Orientador : Prof. Dr. Ricardo Fernandez Perez / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Fisiologia. Defesa: Curitiba, 27/10/2017 / Inclui referências : f. 52-58 / Resumo: Alguns estudos já demonstraram que o estímulo do Receptor Sensível ao Cálcio Extracelular, o CaSR, é capaz de a secreção de prótons no néfron proximal e distal. Tendo em vista que a acidificação do fluido tubular no ducto coletor é fundamental para evitar a formação de cálculos, o objetivo deste trabalho foi investigar a interação do CaSR com o transporte de prótons num modelo de células intercalares do ducto coletor de mamíferos, as células MDCK C11 (Madin-Darby canine kidney cell). As células MDCK C11 foram cultivadas em meio MEM (Minimum Essential Medium) e suplementadas com 10% de SBF (Soro Bovino Fetal). A atividade bioquímica da H+-ATPasev, sensível a concanamicina 10-8 M, foi determinada por um método colorimétrico modificado do descrito por Fisk-Subarow. Alterações do cálcio intracelular foram determinadas por microscopia de fluorescência, utilizando-se o marcador FLUO-4 10 ?M. O agonista não específico de CaSR, gadolíneo 300 ?M, e o agonista específico de CaSR, R-568 0,5 e 1 ?M, incrementaram de forma significativa a atividade da H+-ATPasev em relação à atividade basal da bomba. O agonista não específico de CaSR, neomicina 200?M, incrementou a atividade da H+-ATPasev, de forma não significativa. Foi observado que o incremento do íon cálcio no meio extracelular estimulou a atividade da H+ - ATPasev de forma dose-dependente. O antagonista seletivo de CaSR, NPS 2143 150 nM, impediu o aumento da atividade da bomba promovido pelo Ca2+o 1 mM. O inibidor das fosfolipases A e C, U-73122 5x10-8 M, reverteu parcialmente o incremento na atividade da bomba observado na presença de gadolíneo 300 ?M. O ativador de proteína quinase C aumentou a atividade da H+-ATPasev em relação à basal, mas não de forma significativa. O agonista específico de CaSR, R-568 1 ?M, promoveu um aumento significativo do cálcio intracelular nas células MDCK C11, o qual persistiu mesmo com a depleção dos estoques intracelulares de Ca2+ com tapsigargina 0,1 ?M. Entretanto, na ausência de cálcio extracelular este aumento não foi observado, o que indica que o aumento do Ca2+ intracelular induzido pela ativação do CaSR é dependente da entrada de Ca2+ do meio extracelular. Destes resultados é possível concluir que o estímulo do CaSR num modelo de célula intercalar renal provoca um incremento na concentração intracelular de cálcio e na atividade bioquímica da H+-ATPasev, sugerindo uma possível interação entre o metabolismo de cálcio e os mecanismos de secreção de prótons nos túbulos renais. Palavras-chave: H+ -ATPase vacuolar; CaSR; células MDCK C11. / Abstract: Some studies have already shown that the stimulus of a Calcium-Sensing Receptor, CaSR, is able to increase protons secretions in proximal and distal nephron. Considering that fluid acidification in collecting duct is fundamental to avoid stone formation, the aim of this study was to investigate the interaction of CaSR with proton transport in a mammalian intercalated cell model, C11-MDCK (Madin-Darby canine kidney cell) cells. C11-MDCK cells were cultured in MEM (Minimum Essential Medium) and supplemented with 10% FBS (Fetal Bovine Serum).The concanamycin-sensitive activity of the H+ -ATPasev was determined by a colorimetric method modified of that described by Fisk-Subarow. Changes in intracellular calcium levels were determined by fluorescence microscopy using 10 ?M FLUO-4 dye. The non-specific CaSR agonist, gadolinium 300?M, and the specific CaSR agonist, 0,5 and 1 ?M R-568, increased significantly the activity of H+-ATPasev in relation to the basal activity of the pump. The non-specific CaSR agonist, 200 ?M neomycin, increased the activity of H+-ATPasev but not significantly. It was observed that the increase of extracellular calcium stimulated the activity of H+ -ATPasev in a dose-dependent manner. The selective CaSR antagonist, 150 nM NPS 2143, prevented the increase of pump activity promoted by 1 mM Ca2+. The phospholipase A and C inhibitor, 5x10-8 M U-73122, partially reversed the increase in pump activity observed in the presence of 300?M gadolinium. Protein kinase C activator increased the activity of H+-ATPasev relative to baseline, but not significantly. The specific CaSR agonist, R-568 1 ?M, promoted a significant increase of intracellular calcium in C11-MDCK cells, which persisted even with the depletion of intracellular Ca2+ stores with 0,1 ?M thapsigargin. However, in the absence of extracellular calcium this increase was not observed, which indicates that the increase of intracellular Ca2 + induced by CaSR activation is dependent on the input of Ca2+ from the extracellular medium Ca2+. From these results it can be concluded that the CaSR stimulus on a model of intercalated cells increase intracellular calcium concentration and biochemical activity of H+ -ATPasev, suggesting a possible interaction between calcium metabolism and the mechanisms of proton secretion in renal tubules. Keywords: vacuolar H+ -ATPase; CaSR; C11-MDCK cells.

Orientador : Anibal Eugenio Vercesi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T01:29:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Parentoni_LuciaSimas_M.pdf: 3253683 bytes, checksum: e4c19ae29c90e01d8c222332a71eb074 (MD5) Previous issue date: 1991 / Resumo: O Ca++ possui um efeito altamente deletério sobre mitocôndrias em diversas situações patológicas, envolvendo um processo de alteração de permeabilidade da membrana interna desta organela. Resultados prévios de nosso laboratório indicaram que esta permeabilização causada por Ca++ e oxidantes é devida à formação de ligações cruzadas entre grupamentos tiol de proteínas da membrana, com o aparecimento de agregados protéicos de alto peso molecular (FAGIAN, M;M.; PEREIRA DA SILVA, L.; MARTINS, I.S. & VERCESI, A. E. Membranas Protein Thiol Cross Linking Association with Permeabilization of the Inner Mitochondrial Membrane by Ca++ plus Prooxidants. Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Anibal Eugenio Vercesi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-09-11T20:50:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_RicardodeSouza_M.pdf: 4223365 bytes, checksum: 82e5b44995fcdb536317d9e0845feb37 (MD5) Previous issue date: 1992 / Resumo: Mitocôndrias do fígado de rato quando acumulam 'CA POT. 2+¿ na presença de um prooxidante como diamida ou t-butilhidroperóxido apresentam um inchamento de grande amplitude e colapso do potencial de menbrana ('delta¿'psi¿). trifluoperazina, um neuroléptico da classe dos fenotiazínicos, em concentrações (15 ¿ 45 'um¿M) as quais não inibem a respiração ou o influxo de 'CA POT. 2+¿ para a mitocôndria, protege significativamente esta organela contra os efeitos deletérios do cátion mais um prooxidante. Em contraste a isto, em concentrações mais altas do que que 100 'um¿M a droga potencializa estes efeitos deletérios do cálcio e prooxidantes e tem efeito de danificar per se a membrana mitocondrial interna. É proposto que a proteção conferida pela droga é mediada por mudanças na estrutura tridimensional de proteínas de menbrana e que isto acarrete diminuição da produção de agregados protéicos, interligados por pontes dissulfeto, que ocorrem quando suspensões mitocondriais acumulam cálcio sob condições de estresse oxidativo. É proposto também que estes agregados estejam relacionados com o fenômeno de lipoperoxidação, pois é observado que a droga protege contra os efeitos deletérios induzidos pelo complexo citrato-'FE POT. 2+¿. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Isolated rat liver mitochondria undrego extensive swelling and disruption of membrane potencial when they accumulate 'CA POT. 2+¿ in the presence of a prooxidant such as diamide or t-butylhydroperoxide. The phenothiazinic drug trifluoperazine, at concentrations (15-45 'mu¿M) which do not inhibit either respiration or the influx of 'CA POT. 2+¿ into mitochondria, significantly protects mitochondria against the deleterious effects of 'CA POT. 2+¿ and prooxidants and presents a damaging effect per se on the inner mitochondrial membrane. It is prosed that the protection conferred by the drug is mediated by changes in membrane proteins structure that decrease the production of protein thiol cross-linking that occurs when mitochondria accumulate calcium under oxidant stress conditions. It is also proposed that the protein aggregates are correlated with the lipid peroxidation, because it is observed that the drug protects against the deleterious effects induced by citrate-'FE POT. 2+¿ complex. ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador : Anibal Eugenio Vercesi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T19:14:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferraz_ValmirLauro_M.pdf: 4120238 bytes, checksum: d75b94495b9b93bd90a2e5e978d7dba5 (MD5) Previous issue date: 1988 / Resumo: Mitocôndrias de fígado de rato desenergizadas sofrem inchamento quando incubadas na presença de cálcio e um oxidante de nucleotídeos de piridina mitocondriais. Este inchamento é estimulado por fosfato e aumento da temperatura de incubação, e inibido por vermelho de rutênio, ATP+Mg2+ e dibucaína. O grau de inibição pela dibucaína varia inversamente com a concentração de cálcio. A inibição causada por vermelho de rutênio é eliminada completamente pela adição do ionóforo de cálcio ionomicina, indicando que o efeito do cátion é mediado por sítios internos de ligação. Visto que as mitocôndrias foram desenergizadas, os resultados indicam não há necessidade de movimento cíclico de cálcio através que da membrana neste mecanismo. Além disso, os resultados mostram que mitocôndrias de cérebro de rato, cuja fosfolipase A2 dependente de cálcio,é menor que 20% da de mitocôndrias de fígado, são bastante sensíveis aos efeitos deletérios do cálcio + fosfato ou oxidantes de NAD(P)H, sugerindo que a remoção de fosfolípideos da membrana, por esta enzima, não representa o fator mais significativo no mecanismo do inchamento. Um ponto de transição da temperatura em torno de 26 graus deve indicar ainda uma subordinação do mecanismo do inchamento à fluidez da membrana / Abstract: Deenergized rat liver mitochondria undergo extensive swelling when incubated in the presence of calcium plus an oxidant of mitochondrial pyridine nucleotide. This swelling is stimulated by phosphate and increasing incubation temperature, and is inhibited by ruthenium red, ATP plus Mg2+ and dibucaine. The degree of inhibition by dibucaine varies inversely with the calcium concentration. The inhibition caused by ruthenium red is completely eliminated by the addition of the calcium ionophore ionomycin indicating that the effect of the cation is mediated by internal binding sites. Since the mitochondria were deenergized the data definitely rule out the requirement for calcium cycling across the membrane in this mechanism. Furthermore, rat brain mitochondria whose Ca2+ dependent phospholipase A2 activity is less than 20% of that from liver, are very sensitive to the deleterious effects of calcium plus phosphate or NAD(P)H oxidants suggesting that the withdrawal of membrane phospho-lipids by this enzyme may not be the major factor in the swelling mechanism. A temperature transition value of 26 degress may still indicate a swelling mechanism-dependence membrane fluidity / Mestrado / Fisiologia e Biofisica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientadora : Profª. Drª. Flavia Sant'Anna Rios / Co-orientador : Prof. Dr. Francisco Filipak Neto / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 16/03/2012 / Inclui referências / Área de concentração : Biologia celular e molecular / Resumo: A água doce possui grande variedade de íons dissolvidos, os quais variam de acordo com a região, podendo afetar positivamente ou negativamente vários processos biológicos dos peixes, tais como sobrevivência e crescimento. Um desses minerais, o cálcio, é de particular importância à vários processos celulares e fisiológicos, além de estar relacionado com a diferenciação muscular (miogênese). Sendo o cálcio um potente sinalizador, diferentes concentrações deste íon (dissolvido na água) foram avaliadas na sobrevivência, crescimento e miogênese durante o desenvolvimento larval e pós-larval de Rhamdia quelen (Jundiá) à 26±1 °C. Para tanto, embriões desta espécie, obtidos por fertilização in vitro, foram incubados em diferentes tratamentos variando-se a concentração de Ca2+ (0, 3,63, 18,18 e 36,36 mg Ca2+/L. A sobrevivência foi avaliada através do percentual dos indivíduos que resistiram até a fase pós larval (7 e 15 dias). As taxas de crescimento relativo (RGR) e protéica específica (SGR) foram determinadas pelas variações da massa corporal e do conteúdo protéico total entre os períodos de eclosão e pós-larval (7 dias). A taxa de síntese protéica de larvas e pós-larvas foi avaliada pelo cálculo da razão RNA/Proteínas. A densidade muscular foi verificada com base na variação do número das fibras musculares por área. Na ausência de Ca2+ na água, as larvas sofreram grande mortalidade; porém, nas demais concentrações estudadas não houve diferença significativa entre elas. As concentrações de cálcio dissolvido na água testadas (3,63, 18,18 e 36,36 mg Ca2+/L) não provocaram alterações nos demais parâmetros avaliados em larvas de Rhamdia quelen. Entretanto, nas pós-larvas, a massa corporal apresentou uma correlação positiva com a concentração de cálcio dissolvido na água. O cálcio não causou alterações na concentração total de RNA e de proteínas, tanto em larvas, quanto em pós-larvas, entretanto a concentração total de RNA foi maior em pós-larvas com 7 dias (168 hpf) do em larvas (~24 hpf). A razão RNA/Proteínas das pós-larvas com 7 dias foi inversamente proporcional à concentração de cálcio, bem como à massa corporal, indicando que quanto maior a concentração de cálcio, maior a síntese protéica e maior a massa corporal. Entre o período larval e pós-larval, houve perda de massa corporal nos indivíduos incubados em 3,63 e 18,18 mg Ca2+/L e ganho de massa na concentração 36,36 mg Ca2+/L. Entre esses mesmos períodos, houve perda de massa protéica nos indivíduos incubados em 0 mg Ca2+/L, manutenção do conteúdo protéico em e 3,63 mg Ca2+/L e acúmulo de proteínas nas concentrações 18,18 e 36,36 mg Ca2+/L. Concluiu-se que a maior densidade de fibras musculares foi observada nos indivíduos com a maior massa corporal, que foram os animais expostos a 36,36 mg Ca2+/L, indicando que houve crescimento hiperplásico. Os resultados encontrados mostram que n ausência ou em baixas quantidades de cálcio, as pós-larvas de Rhamdia quelen sofrem degradação protéica e redução no crescimento, acarretando altas mortalidades. Porém nas maiores concentrações de cálcio, as larvas apresentam boa sobrevivência e melhor crescimento em massa e protéico, assim como melhor crescimento muscular. A melhor concentração de Ca2+ para a sobrevivência e crescimento de R. quelen é 36,36 mg Ca2+/L. Palavras-chave: Crescimento, Desenvolvimento larval, Dureza, Jundiá. Músculo. Qualidade da água. / Abstract: Freshwater has a large variety of dissolved ions, which vary according to region and can affect positively or negatively various biological processes of fish such as survival and growth. One of these minerals, calcium, is of particular importance for several cellular and physiological processes, besides being related to differentiation muscle (myogenic). Since calcium is a potent signalizer, different concentrations of this ion (dissolved in water) were measured in survival, growth and myogenesis during larval and post-larval development of Rhamdia quelen (Jundiá) at 26 ± 1 ° C. Embryos were obtained by in vitro fertilization and incubated in different treatments varying the concentration of Ca2+ (0, 3.63, 18.18, and 36.36 mg Ca2+/ L. The survival was assessed by percentage of individuals who have endured to the post larval stage (7 and 15 days). Relative (RGR) and specific protein (SGR) growth rates were determined by changes in body mass and total protein content between periods hatching larvae and post-larvae (7 days). The protein synthesis rate of larvae and post larvae was evaluated by calculating the ratio RNA / protein. The muscle density was checked based on the variation in the number of muscle fibers per area. In the absence of Ca2+ in water, the larvae suffer high mortality, but in the other concentrations studied there was no significant difference between them. Concentrations of dissolved calcium in the water tested (3.63, 18.18, and 36.36 mg Ca2+ / L) caused no changes in other parameters in larvae of R.quelen. However, in post-larvae, body mass was significantly correlated with the concentration of dissolved calcium in water. Calcium did not alter the total concentration of RNA and protein in both larvae or in post-larvae, however, the total concentration of RNA was higher in post-larvae on day 7 (168 hpf) of larvae (~ 24 hpf). RNA / proteins ratio of post-larvae on day 7 was inversely proportional to calcium concentration and body weight, indicating that the higher the concentration of calcium, the higher the protein synthesis and the greater the body weight. Among the post-larval and larval periods, body weight loss occurred in those incubated in 3.63 Ca2+ and 18.18 mg / L and mass gain in Ca2+ concentration 36.36 mg / L. Among these same periods, there was loss of protein mass in individuals incubated in Ca2+ 0 mg / L, keeping the content of protein and 3 63 mg Ca2+/ L and the concentration of protein accumulation 18.18 and 36.36 mg Ca2+/ L. Increased fiber density muscle was observed in the post-larvae with the higher body mass (36.36 mg Ca2+/ L), indicating hyperplasic growth. The results show that in the absence or low amounts of calcium, R. quelen post-larvae suffer protein degradation and reduced growth, resulting in high mortality. But the highest concentrations of calcium, the larval present good survival, better growth in mass and protein as well as better muscle growth. The best concentration of Ca2+ to the survival and growth of R. quelen Ca2+ is 36.36 mg / L. Keywords: Growth. Hardness. Jundiá. Larval development. Muscle.. Water quality