Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Les réactions adverses aux médicaments sont une série de réactions physiologiques indésirables, qui apparaissent suite à un traitement médicamenteux. Plusieurs hypothèses reconnues tentent d'expliquer les phénomènes sous-jacents à l'apparition d'une de ses réactions. Celles-ci sont généralement séparées selon les groupes simplifiés suivants : A) Interaction directe entre le médicament et le système immunitaire; B) Interaction indirecte avec le système immunitaire, via la formation d'haptène; C) Interaction indirecte avec le système immunitaire, via un signal de danger. Or, le métabolisme des médicaments est omniprésent dans les différentes hypothèses. Sans pour autant expliquer complètement tous les effets toxiques observés, plusieurs protéines pourraient ainsi être modifiées par des métabolites réactifs. Par contre, l'information recueillie jusqu'à maintenant est limitée et ne permet pas la compréhension du processus menant à la formation de métabolites réactifs, pas plus qu'à l'identification des protéines impliquées dans le stress cellulaire et l'activation du système immunitaire. Dans ce projet, nous avons choisi de concentrer nos efforts à trois niveaux : A) sur l'identification de cibles protéiques de l'acide tiénilique, un diurétique reconnu entre autres pour les hépatites qu'il induit; B) sur le développement et la caractérisation d'un analogue pouvant permettre la récupération et l'identification des cibles protéiques de la névirapine, un bloqueur de la transcriptase inverse dont l'administration peut provoquer des réactions adverses sévères; C)et finalement sur l'identification d'un modèle cellulaire pour l'étude de l'agranulocytose. En effet, selon nous, une meilleure compréhension du métabolisme des médicaments et du phénomène menant à la modification protéique est souhaitable au développement de stratégies thérapeutiques plus sécuritaires.

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Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

CAR (Constitutive Androstane Receptor, NR1I3) et PXR (Pregnane X Receptor, NR1I2) sont deux récepteurs nucléaires dédiés à la reconna issance et à l'élimination de molécules lipophiles potentiellement toxiques pour l'organisme. Ces facteurs de transcription peuvent être activés par des ligands d'origines et de structures diverses (médicaments, polluants environnementaux, produits de l'alimentation et de phytothérapies). L'activation de ces récepteurs entraîne l'expression des gènes majeurs de la fonction de détoxication entéro-hépatique (CYP450, transférases, transporteurs) permettant l'élimination de ces toxiques. Dans ce travail, nous avons dans un premier temps 1) montré que CAR contrôle l'expression de Spot14, une protéine pro-lipogénique, et 2) nous avons identifié une nouvelle isoforme de PXR (PXR-small) codant uniquement pour le domaine de liaison des ligands de PXR. Nous avons pu déterminer les origines de transcription par 5'-RACE PCR et montrer que PXR-small représente environ 10% de l'ensemble des transcrits de PXR dans le tissu hépatique sain par une approche de PCR qua ntitative. Nous avons pu détecter sa présence par western-blot sur des extraits de protéines nucléaires issus de tissus hépatiques et de lignées cellulaires hépatiques. Par des expériences de gel retard, nous avons observé que cette nouvelle isoforme tronquée, qui ne code que pour le LBD de PXR, ne peut pas se lier à l'ADN. Des expériences de gènes rapporteurs suggèrent que cette isoforme se comporte comme un dominant négatif de PXR. Enfin, la présence d'un ilot CpG situé juste en amont de PXR-small suggère que cette nouvelle isoforme pourrait être régulée épigénétiquement par méthylation, notamment dans les cellules tumorales. / CAR (Constitutive Androstane Receptor, NR1I3) and PXR (Pregnane X Receptor, NR1I2) are two nuclear receptors devoted to the recognition and elimination of lipohilic molecules potentially toxic to the body.These transcription factors can be activated by ligands of different origins and structures (drugs, environmental pollutants, food products and herbal medicine...). The activation of these receptors leads to the expression of major genes of the detoxification process (CYP450, transferases, transporters) leading to the elimination of these toxics. In this work, we 1) showed that Spot14, a pro-lipogenic protein, is a target gene of CAR, then 2) we identified a novel isoform of PXR (PXR-small), coding only the ligand binding domain of PXR. By using 5'-RACE PXR, we established the origins of transcription of PXR-small and by quantitative PCR we observed that PXR-small represents about 10% of all PXR transcripts in human liver. By using western blo t, we detect its presence on nuclear protein extracts from liver tissues and hepatic cell lines. In Electromobility shift essays experiments, we observed that PXR-small cannot bind to DNA, while reporter essay experiments suggest that this isoform acts as a dominant negative of PXR. Finally, the presence of a CpG island just upstream of PXR-small suggests that this novel isoform might be regulated epigenetically by methylation, more particularly in tumor cells.

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Ce projet de recherche comporte deux parties principales qui possèdent comme lien unificateur l’amélioration des méthodes et techniques utilisées actuellement pour évaluer aussi bien l’activité que l’expression des cytochromes P450 (CYP450s) et menant par la suite à leur application en clinique. Le premier volet de ce projet de recherche porte sur le développement de méthodes LC-MS/MS pour un cocktail de 7 substrats marqueurs des CYP450s. Notre objectif est de développer et valider une méthode LC-MS/MS spécifique et sensible permettant l’évaluation des activités des CYP1A2, 2B6, 2C9, 2C19, 2D6, 3A4/5 et 2E1 suivant l’administration orale et à faible dose d’un cocktail de substrats marqueurs chez des patients et sujets sains. Les méthodes développées peuvent être utilisées pour évaluer les mécanismes de variabilité interindividuelle comme l’impact de polymorphismes génétiques, de facteurs environnementaux et de maladies dans le processus de métabolisme et d’élimination des médicaments, mais également pour investiguer les interactions médicamenteuses. Ce cocktail a été appliqué avec succès, dans un projet clinique portant sur l’évaluation des effets du diabète sur la capacité métabolique par les CYP450s. Le deuxième volet de ce projet de recherche vise à développer des méthodes analytiques par LC-HRMS afin de caractériser et quantifier les CYP1A1, 1A2, 1B1, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, 2J2, 3A4, 3A5, 3A7 et 4F2 dans l’intestin grêle humain. Notre hypothèse suggère que les CYP450s retrouvés le long de l’intestin grêle peuvent affecter significativement l’effet de premier passage de certains médicaments administrés par voie orale et influencer leurs concentrations plasmatiques et conséquemment, leurs effets pharmacologiques et/ou toxiques. Ma participation à ce projet a permis d’identifier des peptides protéotypiques par digestion in silico et in vitro et de développer des méthodes de quantification absolue par LC-HRMS. Ce projet est une première étape dans la caractérisation des CYP450s majeurs le long de l'intestin grêle. Il permettra de mieux comprendre les mécanismes de variabilité interindividuelle dans la réponse aux médicaments associés au processus d'absorption intestinal et de mieux prédire la variabilité dans la biodisponibilité des médicaments et de développer des modèles pharmacocinétiques plus complexes. / This research project is divided into two sections, both aiming at the development of sensitive and specific LC-MS methods to evaluate activity and expression of CYP450 and finally, looking at their clinical application. The first section of this research project focuses on the development of analytical methods by LC-MS/MS for a seven CYP450 probe-drug cocktail. Although these cocktails have shown value they also suffer from many limitations. Our objective was to develop and validate highly sensitive and selective LC-MS/MS assays allowing the determination of CYP1A2, 2B6, 2C9, 2C19, 2D6, 3A4/5 and 2E1 activities following administration of low oral doses of a modified CYP450 probe-drug cocktail in patients. These methods can be used to phenotype CYP450 activities, evaluate inter-individual variabilities, study the impact of pathological conditions on drug metabolism and elimination, and evaluate drug-drug interactions. Our CYP450 cocktail assays have been successfully applied to phenotype CYP450 activities in type 2 diabetic patients. The second section of this project aims at the development of a LC-HRMS method for the characterization and absolute quantification of CYP1A1, 1A2, 1B1, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, 2J2, 3A4, 3A5, 3A7 and 4F2 in the human small intestine. Our hypothesis suggests that CYP450 isoenzymes found along the small intestine can significantly affect the first-pass effect of certain drugs administered orally and thus influence their pharmacological and/or toxic effects. My participation in this project allowed to identify proteotypic peptides by in silico and in vitro digestion and to develop LC-HRMS methods allowing the absolute quantification of CYP450. This project is a first step in the characterization of the main CYP450 along the small intestine. This project will allow a better understanding of inter-individual variability in drug response associated with intestinal absorption of drugs, a better prediction of variability in drug bioavailability and to develop more complex pharmacokinetic models.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / L'échec de la transplantation est dû en partie aux dormnages causés par la préservation à froid et la réperfiision à chaud lors de l'intervention. Parmi les hypothèses retenues pour expliquer ces dommages, on retient la formation des radicaux libres et les perturbations du pH, du calcium et du volume cellulaire. L'ajout de certaines substances dans le milieu de préservation a permis de prolonger de 6h à 24h la survie de l'organe. Malgré le développement de solutions de préservation qui diminuent le gonflement cellulaire des foies à transplanter, les dommages de la reperfusion chaude ne sont pas abolis. Il se peut donc, que l'hypothermie anoxique altère les mécanismes de régulation du volume cellulaire et que ces perturbations contribuent aux dommages observés lors de la reperfusion du greffon chez le receveur. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons vérifié dans le premier chapitre si les conditions de la préservation à froid suivie du réchauffement entravaient la diminution ou l'augmentation compensatrice de volume observé respectivement après un choc hypotonique (retrait de 50 mmol de NaC1). Notre étude démontre que les hépatocytes préservés dans la solution de l'Université de Wisconsin (UM.) ont été moins résistants aux stress osmotiques, ce qui peut rendre les cellules moins aptes à répondre aux stimulations physiologiques comme l'accumulation des acides aminés, spécialement lors des demandes métaboliques et l'alimentation parentérale riche en acides aminés. Ceci devrait être confirmé dans les conditions in vivo. Cependant, nos résultats supportent la notion que la perturbation du volume cellulaire homéostasique peut correspondre au dysfonctionnement primaire observé dans 15% des cas lors de la transplantation hépatique. Subséquemment, nous avons étudié l'impact de la préservation et la réperfusion à chaud sur le transport hépatique d'acides aminés couplés au Na ( 1 0 mM). Nous avons mesuré par la technique de vidéoplanimétrie les changements initiaux de volume qui reflètent l'accumulation des acides aminés. Nous avons constaté qu'en fonction du temps de préservation les transporteurs sont affectés différemment. Le gonflement induit par la proline, substrat spécifique du système ASC est très sensible à la préservation à froid dans la solution U.W. chutant de 50 % après 24h de préservation comparée avec le contrôle sans préservation, en opposition à la glutamine ou à l'analogue de l'alanine. Ceci nous a conduit à proposer que le gonflement induit par la proline représente un index fonctionnel sensible de l'intégrité des cellules du foie. Dans le second chapitre, nous avons comparé l'efficacité de la solution U.W. et la solution Sodium-Lactobionate-Sucrose (SLS) dans leurs capacités à maintenir la viabilité cellulaire et une fonction différenciée des cellules du foie (gonflement induit par l'addition de 10 mM de Proline, substrat spécifique du système ASC). Enfin, dans le troisième chapitre, nous avons comparé l'effet de ces deux solutions (U.W./SLS) sur le métabolisme des médicaments et l'activité catalytique du cytochrome P-450 au niveau des cellules isolées de foie de rat. Cette activité catalytique est calculée par la mesure de la concentration totale du cytochrome P-450 et des métabolites de la théophylline générés après 4h d'incubation. La théophylline est utilisée car elle est métabolisée par plusieurs isoformes du cytochrome P-450: cytochrome P-450 1A2, 2D6, 2E1 et 3A4 dont l'aboutissement est le 1,3-DMU qui est son métabolite majeur. Nous avons noté que la majorité de perturbations observées dans notre modèle in vitro est entre 10 et 24 h de préservation à froid des hépatocytes dans les deux solutions (U.W./SLS). Ceci correspond à la période 12 h de préservation à froid des foies humains dans la solution U.W., qui représente un facteur de risque relatif pour un mauvais pronostic, responsable de dysfonctionnement primaire observé dans 15% des cas lors de la transplantation hépatique. Nos données démontrent clairement que la préservation à froid des hépatocytes dans la solution SLS, préparée au laboratoire à coût très réduit, donne des résultats équivalent à ceux de la solution U.W. (commercialisée par Dupont) quant à sa capacité à maintenir la viabilité cellulaire, l'intégrité fonctionnelle des cellules du foie et le métabolisme des médicaments. Ceci suggère que la solution SLS, qui n'est qu'une variante de la solution U.W., est suffisante pour obtenir les effets bénéfiques de préservation de la solution élaborée expérimentalement (Belzer et Southard, 1988). Donc certains composants de la solution U.W. ne peuvent apporter aucun impact bénéfique comparé à la solution SLS à composition beaucoup plus simple. Une approche intéressante pourrait être établie sur une solution aussi simple que la SLS à laquelle des agents pharmacologiques et cytoprotecteurs peuvent être ajoutés. Ceci permettra de maintenir l'efficacité des fonctions hépatiques et d'améliorer la survie des greffes du foie, menant ainsi à un meilleur pronostic de la transplantation du foie.

Introduction : Les modèles murins sont grandement utilisés dans l’étude des maladies rénales et des pathologies associées. La concentration de la créatinine sérique est un bon indicateur de la filtration glomérulaire et en présence d’insuffisance rénale chronique (IRC), les concentrations de créatinine sérique (et la clairance) reflètent la sévérité de l’IRC. De plus, il a été démontré que l’IRC modifie le métabolisme des médicaments en diminuant l’activité et l’expression des enzymes hépatiques du cytochrome P450 (CYP450). Afin d’étudier la modulation du P450 par l’IRC avec un modèle murin et de confirmer nos résultats chez le rat, nous devons 1) développer un modèle d’IRC chez la souris, 2) mettre au point une technique de dosage des marqueurs de l’IRC et, 3) évaluer l’expression protéique du CYP450 en présence IRC. Matériel et Méthode : Trois modèles chirurgicaux d’IRC chez la souris ont été développés. Une méthode du dosage de la créatinine par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) a été mise au point chez la souris et l’expression protéique du P450 a été mesurée par immunobuvardage de type Western. Résultats : Plusieurs paramètres de CLHP comme le pH, la concentration et le débit de la phase mobile modifient le pic d’élution et le temps de rétention de la créatinine. Concernant le modèle expérimental, on observe une perte de poids et une augmentation de la concentration plasmatique de la créatinine chez les souris avec une IRC. De plus, l’expression protéique de plusieurs isoformes du cytochrome P450 est modulée par l’IRC. Nous observons une diminution du CYP 2D de 42% (p < 0,01), du CYP 3A11 de 60% et du CYP 1A de 37% (p <0,01) par rapport aux souris témoins. On ne dénote aucun changement significatif au niveau de l’isoforme 2E1. Conclusion : Il est possible d’induire une insuffisance rénale chronique chez la souris suite à une néphrectomie. La technique de dosage de la créatinine par CLHP est précise et exacte et permet de caractériser la sévérité de l’IRC chez la souris. L’expression protéique du CYP450 est régulée à la baisse dans le foie des souris atteintes d’IRC. / Background: Mice models are widely used in renal studies. Seric creatinine concentration is used to evaluate glomerular filtration rate and is a good marker of chronic renal failure (CRF). It has been shown that CRF diminishes drug metabolism in the rat because of a downregulation of hepatic cytochrome P450 (CYP450) isoforms. To study CYP450 regulation in the mouse model, we needed to 1) develop a model of CRF in the mouse, 2) define a method of dosage of CRF markers, and 3) evaluate CYP450 protein expression in the liver of mice with CRF. Methods: Models of CRF were tested and sub-total nephrectomy was selected because of the efficacy and reproducibility to induce CRF. A high pressure liquid chromatography (HPLC) method for the dosage of creatinine in mice sera was developed. Liver protein expression of CYP1A1, CYP3A11, CYP2D and CYP2E1 was assessed by Western Blot analysis. Results: HPLC parameters such as pH, mobile phase concentration and flow rate modified the elution profile. Weight loss and high seric creatinine concentrations are seen in mice with CRF. Furthermore, protein expression of CYP1A, CYP3A11 and CYP2D was decreased in liver microsomes of mice with CRF by 37%, 60% and 42%, respectively (p<0.01) compared to sham-operated mice. We found no significant difference in the expression of CYP2E1. Conclusions: CRF models are reproducible in the mouse. The HPLC method for creatinine determination is precise and accurate, and can assess the severity of CRF. Hepatic protein expression of CYP450 is modulated in presence of CRF as in the rat.