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Yes / The duocarmycins belong to a class of agent which has great potential for use in cancer therapy. Their exquisite potency means they are too toxic for systemic use, and targeted approaches are required to unlock their clinical potential. In this study, we have explored seco-OH-chloromethylindoline (CI) duocarmycin-based bioprecursors for their potential for cytochrome P450 (CYP)-mediated cancer cell kill. We report on synthetic and biological explorations of racemic seco-CI-MI, where MI is a 5-methoxy indole motif, and dehydroxylated analogues. We show up to a 10-fold bioactivation of de-OH CI-MI and a fluoro bioprecursor analogue in CYP1A1-transfected cells. Using CYP bactosomes, we also demonstrate that CYP1A2 but not CYP1B1 or CYP3A4 has propensity for potentiating these compounds, indicating preference for CYP1A bioactivation.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2017-2018 / Les stéroïdes et leurs dérivés constituent une classe biologique unique intervenant dans un grand nombre de processus physiologiques. Ces composés suscitent un fort intérêt thérapeutique, notamment parce qu'ils jouent un rôle crucial dans le développement des cancers hormono-dépendants tels que les cancers du sein et de la prostate. L'approche thérapeutique la plus utilisée consiste ainsi à développer des dérivés stéroïdiens qui vont agir en tant qu'inhibiteurs de certaines enzymes de la stéroïdogénèse, et ce, afin de bloquer la production des androgènes ou des estrogènes selon l'effet souhaité. Néanmoins, l'activité des dérivés stéroïdiens est versatile et ces composés peuvent aussi présenter d'autres intérêts thérapeutiques en agissant sur des cibles biologiques très distinctes. La première partie de ce mémoire est consacrée au développement d’une chimiothèque d’aminostéroïdes similaires au RM-581 (noyau C18-stéroïdien), un analogue du RM-133 (noyau C19-stéroïdien) qui a montré une activité cytotoxique sur une large variété de lignées cellulaires issues de différents cancers. La synthèse sur support solide a été utilisée pour le développement de ces analogues du RM-581. Quarante aminostéroïdes avec différentes chaînes latérales amino-substituées en position C2 du noyau estrane ont ainsi été obtenus. Une activité cytotoxique significative a été observée pour les mêmes composés indépendamment des lignées cancéreuses testées. Un composé a par ailleurs montré une activité anticancéreuse deux fois supérieure à celle du RM-581 et pourrait être un candidat prometteur pour le traitement de plusieurs cancers, dont le cancer du pancréas. La deuxième partie de ce mémoire porte sur le développement d'inhibiteurs de la CYP1B1, une enzyme ayant un rôle mutagène important dans le cadre de certains cancers. À partir d’inhibiteurs connus de cette enzyme, d’études de "docking" et basé sur un criblage de l'inhibition de la CYP1B1 par un large éventail de dérivés stéroïdiens; trois séries d'inhibiteurs C18-stéroïdiens ont été conceptualisées et synthétisés. Les résultats obtenus avec ces composés ont montré que l'introduction d'un groupe aromatique en position C2 d'un noyau 17β-estradiol favoriserait des interactions π-stacking avec la CYP1B1. L'activité inhibitrice de ces composés a été comparée avec l'α-naphthoflavone (ANF), un inhibiteur non stéroïdien connu de la CYP1B1. Certains de ces dérivés stéroïdiens ont montré une activité inhibitrice supérieure à celle de l'ANF et font actuellement l'objet de tests biologiques afin d'appuyer leur utilisation thérapeutique pour le traitement de certains cancers. / Steroids and their derivatives form a single biological class involved in a large number of physiological processes. These compounds have a great therapeutic interest, particularly because they play a crucial role in the development of hormone-dependent cancers such as prostate and breast cancers. The most widely used therapeutic approach consists to develop steroid derivatives that will act as inhibitors of certain steroidogenic enzymes to avoid the production of androgens and estrogens according to the desired effect. However, the activity of steroid derivatives is versatile and these compounds can have other therapeutic interests by acting on very distinct biological targets. The first part of this thesis is focused on the development of a library of aminosteroid similar to RM-581 (C18-steroidal nucleus), and analogue to RM-133 (C19-steroidal nucleus) that showed significant cytotoxic activities on a wide variety of cell lines from different cancers. Solid-phase synthesis was used for the development of these RM-581 analogues. Forty aminosteroids with different amino-substituted side chains at position C2 of an estrane nucleus (mestranol) were thus obtained. Significant cytotoxic activities were observed for the same compounds regardless of the cancer cell lines tested. Moreover, one of these aminosteroid derivatives was found to be twice more active than RM-581 and could be a promising candidate for the treatment of several cancers, including pancreatic cancer. The second part of this thesis is devoted to the development of steroidal inhibitors of CYP1B1, an enzyme playing an important mutagenic role in certain cancers. Based on known CYP1B1 inhibitors, docking studies and on a screening of the CYP1B1 inhibition by a broad range of steroid derivatives, three series of C18-steroidal inhibitors were designed and synthesized. The results obtained with these novel steroidal inhibitors showed that the introduction of an aromatic core at position C2 of the 17β-estradiol nucleus appears to be the best strategy for promoting pi-stacking interactions with CYP1B1. The inhibitory activity of these compounds was compared with α-naphthoflavone (ANF), a known nonsteroidal potent CYP1B1 inhibitor. Some of these steroidal inhibitors have shown a greater CYP1B1 inhibitory activity than ANF and are currently undergoing biological tests to support their therapeutic use for the treatment of certain cancers.

Thesis (MSc) Stellenbosch University, 2014 / ENGLISH ABSTRACT: In this study, the effect of the amino acid residues at positions 40 and 407 on the catalytic activity of porcine CYP17A1 was investigated. Porcine cofactor CYB5 was cloned from porcine liver tissue and its effect on the catalytic activity of porcine CYP17A1 was determined. The influence of rat, human and angora CYB5 on the lyase activity of porcine CYP17A1 was subsequently determined and compared to the influence of porcine CYB5. Wt porcine CYP17A1, which has residues Val40 and His407, catalysed the conversion of prog efficiently with ~50% prog converted to 17OHprog (~40%) and A4 (~10%) after 3 hr. After 24 hr, negligible levels prog remained with ~71% 17OHprog and ~25% A4 being produced. Low levels of 16OHprog were formed (~9%). The Leu105Ala mutation reduced wt 17α-hydroxylase activity, with 70% prog remaining after 24 hr while 16OHprog (~10%) levels remained unchanged. Porcine CYP17A1 with residues Leu40 and His407, exhibited similar catalytic activity towards prog as did wt porcine CYP17A1 (Val40 and His407 residues), while porcine CYP17A1 with residues Leu40 and Leu407 increased the formation of A4 2-fold to 54% at 24 hr and porcine CYP17A1 with residues Val40 and Leu407 resulted in the highest formation of A4 (90%). Wt porcine CYP17A1, while having converted 95% of the prog substrate, produces only ~16% A4 after 24 hr. In the presence of porcine CYB5, however, the lyase activity was stimulated with 85% of prog being converted to A4 and only 13% 17OHprog remaining. The lyase activity was also stimulated by CYB5 from other species, resulting in an increase in A4 production of 60.6%, 24% and 11.6% by rat, angora and human CYB5, respectively. The degree of lyase stimulation correlated to the percentage identity of the CYB5 amino acid sequences to porcine CYB5. While the Val and Leu residues at position 40 do not appear to influence the lyase activity of porcine CYP17A1 as prominently as the residue at position 407, it is the charged residue at 407 that plays a significant role in the production of A4, decreasing A4 production irrespective of the Val and the Leu residues at position 40. It would, furthermore, appear that the stimulation of lyase activity of CYP17A1 is the greatest when assaying this activity in the presence of CYB5 of the same species as was detected when co-expressing porcine CYP17A1 and porcine CYB5. / AFRIKAANSE OPSOMMING: In hierdie studie is die invloed van die aminosuurresidue by posisies 40 en 407 op die katalitiese aktiwiteit van vark CYP17A1 ondersoek. Vark CYB5 is geklooneer vanuit vark lewer weefsel en die effek van hierdie kofaktor op die katalitiese aktiwiteit van vark CYP17A1 is bepaal. Die invloed van rot, mens en angora CYB5 op die liase aktiwiteit van vark CYP17A1 is daarna bepaal en vergelyk met die invloed van vark CYB5. Vark CYP17A1-VH, (kodeer Val40 en His407), kataliseer die omskakeling van prog doeltreffend met ~50 % prog wat omgeskakel word na 17OHprog (~40%) en A4 (~10%) na 3 uur. Na 24 uur, is feitlik alle prog omgeskakel, met ~71% 17OHprog en ~25% A4 geproduseer. Lae vlakke 16OHprog is ook gevorm (~9%). Die Leu105Ala mutasie verminder 17α- hidroksilase aktiwiteit, met 70% prog wat na 24 uur nie omgesit is nie, terwyl 16OHprog (~10%) vlakke onveranderd gebly het. Vark CYP17A1-LH (kodeer Leu40 en His407), en CYP17A1-VH het diselfde katalitiese aktiwiteit teenoor prog getoon, terwyl vark CYP17A1-LL (kodeer Leu40 en Leu407) die vorming van A4 2-voudig verhoog het tot 54% na 24 uur. Vark CYP17A1-VL (kodeer Val40 en Leu407) se katalitiese aktiwiteit het gelei tot die hoogste vorming van A4 (90%). Alhoewel CYP17A1-VH, 95% van die prog substraat omgeskakel het is slegs ~16% A4 geproduseer na 24 uur. In die teenwoordigheid van vark CYB5 is die liase aktiwiteit egter gestimuleer, en is 85% van die prog substraat omgeskakel na A4 met slegs 13% 17OHprog teenwoordig na 24 uur. Die liase aktiwiteit is ook gestimuleer deur CYB5 van ander spesies, wat lei tot 'n toename in A4 produksie van 60,6% , 24% en 11,6% deur rot, angora en menslike CYB5, onderskeidelik. Daar is gevind dat daar’n sterk korrelasie is tussen die stimulering van die liase aktiwitieit en die persentasie aminosuur volgorde identiteit van CYB5 afkomstig vanaf die verskillende spesies. Terwyl die Val en die Leu aminosuurresidu op posisie 40 wel die liase aktiwitiet tot ‘n mate beȉnvloed, blyk dit uit die data dat die potitief gelaaide residue by 407 'n belangrike rol speel in die produksie van A4, en A4 produksie verlaag ongeag van die Val en die Leu residu by posisie 40. Dit wil ook verdermeer voorkom asof die stimulering van die liase aktiwiteit van CYP17A1 die hoogste is wanneer die ensiem gekataliseerde reaksie deurgevoer word in die teenwoordigheid van CYB5 en CYP17A1 afkomstig vanaf dieselfde spesies.

La géosmine est un terpénoïde, provoquant un goût moisi-terreux associée à des flaveurs atypiques dans l'eau et le vin. Chez les bactéries, la voie de biosynthèse de la géosmine est bien caractérisée, mais peu de connaissance sont disponibles au sujet de sa biosynthèse chez les eucaryotes, en particulier dans les champignons filamenteux. L'origine de la géosmine dans la vigne est en grande partie attribuable à la présence de Penicillium expansum sur les raisins. Dans cette thèse, afin de mieux comprendre la voie de biosynthèse de la géosmine chez Penicillium expansum, nous avons décrit la caractérisation et l'analyse de "gpe1", un gène codant pour une cytochrome P450 monooxygénase impliquée dans la biosynthèse de la géosmine. Nous avons démontré que les deux fragments d'ADN: p450-1 et p450-2 appartiennent à un seul gène du cytochrome p450 (gpe1). La séquence d'acides aminés déduite de gpe1 a une identité moyenne de 40 % avec les enzymes PbP450-2 et P450-4 qui ont été trouvées impliquées respectivement dans la synthèse d'indole diterpène et dans la synthèse des gibbérellines. Les amplifications par PCR effectuée sur quatorze espèces de Penicillium ont montré que seules les espèces producteurices de la géosmine ont donné le même fragment de ~1,2 kb que gpe1. L'analyse du gène gpe1 nous a permis d'identifier la présence de certains domaines conservés de cytochromes P450 monooxygénases. Ensuite, la caractérisation fonctionnelle du gène gpe1 chez P. expansum M2230 a été décrite. Nous avons montré que les mutants de gpe1 ont perdus leur pouvoir de produire la géosmine alors que les révertants de gpe1 ont rétablis leur pouvoir de production. Enfin, nous avons démontré qu'une polykétide synthase putative et une putative NRPS sont présentes sur le côté droit du gène gpe1 proposant que le gène gpe1 pourrait être une partie d'un «Cluster» codant pour la biosynthèse de métabolites secondaires. / Geosmin is a terpenoid, an earthy-musty compound associated with off-flavors in water and wine. In bacteria, the biosynthesis pathway of geosmin is well characterized, but little is known about its biosynthesis in eukaryotes, especially in filamentous fungi. The origin of geosmin in grapevine is largely attributable to the presence of Penicillium expansum on grapes. In this thesis, we have described the characterization and analysis of "gpe1", a gene encoding a cytochrome P450 monooxygenase probably involved in the biosynthesis of geosmin in P. expansum M2230, in order to better understand of the biosynthesis pathway of geosmin in this species. We demonstrated that the two DNA fragments i.e. p450-1 and p450-2 belong to a single cytochrome p450 gene (gpe1). We showed that the deduced amino acid sequence of gpe1 has an average identity of 40 % with PbP450-2 and P450-4 enzymes which have been found involved in indole diterpene synthesis and in gibberellin synthesis respectively. Then, the results of PCRs performed on the fourteen Penicillium species showed that only Penicillium species which were producers of geosmin gave the same fragment of ~1.2 kb like gpe1. Analysis of the gpe1 gene enabled us to identify the presence of some conserved domains of cytochromes P450 monoxygenases in the amino acid sequence of gpe1. Then, the functional characterization of the gpe1 gene in P. expansum M2230 was described. We illustrated that the mutants of gpe1 lost their potential to produce geosmin whereas the reverse complements of gpe1 restored their potential to produce geosmin. Finally, we demonstrated that a putative polyketide synthase and a putative NRPS-like enzyme are present on the right side of the gpe1 gene suggesting that gpe1 gene might be the part of a gene cluster encoding the biosynthesis of secondary metabolites.