Breast and ovarian cancers are the most serious cancers among women. Relatively high mortality at advanced stages of the disease is often associated with the development of resistance to the cytotoxic agents. Chemoresistance usually develops on the base of different adaptive mechanisms that significantly decrease therapy efficiency. Currently TRIP6, ABCC3 and CPS1 enzyme has been identified based on high-capacity expression profile monitoring in tumor cell and tissue profiles as one such candidate playing a role in taxane resistance. The main goal of this thesis was to clarify the role or possible association of the ABCC3, CPS1 and TRIP6 genes with the development of tumor cell resistance to taxanes in models of sensitive and paclitaxel-resistant ovarian cancer cells and in the cohorts of patients with ovarian and breast cancer. The in vitro part compares the efficacy of paclitaxel and taxane derivatives in the sensitive and resistant ovarian cancer cell lines and clarifies the association between the different structure of taxane derivatives and the change in CPS1 expression after their application. The study in patient's cohorts with ovarian cancer reveals a relationship between higher levels of the CPS1 gene and shorter progression-free survival. The achieved results may serve as a base for data...

A proposal for the spinning reserve assessment and allocation for El Salvador¡¦s Deregulated Electricity Market is formulated. Traditionally, the Independent System Operator calculates the spinning reserve as percentage of the forecast demand. And Automatic Generation Control (AGC) is allocated based on the partition factor. The reserve calculation neither reflects consistency achieving its main objective, reliability, nor is optimum performance control reached by the allocating mechanism. In the proposed method, the spinning reserve is estimated taking into account the generators outage ratio and AGC is allocated based on the North American Electric Reliability Corporation¡¦s Control Performance Standard-1. The allocation problem is solved with an improved Particle Swarm Optimization algorithm with a technique to modify the inertial factor on each iteration. The proposed method exhibits better results and it matches the Salvadorian technical requirements and market characteristics.

[EN] Carbamoyl phosphate synthetase 1 (CPS1), a 1462-residue mitochondrial enzyme, catalyzes the entry of ammonia into the urea cycle, which converts ammonia, the neurotoxic waste product of protein catabolism, into barely toxic urea. The urea cycle inborn error and rare disease CPS1 deficiency (CPS1D) is inherited with mendelian autosomal recessive inheritance, being due to CPS1 gene mutations (>200 mutations reported), and causing life-threatening hyperammonemia. We have produced recombinantly human CPS1 (hCPS1) in a baculovirus/insect cell expression system, isolating the enzyme in active and highly purified form, in massive amounts. This has allowed enzyme crystallization for structural studies by X-ray diffraction (an off-shoot of the present studies). This hCPS1 production system allows site-directed mutagenesis and enzyme characterization as catalyst (activity, kinetics) and as protein (stability, aggregation state, domain composition). We have revealed previously unexplored traits of hCPS1 such as its domain composition, the ability of glycerol to replace the natural and essential CPS1 activator N-acetyl-L-glutamate (NAG), and the hCPS1 protection (chemical chaperoning) by NAG and by its pharmacological analog N-carbamyl-L-glutamate (NCG). We have exploited this system to explore the effects on the activity, kinetic parameters and stability/folding of the enzyme, and to test the disease-causing nature, of mutations identified in patients with CPS1 deficiency (CPS1D). These results, supplemented with those obtained with other non-clinical mutations, have provided novel information on the functions of three non-catalytic domains of CPS1. We have introduced three CPS1D-associated mutations and one trivial polymorphism in the glutaminase-like domain of CPS1, supporting a stabilizing and an activity-enhancing function of this non-catalytic domain. Two mutations introduced into the bicarbonate phosphorylation domain have shed light on bicarbonate binding and have directly confirmed the importance of this domain for NAG binding to the distant (in the sequence) C-terminal CPS1 domain. The introduction of 18 CPS1D-associated missense mutations mapping in a clinically highly eloquent central non-catalytic domain have proven the disease-causing nature of most of these mutations while showing that in most of the cases they trigger enzyme misfolding and/or destabilization. These results, by proving an important role of this domain in the structural integration of the multidomain CPS1 protein, have led us to call this domain the Integrating Domain. Finally, we have examined the effects of eight CPS1D-associated mutations, of one trivial polymorphism and of five non-clinical mutations, all of them mapping in the C-terminal domain of the enzyme where NAG binds, whereas we have re-analyzed prior results with another four clinical and five non-clinical mutations affecting this domain. We have largely confirmed the pathogenic nature of the clinical mutations, predominantly because of decreased activity, in many cases due to hampered NAG binding. A few mutations had substantial negative effects on CPS1 stability/folding. Our analysis reveals that NAG activation begins with a movement of the final part of the ß4-¿4 loop of the NAG site. Transmission of the activating signal to the phosphorylation domains involves helix ¿4 from this domain and is possibly transmitted by the mutually homologous loops 1313-1332 and 778-787 (figures are residue numbers) belonging, respectively, to the carbamate and bicarbonate phosphorylation domains. These two homologous loops are called from here on Signal Transmission Loops. / [ES] La carbamil fosfato sintetasa 1 (CPS1), una enzima mitocondrial, cataliza la entrada del amonio en el ciclo de la urea, que convierte esta neurotoxina derivada del catabolismo de las proteínas en urea, mucho menos tóxica. El déficit de CPS1 (CPS1D) es un error innato del ciclo de la urea, una enfermedad rara autosómica recesiva, que se debe a mutaciones en el gen CPS1 (>200 mutaciones descritas) y que cursa con hiperamonemia. Hemos producido CPS1 humana recombinante (hCPS1) en un sistema de expresión de células de insecto y baculovirus, y la hemos aislado en forma activa, muy pura y en cantidad elevada. Este sistema de producción de hCPS1 permite la realización de mutagénesis dirigida y la caracterización de la enzima como catalizador (actividad, cinética) y como proteína (estabilidad, estado de agregación y composición de dominios). Hemos revelado características de la hCPS1 antes no exploradas como es la composición de dominios, la capacidad que tiene el glicerol para reemplazar al activador natural y esencial de la CPS1, N-acetil-L-glutamato (NAG), y la protección de la hCPS1 por NAG y por su análogo farmacológico N-carbamil-L-glutamato (NCG) (chaperonas químicas). Hemos utilizado este sistema para explorar los efectos en actividad, parámetros cinéticos y estabilidad/plegamiento de la enzima, y para comprobar la naturaleza patogénica de mutaciones identificadas en pacientes con CPS1D. Estos resultados, junto con los obtenidos con otras mutaciones no clínicas, han aportado información novedosa sobre tres de los dominios no catalíticos de CPS1. Las observaciones realizadas tras introducir en el dominio de tipo glutaminasa de la enzima tres mutaciones asociadas a CPS1D y un polimorfismo trivial, apoyan la contribución de este dominio no catalítico a la estabilidad y a aumentar la actividad de la enzima. Dos mutaciones introducidas en el dominio de fosforilación de bicarbonato han arrojado luz sobre el modo de unión del bicarbonato (un sustrato). Los resultados de estas mutaciones también han confirmado la contribución de este dominio para la unión de NAG, cuyo sitio de unión se encuentra en el dominio C-terminal de CPS1, bastante alejado (en la secuencia) del dominio de fosforilación de bicarbonato. Además, hemos introducido 18 mutaciones de cambio de sentido asociadas a CPS1D, las cuales están localizadas en un dominio no catalítico, central y de elevada elocuencia clínica. Estos resultados han demostrado la naturaleza patogénica de estas mutaciones, ya que en la mayoría de los casos estas mutaciones producen un mal plegamiento o/y desestabilización de la enzima. Debido a que estos resultados han puesto de manifiesto el importante papel de este dominio en la integración estructural de la proteína multidominio CPS1, lo hemos llamado Dominio Integrador. Finalmente, hemos examinado los efectos de 8 mutaciones asociadas a CPS1D, de un polimorfismo trivial y de 5 mutaciones no clínicas, todas localizadas en el dominio C-terminal de la enzima, donde se une NAG. Además, hemos reanalizado resultados anteriores con otras 4 mutaciones clínicas y 5 no clínicas afectando a este dominio. Hemos confirmado el carácter patogénico de las mutaciones clínicas, las cuales predominantemente causan una disminución en la actividad enzimática, en muchos casos debida a que la unión de NAG se encuentra obstaculizada. Unas pocas mutaciones mostraron efectos negativos en la estabilidad/plegamiento de CPS1. Nuestros análisis revelan que la activación por el NAG empieza con un movimiento de la parte final del bucle ß4-¿4 del sitio de NAG. La transmisión de la señal activadora a los dominios de fosforilación implica a la hélice ¿4 de este dominio y posiblemente se transmite a través de los bucles homólogos 1313-1332 y 778-787 (numeración de residuos) pertenecientes, respectivamente, a los dominios de fosforilación de carbamato y bicarbonato. Por ello, hemos llamado a ambos bucles Bucles de / [CAT] La carbamil fosfat sintetasa 1 (CPS1), un enzim mitocondrial, catalitza l'entrada d'amoni en el cicle de la urea, que convertix l'amoni, producte neurotòxic del catabolisme de les proteïnes, en urea, una molècula molt poc tòxica. El dèficit de CPS1 (CPS1D) és un error innat del cicle de la urea, una malaltia rara autosòmica recessiva, que es deu a mutacions en el gen CPS1 (>200 mutacions descrites) i que cursa amb hiperamonièmia. Hem produït CPS1 humana recombinant (hCPS1) en un sistema d'expressió de cèl·lules d'insecte i baculovirus, i l'hem aïllada en forma activa, molt pura i en gran quantitat. Això ha permés la cristal·lització de l'enzim per a estudis estructurals amb difracció de raios-X (treball no inclòs en esta tesi Aquest sistema de producció de hCPS1 permet la realització de mutagènesi dirigida i la caracterització de l'enzim com a catalitzador (activitat, cinètica) i com a proteïna (estabilitat, estat d'agregació i composició de dominis). Hem revelat característiques de la hCPS1 no explorades abans com és la composició de dominis, la capacitat que té el glicerol per a reemplaçar l'activador natural i essencial de CPS1, N-acetil-L-glutamat (NAG), i la protecció de la hCPS1 per NAG i pel seu anàleg farmacològic N-carbamil-L-glutamat (NCG) (xaperones químiques) . Hem utilitzat aquest sistema per a explorar els efectes en l'activitat, els paràmetres cinètics i l'estabilitat/plegament de l'enzim, i per a comprovar la naturalesa patogènica de mutacions identificades en pacients amb CPS1D. Aquestos resultats, junt amb els obtinguts amb altres mutacions no clíniques, han aportat informació nova sobre tres dels dominis no catalítics de la CPS1. Les observacions, després d'introduir tres mutacions associades a CPS1D i un polimorfisme trivial en el domini tipus glutaminasa de CPS1, recolzen la contribució d'aquest domini no catalític a l'estabilitat i a l'optimització de l'activitat enzimàtica. Dues mutacions introduïdes en el domini de fosforilació de bicarbonat han esclarit el mode d'unió de bicarbonat. Els resultats d'aquestes mutacions també han confirmat la contribució d'aquest domini per a la unió de NAG, el lloc d'unió de la qual es troba en el domini C-terminal de CPS1, prou allunyat (en la seqüència) del domini de fosforilació de bicarbonat. A més, hem introduït 18 mutacions de canvi de sentit associades a CPS1D, les quals estan localitzades en un domini no catalític, central i d'elevada eloqüència clínica. Aquestos resultats han demostrat la naturalesa patogènica d'aquestes mutacions, ja que, en la majoria dels casos produïxen un mal plegament o/i desestabilització de l'enzim. Pel fet que aquestos resultats han posat de manifest l'important paper d'aquest domini en la integració estructural de la proteïna multidomini CPS1, l'hem anomenat Domini Integrador. Finalment, hem examinat els efectes de huit mutacions associades a CPS1D, un polimorfisme trivial i cinc mutacions no clíniques, totes elles localitzades en el domini C-terminal de l'enzim, on s'unix NAG. A més, hem reanalitzat resultats anteriors amb altres quatre mutacions clíniques i cinc no clíniques que afecten aquest domini. Hem confirmat el caràcter patogènic de les mutacions clíniques, les quals predominantment causen una disminució en l'activitat enzimàtica, en molts casos pel fet que la unió de NAG es troba obstaculitzada. Unes poques mutacions van mostrar efectes negatius substancials en l'estabilitat/plegament de CPS1. Les nostres anàlisis revelen que l'activació de NAG comença amb un moviment de la part final del bucle ß4-¿4 del lloc de NAG. La transmissió del senyal activadora als dominis de fosforilació involucra l'hèlix ¿4 d'aquest domini i es transmet, possiblement, a través dels bucles homòlegs 1313-1332 i 778-787 (numeració dels residus), pertanyents, respectivament, als dominis de fosforilació de carbamato i bicarbonat. Per això, hem anomenat a ambd / Díez Fernández, C. (2015). USING RECOMBINANT HUMAN CARBAMOYL PHOSPHATE SYNTHETASE 1 (CPS1) FOR STUDYING THIS ENZYME'S FUNCTION, REGULATION, PATHOLOGY AND STRUCTURE [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/52855 / TESIS