and crystallographic screening, we identified zinc as a negative regulator of this auto-inhibitory effect. The crystallographic structure of the complex between SUMO1 and the SIM of PML shows that zinc stabilises the formation of interactions with the negatively charged residues within the SIM and the N-terminal tail of SUMO1. Interestingly, zinc also appears to stabilize the formation of an α-helix within the N-terminal tail of SUMO1 which is normally intrinsically disordered. In summary, this thesis describes the underlying atomic regulatory mechanisms of SUMO-SIM interactions by acetylation, reveals a novel SIM within the PIAS SUMO E3 ligase family and describes an unprecedented role of the N-terminal region of SUMO1 and provides important insight on how this region can define SUMO paralog specificity.

La localisation de l'ARNm est un mécanisme post-transcriptionnel régulant l'expression des gènes qui donne un contrôle précis sur la production spatiale et temporelle des protéines. Des milliers de transcrits dans un large éventail d'organismes ou de types cellulaires se sont avérés localisés dans un compartiment sous-cellulaire spécifique. La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae est l'un des organismes modèle les plus étudiés pour comprendre le processus de localisation de l'ARNm. Plus de trente ARNm sont activement transportés et localisés à l'extrémité du bourgeon de la levure bourgeonnante. Dans cet organisme, la localisation des transcrits à l'extrémité du bourgeon, tels que l'ARNm ASH1, dépend de la protéine de liaison à l'ARN She2, qui interagit directement avec les éléments de localisation dans ces ARNm durant leur transcription. She2 est une protéine liant l’ARN non-canonique, qui s’assemble en tétramère pour pouvoir lier l’ARN. Lorsque le complexe ARNm-She2 est exporté vers le cytoplasme, celui-ci interagit avec la protéine She3 et la myosine Myo4, qui transportent le complexe vers le bourgeon. Une fois qu'un ARNm est correctement localisé, sa traduction est activée pour permettre la synthèse locale de sa protéine. Les mécanismes régulant la localisation des ARNm sont encore très peu connus. Cependant, plusieurs évidences suggèrent que la machinerie de localisation peut être régulée par des modifications post-traductionnelles. Dans notre étude, en utilisant une colonne de purification de phosphoprotéines, nous avons constaté que She2 est une phosphoprotéine. Nous avons utilisé une approche de phosphoprotéomique pour identifier les résidus phosphorylés dans She2 in vivo. Nous avons identifié plusieurs nouveaux phosphosites qui affectent la capacité de She2 à favoriser l'accumulation asymétrique de la protéine Ash1. Fait intéressant, plusieurs phosphosites sont présents aux interfaces de dimérisation et de tétramérisation de She2. En nous concentrant sur la position T109, nous montrons qu'un mutant phosphomimétique T109D inhibe l'interaction She2-She2 et diminue l'interaction de She2 avec ses cofacteurs Srp1, She3 et l’ARNm ASH1. Fait intéressant, la mutation T109D réduit considérablement l'expression de She2 et perturbe la localisation de l'ARNm ASH1. Nos résultats montrent que le contrôle de l'oligomérisation de She2 par phosphorylation représente un mécanisme qui régule la localisation de l'ARNm dans la levure bourgeonnante. Dans le but d’identifier la ou les kinases impliquées dans la phosphorylation de She2, nous avons recherché des motifs de reconnaissance de kinases connues parmi les phosphosites que nous avons identifiés. Nous avons trouvé que les résidus T109, S217 et S224 font partie de sites putatifs de la Caséine kinase II (CKII), suggérant que ces positions seraient susceptibles d'être phosphorylés par cette kinase. Un essai de phosphorylation in vitro a révélé que She2 est phosphorylée par CKII au niveau des résidus S217 et S224, mais pas au résidu T109. Nous avons montré que la phosphorylation de la forme monomérique de She2 par CKII in vitro est augmentée par rapport à la forme sauvage tétramérique. De plus, nous avons observé que le domaine C-terminal de She2, qui contient sa séquence de localisation nucléaire (NLS) est phosphorylé par CKII. Cependant, le rôle de la phosphorylation dans le NLS de She2 demeure inconnu. Dans l'ensemble, nos résultats montrent que les modifications post-traductionnelles sur She2 régulent la localisation de l'ARNm chez la levure. Cette étude permettra d'élucider les mécanismes de contrôle de la localisation de l'ARNm chez la levure et comment des modifications post-traductionnelles sur She2 régulent ce processus. / mRNA localization is a post-transcriptional mechanism regulating gene expression that gives precise control over the spatial and temporal production of proteins. Thousands of transcripts in a wide array of organisms or cell types were shown to localize to specific subcellular compartments. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae serves as one of the best model organisms to study the mechanisms of mRNA localization. Over thirty transcripts are actively transported and localized at the bud tip of the budding yeast. In this organism, localization of transcripts to the bud tip, such as the ASH1 mRNA, depends on the RNA-binding protein She2, which is responsible for recognizing localization elements in these mRNAs during transcription. She2 is a non-canonical RNA-binding protein which assembles as a tetramer in order to bind RNA. When the mRNA-She2 complex is exported to the cytoplasm, the protein She3 and myosin Myo4 join the complex to transport it to the bud. Once an mRNA is properly localized, its translation is generally activated to allow the local synthesis of its protein. The mechanisms regulating the localization of mRNAs are still poorly known. Still, several pieces of evidence suggest that post-translational modifications may regulate the localization machinery. Using a phosphoprotein purification column, we found that She2 is a phosphoprotein. We used a phosphoproteomic analysis to identify the phosphorylated residues in She2 in vivo. We identified several new phosphosites that impact the capacity of She2 to promote the asymmetric accumulation of Ash1. Interestingly, several of these phosphosites are present at the dimerization and tetramerization interfaces of She2. Focusing on T109, we show that a phosphomimetic mutant T109D inhibits She2-She2 interaction and decreases the interaction of She2 with its co-interactors Srp1, She3 and ASH1 mRNA. Interestingly, the T109D mutation significantly reduces the expression of She2 and disrupts ASH1 mRNA localization. Altogether, our results show that the control of She2 oligomerization by phosphorylation represents a mechanism that regulates mRNA localization in budding yeast. In order to identify which kinase(s) are involved in She2 phosphorylation, we searched for known kinases recognition motifs among the identified phosphosites. We found that T109, S217 and S224 are putative Casein kinase II (CKII) sites, suggesting that this kinase may phosphorylate these residues. Indeed, an in vitro phosphorylation assay revealed that She2 is phosphorylated by CKII at S217 and S224 but not at T109. We found that the phosphorylation of a monomeric She2 mutant by CKII in vitro is increased compared to the wild-type tetrameric protein. Furthermore, we found that the C-terminal domain of She2, which contains its nuclear localization signal (NLS), is phosphorylated by CKII. However, the biological function of the phosphorylation in the NLS is still unknown. Altogether, our results show that post-translational modifications in She2 regulate mRNA localization in yeast. This study will help elucidate the mechanisms that control mRNA localization in yeast and how post-translational modifications in She2 regulate this process.

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