A ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) é a única enzima capaz de catalisar a reação de ciclização a partir do amido e, assim, formar oligossacarídeos cíclicos conhecidos como ciclodextrinas (CDs). Através desta reação é produzida uma mistura de α-, β- e γ-CD que, respectivamente, contém 6, 7 e 8 resíduos de glicose. As CDs têm atraído enorme atenção devido ao seu grande potencial de aplicação em diversas áreas da indústria. Potencial este proporcionado por sua estrutura cônica, com interior hidrofóbico, capaz de encapsular sólidos, líquidos e gases, conferindo propriedades importantes e protegendo-os. Neste trabalho foi estudada a imobilização de uma CGTase em sílica mesoporosa de forma direcionada às cisteínas presentes em sua superfície, alterando a exposição do sítio ativo. A ligação via cisteínas nativas da proteína aumentou em quatro vezes a eficiência da imobilização, quando comparada a ligação via grupamento amino. Esta, no entanto, apresentou maior atividade enzimática em faixas mais amplas de temperatura e pH, além de maior estabilidade operacional, mantendo 100 % de sua atividade após 200 h de reação contínua a 60 °C e pH 4. Ainda que apresentando menor estabilidade da ligação, o derivado obtido por ligação dissulfeto manteve 40 % da atividade inicial durante 200 h e então, o suporte pôde ser recarregado e reutilizado por igual período. Os suportes desenvolvidos apresentaram estabilidade satisfatória, possibilitando o uso do derivado imobilizado em reator de leito fixo operado de forma contínua. Quando avaliado em relação a produção das três ciclodextrinas principais, o derivado cuja imobilização da enzima ocorreu via grupamento amino, evidenciou a possibilidade de modulação da produção apenas variando as condições de reação. α- e β-CD foram produzidas preferencialmente em pH 8,0 e 2 min (3,44 mg mL-1 e 3,51 mg mL-1, respectivamente), enquanto que pH mais ácido (4,0) e maior tempo de reação (141 min) favoreceram a formação de γ-CD (3,35 mg mL-1), com baixa formação α-CD (0,75 mg mL-1). Por fim, os resultados deste estudo evidenciam a importância da imobilização da CGTase para a estabilização de sua estrutura a fim de aplicá-la em sistemas contínuos de produção de CDs onde é possível modular o perfil dos produtos gerados em função das condições de reação, aumentando assim a produtividade do biocatalisador. / Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) is the only enzyme capable of catalyzing the cyclization reaction from the starch and thus forming cyclic oligosaccharides known as cyclodextrins (CDs). Through this reaction, is produced a mixture of α-, β- and γ-CD containing, 6, 7 and 8 glucose residues respectively. Cyclodextrins (CD) have been attracting considerable attention because of its great potential for application in various areas of industry. This potential is provided by its conical structure with hydrophobic interior, capable of encapsulating solids, liquids and gases, changing important features and protecting them. In this work, the immobilization of CGTase in mesoporous silica was studied in a way directed to cysteines present on its surface, altering the exposure of the active site. The connection via native cysteine of the protein increased by four times the efficiency of immobilization compared to amino groups connection. The binding of amino groups, however, showed greater enzymatic activity in wider ranges of temperature and pH, and higher operational stability, while maintaining 100 % of its activity after 200 h of continuous reaction at 60 °C and pH 4. Although showing less stable connection, the derivative obtained by disulfide bond retained 40 % of the initial activity for 200 h and then, the support could be reloaded and reused for the same period. Developed supports showed satisfactory stability, enabling the use of the derivative assets in a packed bed reactor and operated continuously. It was demonstrated the possibility of modulating the CDs production just varying the reaction conditions, using the derivative of which the enzyme immobilization occurred via amino group, to evaluate the production of three main cyclodextrins. α- and β-CD were produced preferentially at pH 8.0 and 2 min (3.44 mg mL-1 and 3.51 mg mL-1, respectively), whereas the more acid pH (4.0) and longer reaction (141 min) favored the formation of γ-CD (3.35 mg mL-1 and 0.75 mg mL-1 of α-CD). Finally, the results of this study show the importance of the immobilization of CGTase to the stabilization of its structure in order to apply it in continuous CD production systems, where it is possible to modulate the profile of the products generated as a function of the reaction conditions, thus increasing the productivity of the biocatalyst.

A genisteína é uma isoflavona da soja que vem sendo investigada pelo seu potencial antienvelhecimento, baseado nas suas atividades antioxidante, estrogênica e inibidora de proteínas tirosina-quinase. A associação da genisteína com β- ciclodextrina com a formação de um complexo elevou a hidrossolubilidade da isoflavona. A permeabilidade intrínseca da genisteína foi avaliada, bem como sua permeabilidade quando aplicada a partir de gel de hidróxi propilmetilcelulose (HPMC) a 3 %, pelo método de célula de Franz. As associações com β-ciclodextrina, em géis de HPMC 3 %, também foram avaliadas e foi observado um incremento da penetração em favor do complexo produzido em meio aquoso. Devido ao seu alto coeficiente de partição (log P) - 4,36 - a genisteína demonstrou a capacidade de formar reservatórios nas estruturas internas da pele favorecendo sua ação antienvelhecimento na pele. / Genistein is a soy isoflavone that has been investigated for its antiaging potencial, based on antioxidant, estrogenic and proteins tirosin-kinase inhibitor activities. The association of genistein with β-cyclodextrin resulted in a complex formation enhanced the isoflavone hidrosolubity. Genistein instrinsic permeability was evaluated, as well permebility from hydroxypropyl methylcelullose (HPMC) 3 % gel, wtih Franz cell method. The associations with β-cyclodextrin, in HPMC 3 % gels were also evaluated with the observation of na enhancing effect of cyclodextrin in the complex produced in aqueous media. Because its high partition coefficient (log P) - 4,36 - genistein was able to form reservoir in the internal skin layers, favorable to its antiagin action.

Ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) é a enzima capaz de converter o amido e seus açúcares relacionados em ciclodextrinas (CDs) através da reação de ciclização. As CDs têm inúmeras aplicações na indústria farmacêutica, cosmética e de alimentos, devido à sua capacidade de encapsular moléculas hidrofóbicas dentro de sua cavidade. A CGTase de Thermoanaerobacter sp. é capaz de converter o amido em CDs sob condições de processo industrial, em temperaturas elevadas. A produção de CDs em escala industrial é feita, geralmente, em processos de batelada, nos quais é utilizada a enzima livre diretamente. No entanto, a imobilização da CGTase tem sido testada, com o propósito de permitir seu uso contínua e repetidamente, de modo a prevenir sua solubilização e promover uma forma molecular mais estável. Neste trabalho, buscouse imobilizá-la em microesferas de sílica-polietilenoglicol (sílica-PEG). O suporte foi silanizado com 3- aminopropiltrimetoxisilano (APTMS) e ativado com glutaraldeído para gerar condições de imobilização de enzimas, que foi realizada a 6ºC e pH 6, durante 15h. O rendimento de imobilização e a atividade recuperada foram 83% e 73%, respectivamente. Os resultados foram comparados com estudos anteriores sobre a imobilização covalente de CGTase. As propriedades enzimáticas da CGTase imobilizada foram investigadas e comparadas com as da enzima solúvel. CGTases solúveis e imobilizadas apresentaram valores similares de pH ótimo. Por outro lado, a temperatura ótima foi de 100ºC e 80ºC para as formas solúvel e imobilizada da enzima, respectivamente. Em comparação com a CGTase solúvel, a forma imobilizada apresentou maior Km (constante de Michaelis), menor Vmax (velocidade máxima de reação), a estabilidade de armazenamento diminuiu cerca de 15% e apenas um ligeiro decréscimo foi observado quando a estabilidade térmica estava sob avaliação. A estabilidade operacional foi medida em repetidos processos de batelada e a enzima imobilizada reteve cerca de 60% da atividade catalítica inicial, após 15 ciclos. / Cyclodextrin glicosyltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) is the enzyme able to convert starch and related sugars into cyclodextrins (CDs) via cyclization reaction. Cyclodextrins have numerous applications in the pharmaceutical, cosmetics, and food industry, because of their capacity to encapsulate hydrophobic molecules within their cavity. The CGTase from the Thermoanaerobacter sp. is able to degrade starch into CDs under industrial conditions (high temperature). For the industrial scale production of CDs, conventional batch production methods, which utilize soluble CGTase directly, have been mainly adopted. However the immobilization of CGTase has been pursued with the purpose of allow its reuse continuously and repeatedly by avoiding enzyme solubilization and promoting a more stable molecule form. In this research, Thermoanaerobacter CGTase was immobilized on silica-polyethyleneglycol (silica-PEG) microspheres. The support was silanized with 3- aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) and activated with glutaraldehyde to generate conditions for enzyme immobilization, which was carried out at 6ºC and pH 6, during 15h. The immobilization yield and recovery activity was around 83% and 73%, respectively. Results were compared with previous studies on covalent immobilization of CGTase. The enzymatic properties of immobilized CGTase were investigated and compared with those of the soluble enzyme. Soluble and immobilized CGTases showed similar values for optimum pH. On the other hand, the optimum temperature was 100ºC and 80ºC for the soluble and immobilized forms, respectively. In comparison with the soluble CGTase, the immobilized form exhibited higher Km (Michaelis constant), lower Vmax (maximal reaction rate), the storage stability was decreased about 15% and just a slight decrease was observed when thermal stability was under evaluation. The operational stability was evaluated in repeated batch process and the immobilized enzyme retained about 60% of the initial catalytic activity after 15 cycles.

O coumestrol, isoflavonóide presente na alfafa (Medicago sativa L., Fabaceae), é um potente agente antioxidante e estrogênico, podendo ser empregado para fins de prevenção do envelhecimento cutâneo, bem como na reposição hormonal para mulheres pós-menopausa. A sua baixa hidrossolubilidade motivou a investigação de sua associação, em mistura física ou complexado, à b-ciclodextrina (1:1). A presente pesquisa desenvolveu e validou dois métodos analíticos (UV e CLAE) para a quantificação do coumestrol e de suas associações. A caracterização da interação entre o coumestrol e a b-ciclodextrina foi realizada por MEV, DSC, IV, RMN e modelagem molecular. Visando a sua aplicação tópica, foram realizados ensaios de permeação cutânea em pele de orelha de suínos, em células de difusão tipo Franz, de maneira intrínseca e em matriz de gel HPMC F4M. As análises de caracterização da interação indicaram a existência de complexo de inclusão tanto na mistura física como no complexo, mostrando a possibilidade de inclusão do anel A ou B do coumestrol na cavidade da b-ciclodextrina. A inclusão do anel B do coumestrol na extremidade das hidroxilas secundárias da b-ciclodextrina (borda mais larga) mostrou-se favorecida, uma vez que apresentou a menor energia. Na permeação intrínseca, a mistura física apresentou maior quantidade permeada em 8 horas (22,6 μg/cm2) e maior fluxo (3,3 μg/cm2/h) do que o coumestrol ou o complexo coumestrol:b-ciclodextrina. Já a partir do gel, o complexo coumestrol:b-ciclodextrina apresentou a maior quantia permeada (2,7 μg/cm2), bem como o maior tempo de latência que os demais. O coumestrol complexado mostrou maior solubilidade e apresentou razoável permeabilidade cutânea na forma de gel, mostrando-se promissor para aplicação tópica em pele. / Coumestrol, isoflavonoid present in alfalfa (Medicago sativa L, Fabaceae), is a potent antioxidant and estrogenic agent, which could be employed for the cutaneous aging prevention, as well as, in hormonal replacement for pos-menopausal women. Its low solubility in water gave rise to its association investigation, in physical mixture or complexed with b- cyclodextrin (1:1). The present research developed and validated two analytical methods (UV and HPLC) for the quantification of coumestrol and its associations. The characterization of the interaction between coumestrol and b-cyclodextrin was accomplished by SEM, DSC, IR, NMR and molecular modelling. Seeking the topical application, cutaneous permeation assays were accomplished in swine ear skin, in Franz type diffusion cells, in an intrinsic way and in a gel matrix of HPMC F4M. The characterization analyses indicated the existence of an inclusion compound, as much in the physical mixture as in the complex, showing the inclusion possibility of the A or B rings of coumestrol enter in the cavity of b-cyclodextrin. The inclusion of the B ring of coumestrol in the wider rim of b-cyclodextrin showed to be favorable, due to its lower energy. In the intrinsic permeation, the physical mixture presented larger amount permeated in 8 hours of study (22,6 μg/cm2) and larger flow (3,3 μg/cm2/h) than that of coumestrol or its coumestrol:b-cyclodextrin complex. With respect to the gel permeation, the complex coumestrol:b-cyclodextrin presented the higher permeation amount (2,7 μg/cm2), as well as the largest lag-time than the others. Coumestrol showed higher solubility when complexated with b-cyclodextrin and it presented reasonable cutaneous permeability in the gel form, being promising to topical application in skin.

Objetivos: Avaliar a farmacocinética e a distribuição tecidual do benzaldeído semicarbazona livre (BS) e incluso em ß-Ciclodextrinas (BS/ß-CD) após administração de diversas doses por diferentes vias de administração. Metodologia: As concentrações plasmáticas de BS foram quantificadas através de método analítico por CLAE-UV desenvolvido e validado, após administração das doses de 10 mg/kg i.v. bolus e 50 e 100 mg/kg p.o. da droga livre e 10 mg/kg i.v. bolus e 50 mg/kg p.o. da droga complexada a ratos Wistar (n = 8 animais/grupo). Os perfis plasmáticos foram avaliados individualmente pelas abordagens não-compartimental e compartimental para determinação dos parâmetros farmacocinéticos. A avaliação compartimental foi realizada utilizando software Scientist 2.0.1 (Micromath®). A ligação do BS a proteínas plasmáticas foi determinada por ultrafiltração na faixa de 1,0 a 60,0 µg/mL. O perfil de penetração tecidual da droga livre e complexada foi investigado em diferentes órgãos utilizando o método de homogeneizado de tecido até 5 h após administração de dose 10 mg/kg i.v. A penetração cerebral também foi avaliada para a droga livre e inclusa em ß-CD após a dose de 50 mg/kg até 4 h após administração (n = 3 animais/tempo coleta). Resultados e Discussão: A fração livre do BS em plasma de ratos foi de 34 ± 5%. O modelo de um compartimento descreveu adequadamente todos os perfis plasmáticos estudados. Após doses intravenosa (10 mg/kg) e oral (50 mg/kg), parâmetros farmacocinéticos como Vd (1,6 ± 0,5 e 2,2 ± 0,8 L/kg, respectivamente) e Cltot (1,4 ± 0,5 and 1,8 ± 0,5 L/h×kg, respectivamente) foram maiores para o BS complexado em relação à droga livre, embora os t1/2 (0,8 ± 0,1 h-1) mantiveram-se similares (p < 0,05). A biodisponibilidade oral do BS/ß-CD (~37%) foi aproximadamente o dobro daquela observada para a droga livre (~20%). O fator de penetração cerebral após doses intravenosa (2,8) e oral (2,5), assim como tempo de residência médio, foram maiores para a droga complexada, independente da via de administração avaliada. Conclusões: A farmacocinética do BS livre e complexado mostra uma rápida distribuição tecidual e uma rápida eliminação. A maior penetração cerebral do complexo em relação à droga livre mostra que a ß-CD é uma estrutura capaz de vetorizar, reter e modificar a liberação do BS nesse órgão, explicando os achados farmacodinâmicos prévios. / Purpose: This study aimed to investigate the pharmacokinetics and tissue distribution of benzaldehyde semicarbazone (BS) free and complexed with ß- cyclodextrin (BS/ß-CD) after administration to rodents at different doses by diverse routes. Methodology: BS plasma concentrations were determinated in Wistar rats after administration of 10 mg/kg i.v bolus and 50 and 100 mg/kg p.o. for the free drug and 10 mg/kg i.v. bolus and 50 mg/kg for the BS/ß-CD (n = 8/group), using a HPLCUV method specifically developed and validated. Individual plasma profiles obtained were evaluated by non-compartmental and compartmental approaches, using the software Scientist 2.0.1 (MicroMath®), analysis to determine the pharmacokinetic parameters. BS protein binding was determined by ultrafiltration at a concentration range of 1.0 a 60.0 µg/mL. BS tissue penetration after free or ß-CD-complexed drug administration was investigated in different tissues homogenates up to 5 h after i.v. bolus dosing of 10 mg/kg dose. Brain penetration of the free and complexed drug was also evaluated up to 4 h after administration of 50 mg/kg p.o. dose (3 animals/time point). Results and Discussion: BS free fraction in plasma was 34 ± 5%. The one-compartmental model described adequately the plasma profiles of all groups investigated. After i.v. (10 mg/kg) and p.o. (50 mg/kg) doses, pharmacokinetic parameters such as Vd (1.6 ± 0.5 e 2.2 ± 0.8 L/kg, respectively) and CLtot (1.4 ± 0.5 and 1.8 ± 0.5 L/h×kg, respectively) were higher for the BS/ß-CD than for the free drug, although the t1/2 (0.8 ± 0.1 h-1) remained the same (p < 0.05). The oral bioavailability of the BS/ß-CD (~ 37%) was approximately 2-fold of that observed for the free BS (~ 20%). The brain penetration factor after i.v. (2.8) and p.o. (2.5) doses, as well as the mean residence time, were higher after BS/ß-CD dosing than after free drug dosing, regardless of the route administrated. Conclusions: BS pharmacokinetics (free and complexed) showed a fast tissue distribution and elimination. The higher brain penetration of the drug after the administration of the complex reveals that the ß-CD may be a potential system to carrier, retain and change the delivery of BS in this organ, explaining the previous pharmacodynamic results.

A ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) é a única enzima capaz de catalisar a reação de ciclização a partir do amido e, assim, formar oligossacarídeos cíclicos conhecidos como ciclodextrinas (CDs). Através desta reação é produzida uma mistura de α-, β- e γ-CD que, respectivamente, contém 6, 7 e 8 resíduos de glicose. As CDs têm atraído enorme atenção devido ao seu grande potencial de aplicação em diversas áreas da indústria. Potencial este proporcionado por sua estrutura cônica, com interior hidrofóbico, capaz de encapsular sólidos, líquidos e gases, conferindo propriedades importantes e protegendo-os. Neste trabalho foi estudada a imobilização de uma CGTase em sílica mesoporosa de forma direcionada às cisteínas presentes em sua superfície, alterando a exposição do sítio ativo. A ligação via cisteínas nativas da proteína aumentou em quatro vezes a eficiência da imobilização, quando comparada a ligação via grupamento amino. Esta, no entanto, apresentou maior atividade enzimática em faixas mais amplas de temperatura e pH, além de maior estabilidade operacional, mantendo 100 % de sua atividade após 200 h de reação contínua a 60 °C e pH 4. Ainda que apresentando menor estabilidade da ligação, o derivado obtido por ligação dissulfeto manteve 40 % da atividade inicial durante 200 h e então, o suporte pôde ser recarregado e reutilizado por igual período. Os suportes desenvolvidos apresentaram estabilidade satisfatória, possibilitando o uso do derivado imobilizado em reator de leito fixo operado de forma contínua. Quando avaliado em relação a produção das três ciclodextrinas principais, o derivado cuja imobilização da enzima ocorreu via grupamento amino, evidenciou a possibilidade de modulação da produção apenas variando as condições de reação. α- e β-CD foram produzidas preferencialmente em pH 8,0 e 2 min (3,44 mg mL-1 e 3,51 mg mL-1, respectivamente), enquanto que pH mais ácido (4,0) e maior tempo de reação (141 min) favoreceram a formação de γ-CD (3,35 mg mL-1), com baixa formação α-CD (0,75 mg mL-1). Por fim, os resultados deste estudo evidenciam a importância da imobilização da CGTase para a estabilização de sua estrutura a fim de aplicá-la em sistemas contínuos de produção de CDs onde é possível modular o perfil dos produtos gerados em função das condições de reação, aumentando assim a produtividade do biocatalisador. / Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) is the only enzyme capable of catalyzing the cyclization reaction from the starch and thus forming cyclic oligosaccharides known as cyclodextrins (CDs). Through this reaction, is produced a mixture of α-, β- and γ-CD containing, 6, 7 and 8 glucose residues respectively. Cyclodextrins (CD) have been attracting considerable attention because of its great potential for application in various areas of industry. This potential is provided by its conical structure with hydrophobic interior, capable of encapsulating solids, liquids and gases, changing important features and protecting them. In this work, the immobilization of CGTase in mesoporous silica was studied in a way directed to cysteines present on its surface, altering the exposure of the active site. The connection via native cysteine of the protein increased by four times the efficiency of immobilization compared to amino groups connection. The binding of amino groups, however, showed greater enzymatic activity in wider ranges of temperature and pH, and higher operational stability, while maintaining 100 % of its activity after 200 h of continuous reaction at 60 °C and pH 4. Although showing less stable connection, the derivative obtained by disulfide bond retained 40 % of the initial activity for 200 h and then, the support could be reloaded and reused for the same period. Developed supports showed satisfactory stability, enabling the use of the derivative assets in a packed bed reactor and operated continuously. It was demonstrated the possibility of modulating the CDs production just varying the reaction conditions, using the derivative of which the enzyme immobilization occurred via amino group, to evaluate the production of three main cyclodextrins. α- and β-CD were produced preferentially at pH 8.0 and 2 min (3.44 mg mL-1 and 3.51 mg mL-1, respectively), whereas the more acid pH (4.0) and longer reaction (141 min) favored the formation of γ-CD (3.35 mg mL-1 and 0.75 mg mL-1 of α-CD). Finally, the results of this study show the importance of the immobilization of CGTase to the stabilization of its structure in order to apply it in continuous CD production systems, where it is possible to modulate the profile of the products generated as a function of the reaction conditions, thus increasing the productivity of the biocatalyst.

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:34:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_4971_Dissertação_Nahun Thiagor.pdf: 1844062 bytes, checksum: 8e3e54f1750887fb5387ffffb0103629 (MD5) Previous issue date: 2011-08-16 / No presente estudo é estabelecida uma correlação entre alguns tensoativos, um derivado de ciclodextrina, oligossacarídeo cíclicos originado da ação da ciclodextrina glicosiltransferase, a β-ciclodextrina metilada e as linhagens de câncer de ovário A 2780 e OVCAR 3, tentando abrir a possibilidade de utilização da ciclodextrina associada a medicamentos quimioterápicos padronizados à terapia contra o câncer de ovário, que é apontado como uma das principais causas de óbito entre as malignidades ginecológicas. O câncer de ovário apresenta alta taxa de mortalida, além de possuir vários subtipos histo-clínicos, a cada ano aumenta cada vez mais o número de pacientes diagnosticadas, assim, é indispensável à continuidade das pesquisas científicas relacionadas a este tipo de câncer, visto que os conhecimentos até então elaborados são de extrema significância, porém insuficientes para que seja estabelecida uma cura. Através da viabilidade celular pelo método do MTT, onde se utiliza o sal de tetrazol para expressar de forma quantitativa a proliferação e sobrevivência das células e o método de BRADFORD, para normalização de dados, tenta-se estabelecer a influência de alguns tensoativos e do derivado de ciclodextrina sobre e entre as linhagens de câncer de ovário. A metil-β-ciclodextrina e os tensoativos SDS, TX100 E TW20 induziram uma redução da atividade mitocondrial dose-dependente em cultura de células de câncer de ovário da linhagem A 2780 e OVCAR 3. O derivado de ciclodextrina demonstrou indução gradativa da redução da atividade mitocondrial para duas das oito concentrações testadas (0,2% e 0,4%) com viabilidade celular próxima a 60% na linhagem A 2780. Na linhagem OVCAR 3 a metil-β-ciclodextrina apresenta potencial citotóxico capaz de inviabilizar 25% do crescimento celular em concentrações superiores a 0,003125%, a viabilidade celular perante as mesmas condições de tratamento é menor nesta linhagem quando comparada a linhagem A 2780. Devido às propriedades da ciclodextrinas os resultados das análises comparativas de viabilidade celular, nas linhagens de câncer de ovário, estes resultados apontam para possibilidades maiores em futuros estudos, podendo a pesquisa aqui apresentada ser tomada como referência. / This study sets up a correlation between some surfactants, a derivate of cyclodextrin, cyclic oligosaccharide originated from the action of the glycosyltransferase cyclodextrin, a methyllated β-cyclodextrin and the lines of ovarian cancer A 2780 and OVCAR 3, trying to offering the possibility of using cyclodextrin associated with standard chemotherapy drugs in therapy against ovarian cancer, which is pointed as one of the main causes of death among gynecological ills. Ovarian cancer is connected with high mortality rate and has several histo-clinical subtypes, raising the number of patient diagnosed each year, therefore there are the needy of continuing the scientific research which this kind of cancer is related, once the knowledge developed so far are extremely significant, yet it still is insufficient to generate a cure. Through the cellular viability by MTT method, which uses salt of tetrazol to express quantitatively the proliferation and survival of cells, and Bradford method for standardization data, it attempts to establish the influence of surfactants and some of the derivate of cyclodextrin on and between the lines of ovarian cancer. The methyl-β-cyclodextrin and the surfactant SDS, TX100 and TW20 induced a reduction in dose-dependent mitochondrial activity in cell cultures of ovarian cancer line A 2780 and OVCAR 3. The cyclodextrin derivate has demonstrated induction of gradual reduction of the mitochondrial activity of two from eight concentrations tested (0,2% and 0,4%) with cell viability of approximately 60% in strain A 2780. In the line OVCAR 3 the methyl-β-cyclodextrin shows potential cytotoxic able to tamper 25% of cell growth in conditions of treatment is reduced in this strain when compared with strain A 2780. Due to the properties of cyclodextrins, results of comparative analyzes of cell viability, in the strains of ovarian cancer, indicates to greater possibilities in future studies, enabling the research presented here as a reference.

Orientadora: Profa. Dra. Daniele Ribeiro de Araujo / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2015. / It is expected the improvement of BUD physicochemical properties through complexation with CD and the incorporation of BUD:HP-â-CD inclusion complex into PL-based hydrogels, contributing to a longer duration of anti-inflammatory effect associated with high bioadhesion in the treatment of ulcerative colitis. In this work, we propose the study of the system BUD:HP-â-CD inclusion complex incorporated into PL407 and PL407-PL403, since the micelles assembling to the thermoreversible hydrogels considering structural and thermodynamics parameters related to inclusion complex formation, micellization and sol-gel transition phase, as well as the interaction between BUD:HP-â-CD complex and PL. Complexation between BUD and HP-â-CD was confirmed by phase solubility studies (1:1 stoichiometry, Kc = 8662.8 M-1), DSC and microscopy analyzes. BUD solubility on upper and lower simulated colon fluids was improved in a dependence of both carriers association (HP-â-CD and PL407 or PL407-PL403). Micellar hydrodynamic diameter determination showed the interaction between HP-â-CD and PL blocks, as well as the reorganization of the micellar system in the presence of BUD. Micellization temperature (Tm) was not shifted, but in the presence of BUD or HP-â-CD, an increase on ÄH° values was observed for all formulations. Sol-gel phase transition studies showed that in the presence of BUD, HP-â-CD or BUD:HP-â-CD complex, the association PL407-PL403 favored the gel formation close to the physiological temperature. 1H-NMR studies revealed the interaction between PL407 and HP-â-CD and FTIR confirmed the effective incorporation of the drug and the inclusion complex in PL system. The in vitro drug release was sustained and the release rate was slowed by the addition of inclusion complex (under 38% of the BUD released after 2 days), suggesting a prolonged anti-inflammatory effect. Drug release of PL407 was best explained by Higuchi and Korsmeyer-Peppas (n < 0.5), indicating the Fickian diffusion mechanism. In the binary system with inclusion complex, drug release follows Hixson-Crowell cube root law, specially in lower colon fluid, indicating the erosion of polymer matrix as a mechanism that influences the BUD release profile. Sol/gel phase transition, solubility, turbidity, FTIR and in vitro release tests revealed no competitive displacement of BUD from the hydrophobic HP-â-CD cavity evoked by PL407 or PL407-PL403 addition. These promising findings point out the BUD-HP-â-CD in 20 % or 18/2 PL-based hydrogels as strategies for future in vivo investigations and also the development of new pharmaceutical formulations looking forward the treatment of ulcerative colitis. / O presente trabalho propoe a otimizacao das propriedades fisico-quimicas do glicocorticosteroide budesonida (BUD) para o tratamento da colite ulcerativa (COL), por meio da complexacao com ciclodextrinas (CD), bem como a incorporacao do complexo de inclusao farmaco:CD em hidrogeis a base de Poloxamer (PL), contribuindo para uma maior duracao do efeito antiinflamatorio associado a permanencia no local de aplicacao. Desta forma, para o complexo de inclusao BUD:HP-¿À-CD, como tambem para os hidrogeis termorreversiveis de PL407 e de PL407/PL403, foram realizados diferentes ensaios de caracterizacao fisico-quimica, abrangendo desde uma analise estrutural e morfologica ate ensaios de liberacao in vitro. A complexacao entre BUD e HP-¿À-CD foi confirmada por meio dos ensaios de solubilidade de fase (estequiometria 1:1), Calorimetria Diferencial Exploratoria (DSC), Microscopia Eleronica de Varredura (MEV), Ressonancia Magnetica Nuclear (RMN) e Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR), destacando a elevada afinidades entre a molecula do farmaco e a cavidade hidrofobica da HP- ¿À-CD (Kc = 8.662,8 M-1). A solubilidade da BUD em fluidos simulados do colon superior (FSCS) e inferior (FSCI) foi melhorada de forma dependente a ambos os carreadores (HP-¿À- CD e PL), sugerindo o efeito aditivo dos sistemas polimericos na solubilizacao do farmaco. Na presenca de BUD ou de BUD:HP-¿À-CD, a associacao PL407/PL403 favoreceu a formacao da estrutura gel proximo a temperatura fisiologica, otimizando a viscosidade da formulacao em relacao a forma comercial (enema). A analise termodinamica mostrou ocorrencia de um processo endotermico espontaneo, embora tenha sido observado um aumento nos valores de AH¿ para todas as formulacoes. Estudos de RMN-H1 revelaram a interacao entre PL407 e HP-¿À-CD, nao sendo o mesmo identificado para o PL403. Os resultados de FTIR comprovaram a efetiva incorporacao do farmaco e do complexo de inclusao nos sistemas PL, que sofreram uma desorganizacao na cadeia polimerica e a formacao de um novo arranjo como consequencia da interacao entre os aditivos e o PL. Ensaios de liberacao in vitro atestaram a efetividade dos sistemas polimericos associados ao complexo de inclusao BUD:HP-¿À-CD, diminuindo significativamente o fluxo e prolongando a liberacao, que alcancou menos de 38% de farmaco liberado apos 2 dias de experimentacao, nas formulacoes 18/2% PL407/PL403 e 20% PL407. O perfil cinetico dos sistemas isolados de PL407 foi melhor descrito por Higuchi e Korsmeyer-Peppas, com expoente de liberacao inferior a 0,5, indicando a difusao Fickiana como mecanismo predominante. A incorporacao do complexo de inclusao no sistema binario conferiu ao perfil de liberacao uma aderencia ao modelo de Hixson-Crowell, indicando a erosao da matriz polimerica como mecanismo que influencia a liberacao do farmaco. Esses resultados promissores atestam a efetividade dos sistemas hibridos propostos no presente trabalho, apontando o complexo de inclusao BUD:HP-¿À-CD em hidrogeis de 20% PL e 18/2% PL407/PL403 como estrategia para investigacoes futuras in vivo, visando otimizar o tratamento da COL.

A ciclodextrina glicosiltransferase (EC 2.4.1.19) é a única enzima capaz de converter amido e açúcares relacionados em ciclodextrinas através de reação de ciclização. Estes compostos podem formar complexos de inclusão com moléculas hidrofóbicas, tornando-se importante para aplicação nas indústrias alimentícias, farmacêuticas, agrícolas, químicas e de cosméticos. Um novo microorganismo produtor de CGTase foi encontrado entre bactérias isoladas do solo e foi identificado como Stenotrophomonas maltophilia. A enzima produzida por este microrganismo foi purificada em quatro etapas: precipitação por afinidade com amido, ultrafiltração, cromatografia de troca iônica e cromatografia de interação hidrofóbica. A CGTase assim purificada obteve, aproximadamente, atividade específica de 200.000 U/mg e fator de purificação de 2500. Com uma única banda, o peso molecular da enzima purificada foi estimado em 70kDa por SDS-PAGE. A temperatura ótima para atividade da enzima foi de 60 º C, enquanto que a atividade enzimática permaneceu praticamente estável entre pH 6 e 10, indicando natureza alcalotolerante. Km e Vmax para a enzima pura foram de 2,5 g/mL e 12,5 U/mg de proteína, respectivamente, usando amido solúvel como substrato. / Cyclodextrin glycosyltransferase (EC 2.4.1.19) is the unique enzyme able to convert starch and related sugars into cyclodextrins via cyclization reaction. These compounds can form inclusion complexes with hydrophobic molecules, becoming important for application in the food, pharmaceutical, agricultural, chemical and cosmetics industries. A new microorganism producing the CGTase was found among strains isolated from soil and identified as Stenotrophomonas maltophilia. The enzyme produced by this strain was purified by four steps: starch affinity precipitation, ultrafiltration, ion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography. The CGTase thus obtaining specific activity 200,000 U.mg-1 and 2500-fold purification. With a single band, the molecular weight of the purified enzyme was estimated in 70kDa by SDS-PAGE. The optimum temperature for enzyme activity was 60ºC, whereas the enzyme activity remained almost stable between pH 6 to 10, indicating its alkalotolerant nature. Km e Vmax for the pure enzyme were 2.5 g/mL and 12.5 U/mg protein, respectively, using soluble starch as substrate.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6472.pdf: 2357652 bytes, checksum: b48a2e541ddf343b775996e49d4e7f1f (MD5) Previous issue date: 2014-03-31 / Financiadora de Estudos e Projetos / Cyclodextrins (CDs) are cyclic oligosaccharides that show the ability to encapsulate a large number of organic molecules at the molecular level. Thus, they have large application in pharmaceutical, food, and cosmetics industries. CDs may have different sizes; however the most common are formed by 6, 7, and 8 glucose units, called &#945;, &#946; and &#947;-CD, respectively. These compounds are produced from starch by hydrolysis catalyzed by cyclodextrin glycosyltransferase ( CGTase - EC 2.4.1.19 ) enzyme. CGTase is commonly produced from bacteria of the genus Bacillus and Klebsiella pneumoniae. Due to the commercial importance of this enzyme and of the microorganisms producing CGTase whose enzyme is capable to produce only one CD, this work aimed to evaluate the CGTase production by the bacterium Paenibacillus sp. F37. The experiments aimed to assess the potential for enzyme production by Paenibacillus sp. F37 strain and also the characterization and classification of the enzyme. Analysis of enzymatic activity was accomplished by cyclization activity of the supernatant of the culture medium, which was monitored by the production rate of &#946;-CD at 50°C, pH 8.0 using a solution of dextrin as substrate. Initially it was evaluated the effect of the pH (6.0 to 10.0) over the microorganism growth into solid Horikoshi medium without starch. It was observed that the microorganism grew better at pH 8.0, being this pH adopted for assays using liquid Horikoshi medium without starch. In this step it was established the following conditions to the bacterium growth: 10h, 37oC, and agitation of 120 rpm in an incubator. The CGTase production step was performed into Horikoshi medium containing 1% (m/v) soluble starch (enzyme inducer), and pH and production time were evaluated. Under standard conditions (37oC, 120 rpm, 16h, and culture medium prepared in 0.1 M tris-HCl buffer pH 9.0) the volumetric activity from the culture medium achieved about 800 U/L, corresponding to a productivity of 50 U/L.h-1. The characterization of the crude enzyme showed that the CGTase from Paenibacillus sp. F37 strain has maximum cyclization activity around 50oC and pH 6.0. Under these conditions the enzyme showed to have a half-life time around 2 h. At the growth conditions (37oC, pH 9.0), the enzyme show to have a half-life time around 3h, being almost inactivated around 5h. Thus, the enzyme production in a medium where pH starts at 9.0 and is decreased to around 6.0 during the growth showed to be a good strategy to prevent denaturation of the enzyme. The CD production into batch reactor and their characterization by colorimetric and chromatographic methods allowed classifying the enzyme as a &#946;-CGTase (ratio &#945;-:&#946;-:&#947;-CD of 0:1:0.26). At the CD-production conditions (50oC, pH 8.0, 50 g/L of dextrin, 1.6 U/g of dextrin, and 92 h) it was achieved &#946;-CD productivity around 100 mg/L.h. These results showed that Paenibacillus sp. F37 strain is a promising microorganism for producing CGTase. / Ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos de grande importância comercial e que apresentam amplo emprego industrial nos setores farmacêutico, alimentício, de cosmético, dentre outros, por terem a capacidade de encapsulamento ao nível molecular de um grande número de moléculas orgânicas. CDs podem apresentar diversos tamanhos, sendo as que têm 6, 7 ou 8 unidades de glicose, denominadas &#945;, &#946; e &#947;-CD, respectivamente, são as mais conhecidas. Estas são obtidas a partir da hidrólise do amido pela ação da enzima ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase EC 2.4.1.19). A CGTase geralmente é produzida por bactérias do gênero Bacillus e Klebsiella pneumoniae. Levando em consideração a importância comercial desta enzima e a busca por microrganismos produtores de CGTase que produzam predominantemente uma CD de interesse, esse trabalho buscou avaliar a produção de CGTase a partir de Paenibacillus sp. F37. Os experimentos tiveram como objetivo a avaliação do potencial de produção da enzima por esse microrganismo, bem como a caracterização e a classificação da enzima. A análise de atividade enzimática foi realizada pela atividade de ciclização do sobrenadante do meio de cultivo, que foi monitorada pela taxa de produção de &#946;&#8722;CD a 50°C, pH 8,0, usando uma solução de dextrina como substrato. Avaliou-se inicialmente a influência do pH (6,0 a 10,0) no crescimento do microrganismo em meio Horikoshi sólido, sem amido. Observou-se melhor crescimento em pH 8,0, definindo-se esse valor para ensaios de crescimento em meio Horikoshi líquido, sem amido. Nessa etapa definiram-se as condições de crescimento como 10 h, 37ºC e agitação de 120 rpm em câmara incubadora. A etapa de produção da CGTase foi realizada em meio Horikoshi com amido solúvel 1%, m/v (indutor da enzima), avaliando-se pH e tempo de cultivo. Sob condições padronizadas (37ºC, 120 rpm, 16 h e meio de produção preparado em tampão tris-HCl 0,1 M, pH 9,0) atingiu-se uma atividade volumétrica no meio de produção da ordem de 800 U/L, correspondendo a uma produtividade de aproximadamente 50 U/L.h-1. A caracterização da enzima bruta mostrou que a CGTase de Paenibacillus sp. F37 apresenta atividade máxima de ciclização em 50ºC, pH 6,0. Nessas condições a enzima apresentou meia-vida aproximada de 2 h. Nas condições de cultivo (37ºC, pH 9,0), a enzima apresentou baixa estabilidade, com meia-vida em torno de 3 h, sendo praticamente inativada em 5 h. Por isso, produzir a enzima em meio cujo pH inicial é 9,0 e esse reduz-se ao longo do cultivo para em torno de 6,0, mostrou-se uma boa estratégia para prevenir a desnaturação da enzima. A produção de CDs em reator batelada e a sua caracterização colorimétrica e por CLAE permitiram a classificação da enzima como uma &#946;-CGTase (razão &#945;-:&#946;-:&#947;-CD de 0:1:0,26). Nas condições de produção de CDs (50ºC, pH 8,0, 50 g/L de dextrina, 1,6 U/g de dextrina e 92 h) atingiu-se uma produtividade de &#946;-CD da ordem de 100 mg/L.h. Os resultados indicam, portanto, que Paenibacillus sp. F37 é um microrganismo promissor na produção de CGTase.