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[en] SOLID SUBSTRATE ROOM-TEMPERATURE PHOSPHORIMETRY FOR THE IRINOTECAN HYDROCHLORIDE DETERMINATION, ACTIVE PRINCIPLE OF INJECTABLE ANTI-CANCER DRUGS, AND TRACES OF CONTAMINANTS IN PHARMACEUTICAL FORMULATIONS CAMPTOTHECIN ANTI-CANCER / [pt] FOSFORIMETRIA NA TEMPERATURA AMBIENTE EM SUBSTRATO SÓLIDO PARA DETERMINAÇÃO DO CLORIDRATO DE IRINOTECANA, E TRAÇOS DO CONTAMINANTE CAMPTOTECINA EM FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS ANTICÂNCERPRISCILA MARIANA DA SILVA MAIA 16 May 2019 (has links)
[pt] Os derivados da camptotecina (CPT), irinotecana (CPT-11) e topotecana
(TPT) são usados para o tratamento do câncer, sendo a CPT um potencial
contaminante em medicamentos anticâncer a base de CPT-11 ou TPT. Neste
trabalho, a fosforimetria na temperatura ambiente em substrato sólido (SSRTP)
foi proposta como técnica analítica para a determinação do princípio ativo do
anticâncer injetável a base de CPT-11 e de traços do contaminante CPT em
formulações farmacêuticas anticâncer. As características fosforescentes dos dois
analitos foram estudadas de modo univariado em função de diversos parâmetros
experimentais, como o tipo e a quantidade de sal de átomo pesado indutor de
fosforescência, influência do valor do pH do tampão usado na solução do analito
e quantidade de surfactante modificador de superfície da celulose. Uma vez
definidos os fatores relevantes, o planejamento fatorial do tipo composto central
foi realizado para a determinação de traços do contaminante (CPT) com o intuito
de estudar os efeitos principais e as possíveis interações entre os fatores de
resposta visando à escolha da melhor condição experimental. As melhores
condições foram obtidas usando substratos de celulose contendo 332 microgramas de
TlNO3 (indutor da fosforescência) em solução carreadora contendo tampão
Britton-Robinson (pH 10,5). Para a CPT-11 a otimização foi realizada apenas
pela abordagem univariada, com as seguintes condições escolhidas: 662 microgramas de
Pb(NO3)2 em substratos de celulose contendo 577 microgramas de SDS. A CPT pôde ser
determinada seletivamente em matrizes contendo 40 vezes mais TPT, em
concentração, usando a determinação no ponto isodiferencial (367 nm) da
derivada de segunda ordem do espectro de excitação. Para matrizes contendo CPT-11,
esse desempenho foi mais limitado, pois a CPT só foi determinada seletivamente
em misturas contendo até 5 vezes mais CPT-11. Para cada uma das condições
selecionadas foram realizados estudos para obtenção dos parâmetros de
desempenho. Em ambos os casos, a resposta analítica teve comportamento
linear (homocedático) em função da massa de CPT ou de CPT-11 presentes no
substrato de celulose. Os limites de detecção e de quantificação absolutos ficaram na ordem do ng. Um estudo detalhado da estimativa da incerteza de
medição também foi realizado e a incerteza combinada associada à medição de
fosforescência da CPT foi de até 16 por cento. O método foi aplicado na quantificação de
CPT-11 em soluções injetáveis com 97,5 mais ou menos 5,5 por cento de recuperação e na
determinação de CPT em medicamentos a base de TPT (101,5 mais ou menos 3,5 por cento de
recuperação medindo em 367 nm do espectro de excitação após derivação de segunda
ordem) e nas matrizes urina (102,5 mais ou menos 3,5 por cento de recuperação) e saliva (102,5 mais ou menos 4,5 por cento de recuperação), ambas fortificadas com CPT e usando-se detecção em
570 nm do espectro de emissão de varredura normal. Testes comparativos entre
a SSRTP e a HPLC-DF foram realizados e os resultados foram satisfatórios para
um nível de 95 por cento de confiança. Uma comparação entre diferentes substratos foi
também realizada para avaliar requisitos práticos, variabilidade de sinal do
analito e do branco, o que indicou vantagens do substrato de nylon sobre o de
celulose. / [en] Irinotecan (CPT-11) and topotecan (TPT) are employed for cancer
treatment and camptothecin (CPT) is a potential contaminant in anti-cancer drugs
based on CPT-11 or TPT. In this work, solid substrate room-temperature
phosphorimetry (SSRTP) was proposed as analytical technique for the
quantification of CPT-11 in anti-cancer drugs and for the determination of traces
of CPT in CPT-11 and TPT based anti-cancer pharmaceutical formulations. The
phosphorescence characteristics of the analytes have been studied and
experimental conditions (type and amount of the heavy atom salts used to induce
phosphorescence, influence of the pH of the analyte carrier solution and the
amount of surface modifier) were optimized in an univariate way. For the method
aiming the determination of CPT, a further optimization using a central composite
design was made in order to identify the main effects and possible interactions
among factors. The best conditions had been achieved using cellulose substrate
containing 332 micrograms of TlNO3 (phosphorescence inducer) and analyte carrier
solution containing Britton-Robinson buffer (pH 10.5). For the CPT-11, best
conditions were achieved in cellulose substrates containing 577 micrograms of SDS and
662 micrograms of Pb(NO3)2 The selective determination of CPT could be performed in
samples containing a higher amount of TPT (40 times) if the signal measurement
is made at the isodifferential wavelength (367 nm) of the second derivative excitation
spectra. For samples containing CPT-11, selective determination of CPT could be
made in samples containing CPT-11/CPT molar proportion no higher than 5.
Parameters of merit have been obtained for both methods. Analytical responses
presented linear behavior in the in working range from the limit of quantification
up to at least 348.0 ng of CPT or 440.2 ng of CPT-11 (deposited in the center of
the substrate). Absolute limits of detection and quantification were 26.8 and 42.3
ng for CPT and 79.6 and 99.9 ng for CPT-11. A detailed metrological study was
performed for the measurement of CPT and the combined uncertainty associated
to the phosphorescence measurement was 16 percent. The method was applied for the
quantification of CPT-11 in injectable solutions with recovery of 97.5 more or less 5.5 percent. For
CPT, recovery in TPT based pharmaceutical formulation, previously fortified with
the analyte, was 101.5 more or less 3.5 percent (measurement made at 367 nm of the second
derivative excitation spectra). In analyte fortified urine and saliva, recoveries were
respectively 102.5 more or less 3.5 percent and 102.5 more or less 4.5 percent (using non-derived spectra and detention at 570 nm of the emission band). Comparative tests between the
SSRTP and HPLC-DF have been made and the results agreed (at a 95 percent
confidence level). A comparison using different substrates (nylon and cellulose)
was also performed in order to evaluate practical aspects, analyte signal intensity
and the variability of the analyte and blank signals. The result indicated
advantages in using nylon substrates for the phosphorimetric determination of
CPT.
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Vias de inibição da apoptose em macrófagos J774 infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi / Apoptosis inhibition pathways in J774 macrophages infected by Leishmania (L.) chagasiSouza, Edna Barbosa de 17 August 2006 (has links)
Macrófagos infectados com Leishmania são protegidos de apoptose, entretanto não se conhece o mecanismo de transdução de sinal intracelular que interfere neste processo de morte. Neste trabalho, células J 774 em cultura, com privação de nutrientes, sofrem apoptose, a qual aumenta na presença dos indutores camptotecina (CPT) ou fator de necrose tumoral recombinante (rTNF). Estas células quando infectadas com amastigotas ou promastigotas de Leishmania (L.) chagasi (5 parasitos/uma célula) são protegidas de apoptose. Avaliando as possíveis vias intracelulares envolvidas nesse processo, observamos que a privação de nutrientes altera o potencial de membrana da mitocôndria, havendo reversão com a infecção tanto com promastigotas e amastigotas, entretanto a reversão da alteração do potencial de membrana induzida por rTNF só foi observada com infecção com promastigotas. Tanto a atividade de caspase 3, como a detecção de caspase 3 clivada induzidas por H202 são revertidas com a infecção com promastigotas ou amastigotas. Quando analisamos a expressão de poli (ADP ribose) polimerase (PARP), em relação às células sem indução, a indução por CPT não levou ao aumento da PARP de 116 kDa, mas, aumento da banda de 24 kDA. Por outro lado, a infecção por amastigota de Leishmania (L.) chagasi em células J774 levou à diminuição da expressão de PARP de 116 kDa, mas aumento da de 24 kDa. Nas células infectadas por promastigotas de Leishmania (L.) chagasi, observamos uma diminuição da banda de 116 kDa, aparecimento de uma molécula de 89kDa e diminuição da expressão da de 24 kDa. Nas células sob indução por CPT, a infecção levou a resultados similares, exceto a diminuição da molécula de 24 kDa quando infectado por amastigota. Avaliando-se a influência da proteína do choque térmico de 83 kDa de Leishmania infantum, como possível fator que interferiria no processo de apoptose, observamos que a fagocitose de bactérias Escherichia coli (M15) contendo plasmídio com gene de HSP83 expressando essa proteína, leva a diminuição da apoptose nessas células, mesmo quando induzidas por CPT ou rTNF. Nossos dados mostram que a infecção de macrófagos J774 in vitro por Leishmania (L.) chagasi, interfere no processo de apoptose afetando diversas vias de sinalização intracelular de apoptose, tanto extrínsecas quanto intrínsecas, sendo que promastigota é mais efetiva em inibir apoptose nesta linhagem macrofágica. / Macrophages infected by Leishmania are protected from apoptosis, however the mechanism of intracellular signal transduction that interferes in this death process remains unknown. In this work, J774 cells in culture, under nutrient deprivation undergo apoptosis, which is increased in the presence of inducers: camptothecin (CPT) or recombinant tumoral necrosis factor (rTNF). These cells infected by amastigotes or promastigotes of Leishmania (L.) chagasi (5 parasites per cell) are protected from apoptosis. Evaluating the possible intracellular pathways involved in this process, we observed nutrient deprivation alters the mitochondrial membrane potential, reversed by both amastigote and promastigote infection, in contrast, mitochondrial membrane potential was altered by rTNF and it was reversed only by promastigotes. Both caspase 3 activity and caspase 3 cleavage detection induced by H2O2 are reversed with amastigote or promastigote infection. When we analysed the expression of poly (ADP-ribose) polymerase, related to no induced cells . CPT induction didnLt increase 116 kDa PARP, but increased a 24 kDa fragment. Otherwise, Leishmania (L.) chagasi amastigote infection in J774 cells decreased 116 kDa PARP, but increased a 24 kDa fragment. Incells infected by Leishmania (L.) chagasi , we observed a decrease of 116 kDa fragment, appearance of a 89 kDa fragment and a decreasing of a 24 kDa fragment. In the cells under CPT induction similar results were found, except a decreasing of a 24 kDa when infected by amastigote. Evaluating the Leishmania (L.) infantum Heat Shock Protein of 83 kDa, as a possible factor that interferes in the apoptosis process, we observed that a phagocytosis of Escherichia coli (M15) bacteria with a HSP83 gene within a plasmid expressing this protein induced by isopropyl β - D- tiogalactopiranosideo (IPTG), considerably diminished apoptosis in these cells even when induced by CPT or rTNF. Our data show that Leishmania (L.) chagasi infection in J774 macrophages in vitro notoriously interferes in the apoptosis process affecting several intracellular pathways involved in both extrinsic and intrinsic pathways, more prominently with promastigote in this macrophage cell lineage.
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Vias de inibição da apoptose em macrófagos J774 infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi / Apoptosis inhibition pathways in J774 macrophages infected by Leishmania (L.) chagasiEdna Barbosa de Souza 17 August 2006 (has links)
Macrófagos infectados com Leishmania são protegidos de apoptose, entretanto não se conhece o mecanismo de transdução de sinal intracelular que interfere neste processo de morte. Neste trabalho, células J 774 em cultura, com privação de nutrientes, sofrem apoptose, a qual aumenta na presença dos indutores camptotecina (CPT) ou fator de necrose tumoral recombinante (rTNF). Estas células quando infectadas com amastigotas ou promastigotas de Leishmania (L.) chagasi (5 parasitos/uma célula) são protegidas de apoptose. Avaliando as possíveis vias intracelulares envolvidas nesse processo, observamos que a privação de nutrientes altera o potencial de membrana da mitocôndria, havendo reversão com a infecção tanto com promastigotas e amastigotas, entretanto a reversão da alteração do potencial de membrana induzida por rTNF só foi observada com infecção com promastigotas. Tanto a atividade de caspase 3, como a detecção de caspase 3 clivada induzidas por H202 são revertidas com a infecção com promastigotas ou amastigotas. Quando analisamos a expressão de poli (ADP ribose) polimerase (PARP), em relação às células sem indução, a indução por CPT não levou ao aumento da PARP de 116 kDa, mas, aumento da banda de 24 kDA. Por outro lado, a infecção por amastigota de Leishmania (L.) chagasi em células J774 levou à diminuição da expressão de PARP de 116 kDa, mas aumento da de 24 kDa. Nas células infectadas por promastigotas de Leishmania (L.) chagasi, observamos uma diminuição da banda de 116 kDa, aparecimento de uma molécula de 89kDa e diminuição da expressão da de 24 kDa. Nas células sob indução por CPT, a infecção levou a resultados similares, exceto a diminuição da molécula de 24 kDa quando infectado por amastigota. Avaliando-se a influência da proteína do choque térmico de 83 kDa de Leishmania infantum, como possível fator que interferiria no processo de apoptose, observamos que a fagocitose de bactérias Escherichia coli (M15) contendo plasmídio com gene de HSP83 expressando essa proteína, leva a diminuição da apoptose nessas células, mesmo quando induzidas por CPT ou rTNF. Nossos dados mostram que a infecção de macrófagos J774 in vitro por Leishmania (L.) chagasi, interfere no processo de apoptose afetando diversas vias de sinalização intracelular de apoptose, tanto extrínsecas quanto intrínsecas, sendo que promastigota é mais efetiva em inibir apoptose nesta linhagem macrofágica. / Macrophages infected by Leishmania are protected from apoptosis, however the mechanism of intracellular signal transduction that interferes in this death process remains unknown. In this work, J774 cells in culture, under nutrient deprivation undergo apoptosis, which is increased in the presence of inducers: camptothecin (CPT) or recombinant tumoral necrosis factor (rTNF). These cells infected by amastigotes or promastigotes of Leishmania (L.) chagasi (5 parasites per cell) are protected from apoptosis. Evaluating the possible intracellular pathways involved in this process, we observed nutrient deprivation alters the mitochondrial membrane potential, reversed by both amastigote and promastigote infection, in contrast, mitochondrial membrane potential was altered by rTNF and it was reversed only by promastigotes. Both caspase 3 activity and caspase 3 cleavage detection induced by H2O2 are reversed with amastigote or promastigote infection. When we analysed the expression of poly (ADP-ribose) polymerase, related to no induced cells . CPT induction didnLt increase 116 kDa PARP, but increased a 24 kDa fragment. Otherwise, Leishmania (L.) chagasi amastigote infection in J774 cells decreased 116 kDa PARP, but increased a 24 kDa fragment. Incells infected by Leishmania (L.) chagasi , we observed a decrease of 116 kDa fragment, appearance of a 89 kDa fragment and a decreasing of a 24 kDa fragment. In the cells under CPT induction similar results were found, except a decreasing of a 24 kDa when infected by amastigote. Evaluating the Leishmania (L.) infantum Heat Shock Protein of 83 kDa, as a possible factor that interferes in the apoptosis process, we observed that a phagocytosis of Escherichia coli (M15) bacteria with a HSP83 gene within a plasmid expressing this protein induced by isopropyl β - D- tiogalactopiranosideo (IPTG), considerably diminished apoptosis in these cells even when induced by CPT or rTNF. Our data show that Leishmania (L.) chagasi infection in J774 macrophages in vitro notoriously interferes in the apoptosis process affecting several intracellular pathways involved in both extrinsic and intrinsic pathways, more prominently with promastigote in this macrophage cell lineage.
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