Memoria para optar el título de Bioquímico / Los sistemas biológicos de transducción de señales comparten mecanismos celulares conservados en diversos organismos. El estudio de los sistemas visuales de insectos, como el de la mosca Drosophila melanogaster, ha permitido comprender otros sistemas de transducción de señales así como el origen evolutivo de la visión en vertebrados. El modelo de Drosophila melanogaster es ampliamente utilizado gracias a la facilidad para realizar análisis genéticos y estudios funcionales. Cada ojo compuesto del sistema visual de Drosophila melanogaster, está constituido por aproximadamente 800 omatidios, los cuales a su vez están constituidos por ocho células fotorreceptoras. En ellas existe una especialización de la membrana celular que corresponde al rabdómero, donde ocurre el proceso de fototransducción. La cascada de fototransducción se inicia con la absorción de un fotón de luz por la rodopsina y termina con la activación de los canales TRP y TRPL, los cuales han sido identificados como los canales de la respuesta a la luz. La evidencia recopilada hasta la fecha, sugiere que el diacilglicerol (DAG) y los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) derivados de la metabolización del fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2) podrían ser los agonistas de los canales TRP. A pesar de los numerosos esfuerzos realizados en los últimos 20 años, la relación entre el mecanismo de activación de los canales TRP y los productos metabólicos de la vía de transducción de la fosfolipasa C (PLC), aún no está clara. La incorporación de PUFAs en una membrana lipídica altera el perfil de presiones internas de la bicapa e inducen cambios en su curvatura. Este fenómeno se observa cuando se incorporan moléculas diferentes a las que constituyen la membrana, y depende de parámetros como el largo y número de las insaturaciones de las cadenas alifáticas o el volumen y la carga de sus cabezas polares. Los canales mecanosensibles como TREK (“TWIK-related K+ channel”, canal de K+ relacionado con TWIK) y MscL (“mechanosensitive channel of large-conductance”, canales mecanosensibles de gran conductancia), los cuales son sensibles a lípidos, responden a estos estímulos de forma indirecta en respuesta a cambios en la tensión originados por la inclusión de lípidos en la membrana donde se aloja el canal. Con estos antecedentes, nos propusimos determinar si la activación de los canales TRP por los lípidos de membrana provenientes del metabolismo del PIP2, es función de su concentración y el número de insaturaciones en la cadena alifáticas. Para este estudio se realizaron ensayos electrofisiológicos en parches escindidos de membrana rabdomérica, obtenidos de omatidios parcialmente disociados. Se probó el efecto de los PUFAs derivados del metabolismo del DAG sobre las corrientes unitarias del canal TRP, considerando el largo de las cadenas y el número de insaturaciones. En un principio estudiamos el ácido linoleico (LA; 18:2), el ácido linolénico (LNA; 18:3) y el ácido araquidónico (AA; 20:4) debido a que estos tres lípidos poseen el mismo número de carbonos en la cadena alifática, pero se diferencian en el número de insaturaciones. De los resultados obtenidos, se observa un aumento en la actividad de los canales, que depende de la concentración de los PUFAs, así como una correlación entre el incremento del número de insaturaciones en la cadena alifática y el nivel de activación de los canales. A igual concentración de LNA (3 insaturaciones) se aprecia un mayor nPo (fracción de tiempo abierto para uno o más canales) que con LA (2 insaturaciones). Además, se observó una latencia en el inicio de la respuesta, al igual a lo que ocurre en la activación de canales mecanosensibles inducidos por lípidos. Para finalizar este estudio, se requiere de un mayor número de observaciones que permitan validar estadísticamente los resultados

Ingeniero en Biotecnología Molecular / TRPM4 es un canal catiónico no selectivo activado por Ca2+ intracelular, permeable a iones monovalentes tales como Na+ y K+. Se encuentra principalmente en los complejos de adhesiones focales (FAs) regulando la entrada de Ca2+, la dinámica de FA y migración celular. TRPM4 participa en diversos procesos fisiológicos tales como la activación de células T, vasoconstricción miogénica, muerte celular y proliferación, secreción de insulina, regulación de las dinámicas de adhesiones focales y migración celular. El nivel de expresión de TRPM4 se encuentra incrementado en eventos fisiopatológicos tales como daño espinal, episodios isquémicos y enfermedades neurodegenerativas. Además, datos no publicados de nuestro laboratorio sugieren que el silenciamiento del canal TRPM4 disminuye la invasión celular en células de melanoma in vitro y también favorece el proceso de metástasis in vivo. Por tanto, el estudio de los mecanismos de regulación de la expresión, tráfico y actividad de TRPM4 tienen una alta relevancia biomédica. En nuestro laboratorio, hemos demostrado que este canal interactúa con las proteínas End-Binding (EBs) a través de un motivo consenso “S/TxIP” localizado en el extremo amino terminal, regulando la exportación y el tráfico de los canales desde el retículo endoplásmico al Aparato de Golgi y a la membrana plasmática. Por otra parte, hemos generado péptidos que afectan competitivamente la interacción del canal TRPM4 con las proteínas EBs (EGFP-N-TRPM4WT), disminuyendo la disponibilidad del canal en la membrana plasmática. Se determinó que la competencia de la interacción TRPM4-EBs, disminuye significativamente el desensamblaje de las adhesiones focales, y en consecuencia a la invasión celular. xii Estos datos sugieren que la competencia de la interacción entre TRPM4 y EB puede constituir potenciales herramientas farmacológicas para ser usados como agente anti-metastásico, para su posterior uso en pacientes que padezcan de cáncer. / TRPM4 is a non-selective cationic channel, activated by intracellular Ca2+, permeable to monovalent ions such as Na+ and K+, which is mainly found in focal adhesions (FAs). On these complexes, TRPM4 regulates Ca2+ entry, FAs dynamics and cell migration. In addition, TRPM4 participates in several physiological processes such as T cell activation, myogenic vasoconstriction, cell death and proliferation, insulin secretion, regulation of FA dynamics and cell migration. On the other hand, it has been shown that their level of expression is increased in several pathophysiological events such as spinal damage, ischemic episodes and neurodegenerative diseases. Moreover, unpublished data from our laboratory suggest that TRPM4 silencing decreases the cellular invasion in melanoma cells and supresses the process of metastasis in vivo. Therefore, the study of the mechanisms of regulation of the expression, trafficking and activity of TRPM4 has high biomedical relevance. In our laboratory, we have demonstrated that TRPM4 channels interact with End-Binding proteins (EBs) through a “S/TxIP” consensus motif located at the amino terminus, regulating the exporting and trafficking of the channels from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus and the plasma membrane. Since TRPM4 channel would be regulated by the “SWIP” motif, we have generated peptides that competitively affect the interaction of the TRPM4 channel with the EBs proteins, decreasing the availability of the channel in the plasma membrane. The functional effect of this competition on cell invasion was determined by transwell chamber assays, and the effect of competition on the distribution of focal adhesion was determinated by immunofluorescence and confocal microscopy. xiv Finally, we determined that a cell penetrating peptide (TAT-N-TRPM4WT) reduces the invasion of A549 cells and also affect the number and the size of FA in both A549 and B16-F10 cell lines. These data suggest that the competition of the interaction between TRPM4 and EB proteins may constitute a potential pharmacological target to be used as an anti-metastatic agent. / diciembre 2018

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / TRPM4 es un canal catiónico no selectivo activado por Ca2+ intracelular, permeable a iones monovalentes tales como Na+ y K+. Se encuentra principalmente en los complejos de adhesiones focales (FAs) regulando la entrada de Ca2+, la dinámica de FA y migración celular. TRPM4 participa en diversos procesos fisiológicos tales como la activación de células T, vasoconstricción miogénica, muerte celular y proliferación, secreción de insulina, regulación de las dinámicas de adhesiones focales y migración celular. El nivel de expresión de TRPM4 se encuentra incrementado en eventos fisiopatológicos tales como daño espinal, episodios isquémicos y enfermedades neurodegenerativas. Además, datos no publicados de nuestro laboratorio sugieren que el silenciamiento del canal TRPM4 disminuye la invasión celular en células de melanoma in vitro y también favorece el proceso de metástasis in vivo. Por tanto, el estudio de los mecanismos de regulación de la expresión, tráfico y actividad de TRPM4 tienen una alta relevancia biomédica. En nuestro laboratorio, hemos demostrado que este canal interactúa con las proteínas End-Binding (EBs) a través de un motivo consenso “S/TxIP” localizado en el extremo amino terminal, regulando la exportación y el tráfico de los canales desde el retículo endoplásmico al Aparato de Golgi y a la membrana plasmática. Por otra parte, hemos generado péptidos que afectan competitivamente la interacción del canal TRPM4 con las proteínas EBs (EGFP-N-TRPM4WT), disminuyendo la disponibilidad del canal en la membrana plasmática. Se determinó que la competencia de la interacción TRPM4-EBs, disminuye significativamente el desensamblaje de las adhesiones focales, y en consecuencia a la invasión celular. Estos datos sugieren que la competencia de la interacción entre TRPM4 y EB puede constituir potenciales herramientas farmacológicas para ser usados como agente anti-metastásico, para su posterior uso en pacientes que padezcan de cáncer / TRPM4 is a non-selective cationic channel, activated by intracellular Ca2+, permeable to monovalent ions such as Na+ and K+, which is mainly found in focal adhesions (FAs). On these complexes, TRPM4 regulates Ca2+ entry, FAs dynamics and cell migration. In addition, TRPM4 participates in several physiological processes such as T cell activation, myogenic vasoconstriction, cell death and proliferation, insulin secretion, regulation of FA dynamics and cell migration. On the other hand, it has been shown that their level of expression is increased in several pathophysiological events such as spinal damage, ischemic episodes and neurodegenerative diseases. Moreover, unpublished data from our laboratory suggest that TRPM4 silencing decreases the cellular invasion in melanoma cells and supresses the process of metastasis in vivo. Therefore, the study of the mechanisms of regulation of the expression, trafficking and activity of TRPM4 has high biomedical relevance. In our laboratory, we have demonstrated that TRPM4 channels interact with End-Binding proteins (EBs) through a “S/TxIP” consensus motif located at the amino terminus, regulating the exporting and trafficking of the channels from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus and the plasma membrane. Since TRPM4 channel would be regulated by the “SWIP” motif, we have generated peptides that competitively affect the interaction of the TRPM4 channel with the EBs proteins, decreasing the availability of the channel in the plasma membrane. The functional effect of this competition on cell invasion was determined by transwell chamber assays, and the effect of competition on the distribution of focal adhesion was determinated by immunofluorescence and confocal microscopy. Finally, we determined that a cell penetrating peptide (TAT-N-TRPM4WT) reduces the invasion of A549 cells and also affect the number and the size of FA in both A549 and B16-F10 cell lines. These data suggest that the competition of the interaction between TRPM4 and EB proteins may constitute a potential pharmacological target to be used as an anti-metastatic agent.