L'activité électrique des neurones dépend de la l’expression et de l'activité des canaux ioniques, dont le canal de fuite de sodique récemment décrit, appelé NALCN. Dans les neurones, NALCN est un canal activé par un récepteur couplé aux protéines G qui conduit un courant de fuite de sodium résistant à la TTX et résistant à Cs + et contribue à la mise en place du potentiel de la membrane du repos. Chez l'homme, des mutations récessives et dominantes de NALCN ont récemment été décrites dans des troubles neurologiques complexes tels que la Dystrophie Neuroaxonale Infantile (syndrome INAD) et l'Arthrogryposis Distal de Type 2A (syndrome CLIFHADD). Ces troubles partagent des symptômes communs tels que l'ataxie, les crises épileptiques, l'hypotonie, le retard cognitif et le retard de développement. Les conséquences fonctionnelles de ces mutations NALCN ne sont toutefois pas connues principalement en raison de l'absence d'un modèle cellulaire reproductible pour réaliser une analyse électrophysiologique du courant NALCN. Dans la présente étude, nous décrivons les propriétés des canaux NALCN recombinants dans la lignée cellulaire neuronale, NG108-15. Ces cellules, qui expriment les sous-unités auxiliaires UNC79 et UNC80 de NALCN, ont été transfectées avec des constructions encodant NALCN (type sauvage ou mutants) et sa sous-unité NLF-1. Après la transfection du NALCN de type sauvage, les enregistrements par la technique de patch-clamp ont révélé la présence d'un courant de fuite entrant dans des cellules différenciées. A noter que la transfection des mutants CLIFHADD a entraîné l'expression d'un courant de fuite de sodium significativement plus élevé, comparé aux cellules exprimant des canaux NALCN de type sauvage. Au contraire, aucun courant de ce genre n'a été observé dans les cellules exprimant le mutant INAD. Ces résultats confirment fortement l'hypothèse selon laquelle les mutations dominantes CLIFHADD est un gain de fonction, alors que l'INAD est une mutation de perte de fonction. En conclusion, nos données démontrent que la lignée cellulaire NG108-15 est un modèle cellulaire fiable pour étudier l'activité électrophysiologique des canaux NALCN de type sauvage et mutant. / Electrical activity of neurons is critically dependent on the presence and activity of ion channels, including the recently described “sodium-leak channel” named NALCN. In neurons, NALCN is a G protein-coupled receptor-activated channel that conducts a TTX-resistant and Cs+-resistant sodium-leak current and contributes to setting-up the resting’s membrane potential. In humans, both recessive and dominant mutations of NALCN were recently described in complex neurological disorders such as Infantile Neuroaxonal Dystrophy (INAD) and Type 2A Distal Arthrogryposis (CLIFHADD). These disorders share common symptoms such as ataxia, epileptic seizures, hypotonia, cognitive delay and developmental retardation. The functional consequences of these NALCN mutations are however not known mainly because of the lack of a reliable cellular model to achieve electrophysiological analysis of the NALCN current. In the present study, we describe the properties of recombinant NALCN channels in the neuronal cell line, NG108-15. These cells, which express the NALCN’s ancillary subunits Unc79 and Unc80, were transfected with constructs encoding NALCN (wild-type or mutants) and its NLF-1 subunit. Following transfection of the wild-type NALCN, patch-clamp recordings revealed the presence of an inward background current in differentiated cells. Importantly, transfection of the CLIFHADD mutants resulted in the expression of a significantly larger sodium-leak current, compared to cells expressing wild-type NALCN channels. On the contrary, no such current was observed in cells expressing the INAD mutant. These results strongly support the hypothesis that CLIFHADD are gain-of-function, while INAD are loss-of-function mutations. Altogether, our data demonstrate that the NG108-15 cell line is a reliable cellular model to study electrophysiological activity of wild-type and mutant NALCN channels

Thèse en génétique cardiovasculaire / Introduction : Environ 30 000 Canadiens décèdent subitement dû à un trouble cardiaque structurel ou électrique. Près de 5% de ces décès demeurent inexpliqués. La prédisposition génétique est le facteur de risque principal de la fibrillation ventriculaire (FV), où les bases génétiques restent à être mieux définies, surtout chez les cas d’arrêt cardiaque inexpliqué. L’impact clinique des tests génétiques chez les cardiomyopathies et arythmies héréditaires, autres que pour le dépistage familial en cascade, demeure peu abordé dans la littérature. Durant les dernières années, l’accessibilité des bases de données publiques sur les variations génétiques populationnelles a explosé et notre habileté d’interpréter des variants génétiques s’est raffinée. Toutefois, pour des populations moins bien représentées dans ces bases de données, tout comme la population Canadienne-Française, l’interprétation des variants génétiques demeure imprécise. L’utilité de bases de données spécifiques à la population Canadienne-Française, pour améliorer l’interprétation des résultats génétiques cardiovasculaires, doit être évaluée. Hypothèses : 1) L’analyse génétique systématique par panels de gènes virtuels chez les patients suspectés d’être atteints d’arythmie ou de cardiomyopathie héréditaire et chez les survivants de morts subite cardiaque (MSC) inexpliquée fourni des informations utiles pour le diagnostic et le pronostic de ces patients, ainsi que pour le dépistage familial. 2) L'utilisation de bases de données de variations génétiques spécifiques à la population Canadienne-Française facilite l'interprétation des variants dans le contexte clinique de la génétique cardiovasculaire. Objectifs : L’objectif principal de ce projet de recherche est d’améliorer nos connaissances sur les facteurs génétiques impliqués chez la MSC par l’utilisation de séquençage nouvelle génération (séquençage d’exons) et d’évaluer l’impact clinique d’une analyse génétique systématique chez cette population de patients. Nous avons aussi l’intention d’évaluer l’utilité clinique des analyses génétiques et comprendre l’impact des variants récurrents impliqués dans les cardiomyopathies et arythmies héréditaires chez la population Canadienne-Française. Méthodes : Dans une première série d’études, nous avons évalué l’impact de l’analyse génétique systématique en effectuant un séquençage d’exomes systématique chez des survivants de MSC provenant d’une large cohorte internationale, incluant le registre et bio-banque canadien CASPER (Canadian Cardiac Arrest Survivors with Preserved Ejection fraction Registry - CASPER). Nous avons rapporté le taux diagnostic de ce type d’analyse génétique chez cette population et son utilité diagnostic. Nous avons procédé à une analyse par association cas-contrôle par l’utilisation de la base de données publiques gnomAD (Genome Aggregation Database – gnomAD) comme cohorte contrôle et l’algorithme RV-EXCALIBER (Rare Variant Exome CALIBration using External Repositories – RV-EXCALIBER) afin d’établir l’importante contribution du gène du récepteur ryanodine 2 (RYR2) chez l’arrêt cardiaque. Dans un deuxième temps, nous avons évalué le taux diagnostic et l’utilité clinique des tests génétiques chez les patients avec suspicion de cardiomyopathies et arythmies héréditaires vus au Centre de Génétique Cardiovasculaire (CGC) de l’Institut de Cardiologie de Montréal (ICM) entre les années 2006 et 2020. Grâce à ce jeu de données et aux récentes données populationnelles provenant de l’étude québécoise CARTaGENE, nous avons comparé la fréquence allélique des variants récurrents identifiés chez les cas comparés à celle des contrôles afin d’évaluer la pathogénicité de ces variants et leur contribution chez les cardiomyopathies chez les Canadiens-Français. Enfin, nous avons décrit l’implication d’un variant faux-sens dans le gène de la desmoplakine (DSP) chez une famille canadienne-française aux prises avec la cardiomyopathie arythmogène avec une prédominance de l’atteinte du ventricule gauche et avons réalisé une analyse cas-contrôle pour un domaine spécifique de la protéine afin d’identifier une région mutationnelle (« hot-spot ») dans le gène DSP. Résultats : Dans une première étude sur la génétique de la MSC, basée sur la cohorte CASPER qui incluaient 228 survivants de MSC, nous avons démontré un taux diagnostic de l’analyse génétique systématique de 10%. Essentiellement, l’analyse génétique systématique a permis d’augmenter le nombre de cas « expliqués » par les évaluations phénotypiques avancées de 9% à 18% lorsque combinée avec l’analyse génétique. Des 23 porteurs de variants causaux, 13 (57%) ont été identifiés avec un variant pathogénique associé à une cardiomyopathie en l’absence d’un diagnostic de cardiomyopathie, mettant en lumière le potentiel arythmogène des variants génétiques associés aux cardiomyopathies en absence de changements cardiaques structurels. Nous avons poursuivi cette première étude en effectuant un séquençage d’exomes chez des cas additionnels de survivants de MSC provenant, à la fois, du Canada (CASPER), de France et des Pays-Bas. Un total de 589 survivants de MSC, comprenant les 228 cas de la première étude, ont été inclus dans cette deuxième étude. Nous avons rapporté un taux de variants pathogéniques de 11,5% et un enrichissement significatif des variants rares dans le gène RYR2 observés chez les cas comparés aux contrôles de gnomAD (P=0.003). Ensuite, dans une étude rétrospective reflétant la réalité de la clinique en génétique cardiovasculaire et se basant sur 2062 probands suspectés d’être atteints de cardiomyopathies et d’arythmies héréditaires et vus au CGC de l’ICM, nous avons identifié un taux diagnostic global de l’analyse génétique de 24%. Plus précisément, nous avons identifié des taux diagnostics par condition spécifique allant de 6% pour les syndromes de mort subite cardiaque à 42% pour les cardiomyopathies. L’analyse génétique a démontré une implication clinique chez 8% des cas et ce au-delà du dépistage familial, incluant des changements de diagnostic et un raffinement du diagnostic avec un impact sur le suivi clinique. L’un des facteurs prédictifs d’une analyse génétique positive se résume en une histoire familiale positive pour la condition cardiaque testée (OR=3.1, P<2.2x10-16) et la MSC (OR=1.5, P=0.00023). Par ailleurs, nous avons identifié plusieurs variants récurrents (fondateurs) chez le sous-groupe de probands avec descendance Canadienne-Française, incluant trois variants causaux dans des gènes sarcomériques identifiés chez 76/589 (13%) des Canadiens-Français diagnostiqués avec une cardiomyopathie hypertrophique. Lorsque nous avons comparé la fréquence allélique des variants récurrents chez nos cas à celles présentes dans CARTaGENE, un total de 9 variants (17%) ont été reclassifiés, à savoir trois variants sont passés de variants de signification incertaine (VUS) à probablement pathogénique, un de probablement pathogénique à pathogénique et quatre variants de probablement pathogénique et pathogénique à VUS. Finalement, nous avons décrit un cas familial de cardiomyopathie arythmogène avec une prédominance de l’atteinte du ventricule gauche causé par un variant faux-sens jamais publié dans le gène DSP (p.Glu293Lys). Nous avons effectué une revue de littérature systématique des variants faux-sens dans le gène DSP suivi d’une analyse cas-contrôle en utilisant les bases de données publiques. Nous avons identifié une région mutationnelle dans le domaine de répétition de spectrine (« Spectrine repeat domain » – SRD) du gène DSP avec un enrichissement significatif des variants chez les cas comparés aux contrôles (P=0.004). Discussion/conclusion: La présente thèse met en lumière l’importance des tests génétiques chez les survivants de MSC et chez les cas avec suspicion de cardiomyopathies et arythmies héréditaires pour confirmer le diagnostic, guider le suivi des patients en plus de permettre le dépistage familial en cascade. Les analyses cas-contrôles ont permis de démontrer l’importance du rôle du gène RYR2 chez les arrêts cardiaques associés soit à la tachycardie ventriculaire polymorphique catécholaminergique (TVPC) ou au tout nouveau syndrome déficitaire du relâchement du calcium (SDRC). Comme nous l’avons démontré avec notre population principalement Canadienne-Française, il est important d’utiliser une cohorte de contrôle appariée à la population étudiée pour améliorer l’interprétation des variants génétiques en génétique cardiovasculaire. / Introduction: Every year, approximately 30,000 Canadians die suddenly due to structural or electrical heart disease, and 5% of these deaths remain unexplained. A major risk factor of cardiac arrest caused by ventricular fibrillation (VF) is genetic predisposition, the molecular bases of which remain to be better understood particularly in cases with unexplained cardiac arrest (UCA). The clinical impact of genetic testing in hereditary cardiomyopathies and arrhythmias, other than familial screening, remains unclear. In recent years, the availability of public databases of genetic variation across populations have improved our ability to better interpret genetic variants. For specific populations that are less well represented in such databases, including the French Canadian population, interpretation of genetic variants remains imperfect. The utility of population-specific data in French Canadians to aid interpretation of cardiovascular genetic testing remains to be established. Hypotheses: 1) Genetic testing in patients with suspected arrhythmia and cardiomyopathy and in survivors of UCA using virtual gene panels provides clinically useful diagnostic and prognostic information, in addition to guiding family screening. 2) The use of French Canadian specific genetic variation databases assists in variant interpretation in the clinical cardiovascular genetics setting. Aims: The main goal of this research project is to improve our knowledge about genetic factors involved in UCA using next generation sequencing techniques (Whole Exome Sequencing – WES) and to evaluate the clinical impact of a systematic genetic test in this population. We also intend to evaluate the clinical utility of genetic testing and to assess the impact of recurrent variants in the French-Canadian population. Methods: In a first set of studies, we assessed the clinical impact of systematic genetic testing, we performed systematic WES in UCA survivors in a large international cohort including the Canadian Cardiac Arrest Survivors with Preserved Ejection fraction Registry (CASPER). We reported the yield of genetic testing and systematically assessed its diagnostic utility. We performed case-control association analyses using publicly available control data from the Genome Aggregation Database (gnomAD) and the Rare Variant Exome CALIBration using External Repositories (RV-EXCALIBER) pipeline to establish the ryanodine receptor 2 gene (RYR2) as an important contributor to UCA. Next, we evaluated the diagnostic yield and clinical utility of genetic testing in patients with suspected inherited cardiomyopathies and arrhythmia in probands seen at the Montreal Heart Institute Cardiovascular Genetic Center from 2006 to 2020. Using this latter case dataset and recent sequencing data from the Quebec CARTaGENE cohort study, we compared allele frequencies of recurrent genetic variants found in cases vs. controls to explore the pathogenicity of such variants and their overall contribution to inherited cardiomyopathies in French-Canadians. Last, we further described a French-Canadian family affected by arrhythmogenic left ventricular cardiomyopathy due to a missense variant in the desmoplakin gene (DSP) and performed domain-specific case-control analyses in to identify a mutational hotspot in DSP. Results: A first study on genetics of UCA based on CASPER cohort included 228 UCA survivors and demonstrated a yield of systematic genetic testing of 10%. Importantly, systematic genetic testing increased the proportion of 'explained' cases from 9% only following advanced phenotyping to 18% when combining phenotyping with genetic testing. Of the 23 carriers, 13 (57%) were found with pathogenic variants associated with cardiomyopathy without a diagnosis of cardiomyopathy, highlighting the arrhythmogenic potential of cardiomyopathy gene variants even in the absence of diagnostic cardiac structural changes. We followed-up on this initial study and performed WES analyses in additional UCA cases from Canada, France and the Netherlands for a total of 589 UCA survivors from Europe and CASPER, reporting a yield of 11.5%, with a significant enrichment of rare variants in the RYR2 gene observed in cases vs. gnomAD controls (P=0.003). Next, in a retrospective real-life study of genetic testing in 2062 probands with arrhythmia or cardiomyopathy seen at the Montreal Heart Institute, we have identified a pathogenic or likely pathogenic variant in 490 (24%) globally, with indication-specific genetic testing yields ranging from 6% in sudden unexplained death to 42% in cardiomyopathies. Genetic testing had clinical implications beyond family screening in up to 8% of cases, including diagnostic changes, diagnostic refinement and implications on clinical management. Predictors of a positive genetic test include a positive family history of the condition (OR=3.1, P<2.2x10-16) and of sudden cardiac death (OR=1.5, P=0.00023). We identified several recurrent (founder) variants in the subset of probands of French Canadian ancestry, including 3 sarcomeric gene variants identified in 76/589 (13%) French Canadian probands with hypertrophic cardiomyopathy. When comparing the allele frequency of recurrent variants in our case cohort with those in CARTaGENE, 9 variants (17%) were re-classified: 3 variants of uncertain significance (VUS) reclassified to likely pathogenic, 1 likely pathogenic to pathogenic and 4 pathogenic/likely pathogenic to VUS. Last, we described a family with arrhythmogenic left ventricular cardiomyopathy caused by a previously unpublished missense variant in DSP (p.Glu293Lys). We performed a systematic review of the literature of missense variants in DSP followed by a case-control analysis using public databases and identified a mutational hotspot in the spectrin repeat domain of DSP with significant enrichment of variants in cases vs. controls (P=0.004). Discussion/conclusion: The present thesis highlights the importance of genetic testing in UCA survivors and in suspected cardiomyopathies and heritable arrhythmias to confirm diagnoses, guide patient management in addition to facilitating family screening. Case-control analyses highlight the important role of RYR2 in cardiac arrest linked to either catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) or the newly described Calcium release deficiency syndrome (CRDS). As exemplified by our predominantly French-Canadian population, we demonstrate the importance of the use of a proper population-matched control cohort to improve genetic variant interpretation in the clinical setting. Overall, our work highlights the mounting and crucial role of genetic testing in clinical arrhythmia and cardiomyopathy, whose impact on improving care of patients necessitates advanced multidisciplinary expertise, such as in specialized cardiogenetic clinics.