Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology and Toxicology Candidate: Ioannis Mouratidis Supervisor: Doc. PharmDr. Petr Pávek Ph.D. Testing of newly synthesized compounds with constitutive androstane receptor (CAR) Interactions of a diverse array of nuclear receptors with numerous isolated compounds (ligands) have been extensively investigated during the last years. The reason of this intense research activity is, of course, the wide therapeutic potential of the nuclear receptors super- family. It is known that they interact with the metabolism and excretion of various compounds, endogenous or exogenous that interfere with the homeostasic mechanisms of the living organisms. In my study, I tested the activation of a specific orphan nuclear receptor known as constitutive androstane receptor (CAR). I tested 11 structurally different compounds as well as a known inhibitor of CAR (clotrimazole) and an activator (CITCO). To test these interactions between these compounds and CAR, I used the method of the mammalian two- hybrid system, a method where ligand-protein interactions are studied in an environment close to that in vivo. The method is based on the Dual-Luciferase Reporter kit, which made the quantification of the CAR responsive luciferase reporter...

There are many causes of cholestasis, which results when the flow of bile acids is slowed or stopped. Bile acids are hydrophobic molecules synthesized from cholesterol in the liver, and when present in excess, are cytotoxic to cell membranes. Treatment options for cholestasis are limited, and if left untreated or inadequately treated, many patients will require a liver transplant; thus, underscoring the importance of successfully managing this disease. Activation of nuclear receptors in animal models has been shown to be hepatoprotective during bile acid-induced cholestasis; however, the mechanisms underlying the hepatoprotective effects are poorly understood. Therefore, the over-arching goal of this project is to glean an improved comprehension of the mechanisms of hepatoprotection during bile acid-induced cholestasis. All of the studies involve administration of CAR activators phenobarbital (PB), oltipraz (OPZ), 1,4-bis[2-(3,5-dichloropyridyloxy)]benzene [TCPOBOP (TC)] or corn oil (CO) to C57BL/6 wild type (WT), or WT and CAR knockout (CAR-/-) mice prior to induction of intrahepatic cholestasis using the secondary bile acid lithocholic acid (LCA). Efflux transport proteins such as Mrps 3 and 4 are known to be up-regulated during cholestasis, and this was the first topic of exploration. Unexpectedly, the expression of efflux transporters was not consistently up-regulated in protected mice. However, a decrease in total liver bile acid concentrations was observed. These changes in hepatic bile acids indicated that bile acid biosynthesis may be relevant to hepatoprotection. Indeed decreases in total and individual bile acids correlated with hepatoprotection, and Cyp8b1 expression was also increased which could be suggestive of a shift in the bile acid biosynthesis pathway towards the formation of less toxic bile acid species. CAR may also have a role in cell death via apoptosis by altering Bcl-2 protein expression. Although apoptosis was decreased in hepatoprotected mice, an increase in the expression of Mcl-1 and Bcl-xL was not observed, suggesting hepatoprotection is not a direct result of CAR-induced Mcl-1 expression. These findings add significantly to the body of knowledge surrounding cholestatic liver disease and suggest that studies aimed toward manipulation of nuclear receptors are worthy of further exploration.

CAR (Constitutive Androstane Receptor, NR1I3) et PXR (Pregnane X Receptor, NR1I2) sont deux récepteurs nucléaires dédiés à la reconna issance et à l'élimination de molécules lipophiles potentiellement toxiques pour l'organisme. Ces facteurs de transcription peuvent être activés par des ligands d'origines et de structures diverses (médicaments, polluants environnementaux, produits de l'alimentation et de phytothérapies). L'activation de ces récepteurs entraîne l'expression des gènes majeurs de la fonction de détoxication entéro-hépatique (CYP450, transférases, transporteurs) permettant l'élimination de ces toxiques. Dans ce travail, nous avons dans un premier temps 1) montré que CAR contrôle l'expression de Spot14, une protéine pro-lipogénique, et 2) nous avons identifié une nouvelle isoforme de PXR (PXR-small) codant uniquement pour le domaine de liaison des ligands de PXR. Nous avons pu déterminer les origines de transcription par 5'-RACE PCR et montrer que PXR-small représente environ 10% de l'ensemble des transcrits de PXR dans le tissu hépatique sain par une approche de PCR qua ntitative. Nous avons pu détecter sa présence par western-blot sur des extraits de protéines nucléaires issus de tissus hépatiques et de lignées cellulaires hépatiques. Par des expériences de gel retard, nous avons observé que cette nouvelle isoforme tronquée, qui ne code que pour le LBD de PXR, ne peut pas se lier à l'ADN. Des expériences de gènes rapporteurs suggèrent que cette isoforme se comporte comme un dominant négatif de PXR. Enfin, la présence d'un ilot CpG situé juste en amont de PXR-small suggère que cette nouvelle isoforme pourrait être régulée épigénétiquement par méthylation, notamment dans les cellules tumorales. / CAR (Constitutive Androstane Receptor, NR1I3) and PXR (Pregnane X Receptor, NR1I2) are two nuclear receptors devoted to the recognition and elimination of lipohilic molecules potentially toxic to the body.These transcription factors can be activated by ligands of different origins and structures (drugs, environmental pollutants, food products and herbal medicine...). The activation of these receptors leads to the expression of major genes of the detoxification process (CYP450, transferases, transporters) leading to the elimination of these toxics. In this work, we 1) showed that Spot14, a pro-lipogenic protein, is a target gene of CAR, then 2) we identified a novel isoform of PXR (PXR-small), coding only the ligand binding domain of PXR. By using 5'-RACE PXR, we established the origins of transcription of PXR-small and by quantitative PCR we observed that PXR-small represents about 10% of all PXR transcripts in human liver. By using western blo t, we detect its presence on nuclear protein extracts from liver tissues and hepatic cell lines. In Electromobility shift essays experiments, we observed that PXR-small cannot bind to DNA, while reporter essay experiments suggest that this isoform acts as a dominant negative of PXR. Finally, the presence of a CpG island just upstream of PXR-small suggests that this novel isoform might be regulated epigenetically by methylation, more particularly in tumor cells.

Le cancer colorectal est marqué par une importante mortalité dans les stades avancés du fait du fort taux de récidives tumorales après chimiothérapie. La prédiction de l'efficacité et de la toxicité des cytotoxiques s'impose comme un des enjeux majeurs de ces prochaines années. Parce que la majorité des anticancéreux sont pris en charge par les enzymes et transporteurs dont l'expression est contrôlée par le niveau d'expression et d'activation des xénosenseurs CAR et PXR, il est fort probable que ces xénosenseurs puissent représenter des facteurs prédictifs à prendre en compte dans la prise en charge des cancers. Notre équipe a récemment montré que les récepteurs des xénobiotiques PXR (NR1I2) (Raynal et al, 2010) et CAR (NR1I3) sont exprimés dans des lignées cellulaires et des tissus coliques humains. Leur surexpression dans les lignées coliques LS174T et T84 entraine leur résistance à l'irinotécan et à son métabolite actif le SN38 alors que leur inhibition antagonise cette résistance. Des dosages intra- et extra-cellulaires du SN38 et du SN38-G, ainsi que la quantification des ARNm des l'UGT1As et du transporteur MDR1, montrent que CAR et PXR augmentent le métabolisme détoxifiant et l'efflux du SN38. L'impact de la surexpression de ces xénosenseurs sur la viabilité des cellules LS174T à différentes classes de cytotoxiques (anti-métabolites, intercalants, inhibiteurs de topoisomérases, poisons du fuseau) a ensuite été évaluée. Nous avons observé que l'expression de CAR ou PXR conduit à une forte chimiorésistance au paclitaxel, au docétaxel et au 4-hydroxy-cyclophosphamide alors que PXR entraîne une sensibilisation marquée au cisplatine et au carboplatine en augmentant la quantité d'adduits de platine sur l'ADN. Les études du transcriptome de nos modèles cellulaires nous ont permis d'identifier les gènes cibles impliqués dans ces variations de cytotoxicité. Des études de confirmation par modulation pharmacologique ou ARNs interférents de ces gènes cibles sont en cours et nous permettront de préciser les mécanismes mis en jeu dans les variations de chimiosensibilité. Ces travaux devraient permettent de mieux appréhender le rôle des xénosenseurs CAR et PXR sur le métabolisme intra-tumoral des cytotoxiques et potentiellement sur la réponse à des chimiothérapies variées. / Colorectal cancer is characterized by high mortality in advanced stages due to the high rate of tumor recurrence after chemotherapy. The prediction of the efficacy and toxicity of cytotoxic drugs represents a major challenge in the coming years. Because the majority of cancer drugs are supported by the enzymes and transporters whose expression is controlled by the level of expression and activation of the xenosensors CAR (NR1I3) and PXR (NR1I2), it is likely that they may represent predictive factors in the management of cancer. Our team has recently shown that xenobiotic receptors PXR (Raynal et al, 2010) and CAR are expressed in cell lines and human colon tissues. Their overexpression in colon cancer cell lines LS174T and T84 leads to resistance to irinotecan and to its active metabolite SN38, while their inhibition reverse this resistance. Irinotecan metabolites detection assays of SN38 and SN38G, and the quantification of UGT1As and MDR1 mRNA, show that CAR and PXR increase the detoxifying metabolism and the efflux of SN38. The impact of overexpression of these xenosensors on LS174T cell viability to different classes of cytotoxic agents (anti-metabolites, DNA intercalators, topoisomerase inhibitors, antimitotic agents) was then evaluated. We observed that the expression of CAR or PXR results in a significant drug resistance to paclitaxel, docetaxel and 4-hydroxy-cyclophosphamide whereas PXR leads to a marked sensitization to cisplatin and carboplatin by increasing the amount of platinum adducts the DNA. Microarray studies of our cell models allowed us to identify the target genes potentially involved in these changes in cytotoxicity. Further studies by pharmacological modulation or interfering RNAs of these target genes are in progress and will allow us to clarify the mechanisms involved in the changes in chemosensitivity. This work should help us to understand the impact of CAR and PXR xenosensors on the intratumoral metabolism of cytotoxic drugs and potentially on the response to various chemotherapies.

Transcription factors activated by exogenous or endogenous stimuli alter gene expression with major effects on chromatin accessibility and the epigenome. This thesis investigates that impact of environmental chemical and hormonal exposure on liver chromatin accessibility in a mouse liver model. Exposure to the constitutive androstane receptor (CAR)-specific agonist ligand 1,4-bis-[2-(3,5-dichloropyridyloxy)]benzene (TCPOBOP) induces localized changes in chromatin accessibility at several thousand DNase hypersensitive sites (DHS). Activating histone marks, associated with enhancers and promoters, were induced by TCPOBOP and were highly enriched at opening DHS. Opening DHS were highly enriched for CAR binding sites and nuclear receptor direct repeat-4 motifs. These DHS were also enriched for the CAR heterodimeric partner RXRA, binding by CEBPA and CEBPB, and motifs for other liver-specific factors. Thus, TCPOBOP alters the enhancer landscape through changes in histone marks and by mechanisms linked to induced CAR binding. In other studies, the impact of pituitary growth hormone (GH) secretion patterns on chromatin accessibility changes associated with sex-biased liver gene expression was examined. In adult male liver, the transcription factor STAT5 is directly activated by each successive plasma GH pulse. In female liver, STAT5 is persistently activated by the near-continuous stimulation by plasma GH. A majority of the ~4,000 GH-regulated, sex-biased DHS have chromatin marks characteristic of enhancers and were enriched for proximity to sex-biased gene promoters. Chromatin accessibility is thus a key feature of sex-differential gene expression. Two major classes of male-biased DHS were identified: dynamic male-biased DHS, almost all bound by STAT5, which undergo repeated cycles of chromatin opening and closing induced by each GH pulse; and static male-biased DHS, whose accessibility is unaffected GH/STAT5 pulses and whose sex bias results from these chromatin sites being more closed in female liver. Sites with STAT5 binding showed greater chromatin opening, many of which also contain the STAT5 motif. Finally, the effect of a single GH pulse on hypophysectomized male mouse liver was investigated to identify DHS responsive to the male, pulsatile-GH, secretion pattern. These studies demonstrate that widespread epigenetic changes associated with target gene expression are induced by xenobiotics and hormones regulating liver gene expression. / 2022-01-31T00:00:00Z

Le fipronil, insecticide largement utilisé, est un perturbateur thyroïdien chez le rat modulant le catabolisme hépatique des hormones thyroïdiennes. Ses effets chez le mouton, considéré comme un modèle plus pertinent que le rat pour étudier une régulation de la fonction thyroïdienne chez l'Homme, sont plus limités. Le but de cette thèse était de caractériser au niveau hépatique le mode d'action du fipronil sur la fonction thyroïdienne en s'intéressant 1) au rôle potentiel du principal métabolite du fipronil formé in vivo, le fipronil sulfone, et 2) aux différences interspécifiques de métabolisme du fipronil et/ou de sensibilité à la perturbation thyroïdienne qui peuvent préjuger de la pertinence des différents modèles animaux pour l'analyse du risque du fipronil pour la santé humaine. L'efficacité du fipronil sulfone à induire l'expression et/ou l'activité d'enzymes responsables du métabolisme hépatique des hormones thyroïdiennes ou du fipronil était la même que celle du fipronil autant in vivo chez le rat que in vitro sur hépatocytes. L'utilisation d'un modèle de souris déficientes pour des récepteurs nucléaires xénosenseurs suggérait fortement une implication des récepteurs nucléaires Constitutive Androstane Receptor et/ou Pregnane X Receptor dans la perturbation thyroïdienne induite par le fipronil / The widely used insecticide fipronil is a thyroid disruptor in rat acting on thyroid hormone hepatic metabolism. In sheep, a more relevant species for the human thyroid regulation, fipronil-induced thyroid-disruption is much more limited. The goal of this thesis was to characterize the mode of action of fipronil on thyroid function at the hepatic level focusing on 1) the potential role of fipronil sulfone, the main fipronil metabolite formed in vivo, and on 2) interspecific differences in terms of fipronil metabolism and/or sensitivity to thyroid disruption that can prejudge of the relevance of the different animal models for the risk assessment of fipronil for human health. Fipronil sulfone was as efficient as fipronil to induce the expression and/or activity of enzymes involved in thyroid hormone or fipronil hepatic metabolism both in vivo in rat and in vitro on hepatocytes. The use of knock-out mice for xenosensors nuclear receptors strongly suggested an implication of the nuclear receptor Constitutive Androstane Receptor and/or Pregnane X Receptor on fipronil-induced thyroid disruption

Le récepteur CAR, Constitutive Androstane Receptor, appartient à la-famille NR1 des récepteurs nucléaires. Initialement décrit comme un récepteur orphelin, CAR est en fait activé par un grand nombre de molécules exogènes et une des fonctions principales de CAR est celle de xénosenseur. L’activation CAR par ses différents ligands stimule la transcription des enzymes de phase I, II et III nécessaires à la détoxification et à l’élimination des xénobiotiques. Parallèlement, CAR a fait l’objet de nombreux travaux indépendants qui ont démontré son implication dans le métabolisme de molécules endogènes comme les acides biliaires, la bilirubine et les hormones thyroïdiennes. Plus récemment un impact de CAR sur des voies métaboliques fondamentales comme la néoglucogenèse, la lipogenèse et le métabolisme des lipoprotéines a été mis en évidence faisant de CAR au même titre que les récepteurs du groupe NR1 (LXR et FXR) une cible potentielle pour l’étude et le traitement du syndrome métabolique et des maladies cardio-vasculaires. Dans le cadre de ce mémoire nous avons étudié l’impact d’une stimulation chronique de CAR par un agoniste spécifique le TCPOBOP sur le transport reverse du cholestérol, le métabolisme des lipoprotéines et la susceptibilité à l’athérosclérose dans un contexte de surcharge alimentaire en cholestérol. Chez les souris dyslipidémiques déficientes pour le gène du récepteur aux lipoprotéines de faible densité (Ldlr-/-) ou bien déficientes pour l’apoprotéine E l’activation spécifique de CAR par l’agoniste TCPOBOP (3,3’,5,5’-Tétrachloro-1,4-bis (pyridyloxy )benzene), 1) diminue la lipogenèse via l’induction du facteur Insig1 et la répression du facteur de transcription Srebp1c et de ses gènes cibles. Cela se traduit par une diminution de la triglycéridémie plasmatique associée à une diminution du contenu hépatique en triglycérides et une diminution de la sécrétion de lipoprotéines riches en triglycérides, 2) stimule la conversion et l’élimination fécale du cholestérol sous forme d’acides biliaires ce qui se traduit par une élimination accrue du cholestérol dérivé des HDL dans les fèces, dernière étape du transport reverse du cholestérol, 3) diminue le taux de cholestérol associé aux LDL chez les souris Ldlr-/- probablement par stimulation de l’expression hépatique du récepteur aux lipoprotéines de très basse densité. La diminution de l’athérogénicité du profil lipoprotéique et la stimulation du transport reverse du cholestérol sont associées à une réduction des lésions athéromateuses au niveau des valves et de la crosse aortique chez les souris Ldlr-/-. Une diminution des lésions athéromateuses uniquement au niveau de la crosse aortique est également observée chez les souris ApoE-/- L’ensemble des travaux présentés et les récentes études publiées suggèrent que CAR peut être considéré comme un acteur central du métabolisme lipidique et font de ce récepteur nucléaire une nouvelle cible potentielle pour l’étude et le traitement des désordres métaboliques comme le diabète, l’obésité, la stéatose hépatique et l’athérosclérose / The Constitutive Androstane Receptor (CAR) belongs to the subfamily of nuclear receptors NR1. Initially described as an orphan receptor, CAR is activated by a large number of exogenous molecules and acts as a xenosensor. The activation of CAR by these ligands stimulates transcription of phase I, II and III enzymes required for the detoxification and elimination of xenobiotics. Furthermore CAR is also involved in the metabolism of endogenous molecules such as bile acids, bilirubin or thyroid hormones. CAR has recently been the subject of numerous independent studies that have highlighted his involvement in major metabolic pathways including gluconeogenesis, lipogenesis and lipoprotein metabolism, making CAR as well as others NR1 nuclear receptors potential targets for the study and the treatment of metabolic syndrome and cardiovascular diseases. The goal of our work was to determine the impact of a chronic CAR activation on reverse cholesterol transport, lipoprotein metabolism and susceptibility to atherosclerosis in a context of dietary cholesterol overload. In dyslipidemic mice deficient for the low density lipoprotein receptor (Ldlr-/-) or for apolipoprotein E (ApoE-/-), pharmalogical activation of CAR by its specific agonist TCPOBOP (3,3',5,5'-Tetrachloro-1, 4-bis (pyridyloxy) benzene) 1) reduces lipogenesis through the induction of Insig1 and the repression of the transcription factor Srebp1c (meaning..) and its target genes. This results in a decrease in plasma triglyceride levels associated with a reduced hepatic triglycerides concentration and a decreased secretion of triglyceride-rich lipoproteins, 2) stimulates the conversion and fecal cholesterol elimination as bile acids and consequently the last step of reverse cholesterol transport, 3) in Ldlr-/- mice, CAR activation decreases LDL-cholesterol probably through the stimulation of hepatic expression of very low density lipoprotein receptor.Reduction in the atherogenicity of the lipoprotein profile and increase of reverse cholesterol transport lead to a reduction in the size of atherosclerotic lesions in heart valves and aorta in Ldlr-/- mice. Reduction of aortic lesions in aortic arches only was also observed in apoE-/- mice. The present work as well as recent studies suggests that CAR is as central player in lipid metabolism. CAR appears therefore to be a new potential target for the study and the treatment of metabolic disorders like diabetes, obesity, fatty liver and atherosclerosis

Le récepteur CAR, Constitutive Androstane Receptor, appartient à la-famille NR1 des récepteurs nucléaires. Initialement décrit comme un récepteur orphelin, CAR est en fait activé par un grand nombre de molécules exogènes et une des fonctions principales de CAR est celle de xénosenseur. L'activation CAR par ses différents ligands stimule la transcription des enzymes de phase I, II et III nécessaires à la détoxification et à l'élimination des xénobiotiques. Parallèlement, CAR a fait l'objet de nombreux travaux indépendants qui ont démontré son implication dans le métabolisme de molécules endogènes comme les acides biliaires, la bilirubine et les hormones thyroïdiennes. Plus récemment un impact de CAR sur des voies métaboliques fondamentales comme la néoglucogenèse, la lipogenèse et le métabolisme des lipoprotéines a été mis en évidence faisant de CAR au même titre que les récepteurs du groupe NR1 (LXR et FXR) une cible potentielle pour l'étude et le traitement du syndrome métabolique et des maladies cardio-vasculaires. Dans le cadre de ce mémoire nous avons étudié l'impact d'une stimulation chronique de CAR par un agoniste spécifique le TCPOBOP sur le transport reverse du cholestérol, le métabolisme des lipoprotéines et la susceptibilité à l'athérosclérose dans un contexte de surcharge alimentaire en cholestérol. Chez les souris dyslipidémiques déficientes pour le gène du récepteur aux lipoprotéines de faible densité (Ldlr-/-) ou bien déficientes pour l'apoprotéine E l'activation spécifique de CAR par l'agoniste TCPOBOP (3,3',5,5'-Tétrachloro-1,4-bis (pyridyloxy )benzene), 1) diminue la lipogenèse via l'induction du facteur Insig1 et la répression du facteur de transcription Srebp1c et de ses gènes cibles. Cela se traduit par une diminution de la triglycéridémie plasmatique associée à une diminution du contenu hépatique en triglycérides et une diminution de la sécrétion de lipoprotéines riches en triglycérides, 2) stimule la conversion et l'élimination fécale du cholestérol sous forme d'acides biliaires ce qui se traduit par une élimination accrue du cholestérol dérivé des HDL dans les fèces, dernière étape du transport reverse du cholestérol, 3) diminue le taux de cholestérol associé aux LDL chez les souris Ldlr-/- probablement par stimulation de l'expression hépatique du récepteur aux lipoprotéines de très basse densité. La diminution de l'athérogénicité du profil lipoprotéique et la stimulation du transport reverse du cholestérol sont associées à une réduction des lésions athéromateuses au niveau des valves et de la crosse aortique chez les souris Ldlr-/-. Une diminution des lésions athéromateuses uniquement au niveau de la crosse aortique est également observée chez les souris ApoE-/- L'ensemble des travaux présentés et les récentes études publiées suggèrent que CAR peut être considéré comme un acteur central du métabolisme lipidique et font de ce récepteur nucléaire une nouvelle cible potentielle pour l'étude et le traitement des désordres métaboliques comme le diabète, l'obésité, la stéatose hépatique et l'athérosclérose