Submitted by Danielle Karla Martins Silva (danielle.martins@ufpe.br) on 2015-03-04T12:35:22Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO FINAL BIBLIOTECA.pdf: 2312814 bytes, checksum: 51c1cc0d02d51a0e19ab9d4ca343ac4d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-04T12:35:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO FINAL BIBLIOTECA.pdf: 2312814 bytes, checksum: 51c1cc0d02d51a0e19ab9d4ca343ac4d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / CNPq / As doenças neoplásicas representam um importante problema de saúde pública em países desenvolvidos e países em desenvolvimento. A quimioterapia e radioterapia deprimem o sistema imune do indivíduo predispondo-o a infecções fúngicas oportunistas. O desenvolvimento da infecção e o grau de lesão que esta provoca envolvem fatores de virulência produzidos pelo patógeno. Os objetivos desse estudo foram investigar a incidência de candidíases em portadores de neoplasias sólidas ou linfomas e a expressão dos fatores de virulência dos agentes etiológicos bem como analisar dados de importância epidemiológica. As amostras clínicas foram coletadas e processadas para exame direto, cultura e identificação dos agentes através das características morfológicas e fisiológicas e metodologia automatizada. A detecção da formação de biofilme foi realizada utilizando o método semi-quantitativo baseado na coloração e a atividade enzimática foi detectada em meios agarizados contendo diferentes substratos. Foram diagnosticados 18 casos de candidíases, sendo candidíase oral a mais prevalente e Candida albicans a espécie mais frequentemente isolada. Não foi possível estabelecer associação com a ocupação ou sexo dos pacientes. A faixa etária mais acometida foi 50 a 69 anos e o tratamento quimioterápico representou um importante fator para o desenvolvimento de candidíases. Sessenta e sete por cento dos agentes obtidos formaram biofilme e C. famata apresentou maior atividade proteásica e fosfolipásica. Esse trabalho possibilitou a avaliação de candidíase em portadores de neoplasias sólidas ou linfomas, abordando os fatores de virulência.

As leveduras de Candida spp. fazem parte da microbiota humana, entretanto podem causar tanto micoses superficiais quanto sistêmicas. As opções terapêuticas para as candidíases incluem três principais classes, os agentes poliênicos, azólicos e equinocandinas; no entanto, a maioria deles apresentam desvantagens de toxicidade e/ou farmacocinética, custos relativamente altos e aumento de isolados resistentes aos antifúngicos. A miltefosina (MFS), um composto alquilfosfocolina, é atualmente usada no tratamento de câncer de mama e de leishmanioses. Estudos prévios apontam a MFS como potencial alternativa para o tratamento das infecções fúngicas, porém possui elevada toxicidade. Dessa forma, este trabalho visa avaliar alternativas para o tratamento de candidíases. MFS e seus análogos sintéticos; nanopartículas de alginato e microemulsões como sistemas de liberação de MFS e/ou anfotericina B (AMB) foram avaliados quanto a atividade antifúngica in vitro e in vivo usando modelos de Galleria mellonella e modelo murino de candidíase vaginal. Dos análogos estruturais da MFS o composto 1 foi o mais ativo, apresentando efeito fungicida de maneira dose e tempo dependente; com a presença de ergosterol exógeno os valores de CIM de MFS e do composto 1 aumentam quando a concentração de ergosterol aumenta no meio de cultura, sugerindo que MFS e o composto 1 possam interagir com o ergosterol resultando em alteração da permeabilidade de membrana. Em ensaios de susceptibilidade in vitro a MFS livre foi mais efetiva que a MFS incorporada em nanopartículas de alginato (MFS.Alg) para todas as cepas de Candida spp. testadas. Em contrapartida, larvas de G. mellonella infectadas com C. albicans (SC 5314 ou IAL-40) foram protegidas da infecção quando tratadas com MFS.Alg (100 mg/Kg) em que houve redução das taxas de mortalidade e de morbidade, bem como redução da carga fúngica e do processo de filamentação do fungo. A AMB e a MFS foram efetivas no modelo larvário em doses de 1 e 20 mg/kg, respectivamente. Importantemente, a MFS em nanocarreador de alginato foi menos tóxica quando comparado com a sua forma livre. Adicionalmente, microemulsões (ME) foram produzidas para a incorporação de AMB e MFS. A formação de um sistema monofásico semelhante a um gel é visualizada com absorção de água após 4 horas de incubação em que agregados bem estruturados são formados indicando a fase hexagonal. Em modelo murino de candidíase vaginal as formulações de AMB e MFS em sistemas de liberação [MFS.Alg (1x), MFS-ME (3x), AMB-ME (3x)] foram comparadas com a formulação em creme [MFS-CR (6x) e AMB-CR (6x)], e todas foram capazes de reduzir a carga fúngica do tecido vaginal, porém as formulações em sistema de liberação foram as mais vantajosas comparadas com a formulação em creme tendo em vista a redução do custo e do número de aplicações levando a maior comodidade do paciente durante o tratamento da candidíase vaginal. Os resultados obtidos mostram dentre os análogos da MFS o Composto 1 foi o que melhor apresentou atividade antifúngica; e que a AMB e/ou MFS incorporadas em sistemas de liberação controlada (nanopartículas de alginato e microemulsões) foram capazes de reduzir efeitos colaterais (no caso da MFS) e de reduzir a carga fúngica nos tecidos infectados, podendo ser alternativas terapêuticas para o tratamento das candidíases. / The yeasts of Candida spp. are part of the human microbiota; however, they can cause both superficial and systemic mycoses. Therapeutic options for candidiasis include three main classes, polyenes, azoles and echinocandins; however, most of them exhibit disadvantages of toxicity and/or pharmacokinetics, relatively high costs and increase of antifungal resistant isolates. Miltefosine (MFS), an alkylphosphocholine compound, is currently used in the treatment of breast cancer and leishmaniasis. Previous studies indicate MFS as an alternative potential for the fungal infections treatment, but it has high toxicity. Thus, this study aims to evaluate alternatives for the treatment of candidiasis. MFS and its synthetic analogs; alginate nanoparticles and microemulsions such as release systems for MFS and / or amphotericin B (AMB) were evaluated for antifungal activity in vitro and in vivo using Galleria mellonella model and murine model of vaginal candidiasis. Among the analogs of MFS, compound 1 was the most active, showing a fungicidal effect in a dose-dependent manner; with the presence of exogenous ergosterol the MIC values of MFS and compound 1 increase when the concentration of ergosterol increases in the culture medium, suggesting that MFS and compound 1 may interact with ergosterol resulting in an altered membrane permeability. In vitro susceptibility assays the free MFS was more effective than the MFS incorporated in alginate nanoparticles (MFS.Alg) against all strains of Candida spp. tested. In contrast, C. albicans-infected G. mellonella larvae (SC 5314 or IAL-40) were protected from infection when treated with MFS.Alg (100 mg/kg) in which mortality and morbidity rates were reduced, as well as reduction of the fungal load and filamentation. AMB and MFS were effective in the larval model at doses of 1 and 20 mg/kg, respectively. Importantly, MFS in alginate nanocarrier was less toxic when compared to its free form. In addition, microemulsions (ME) were produced for the incorporation of AMB and MFS. The formation of a single-phase gel-like system is visualized with water absorption after 4 hours of incubation in which well-structured aggregates are formed indicating the hexagonal phase. In the murine model of vaginal candidiasis, formulations of AMB and MFS incorporated in release systems [MFS.Alg (1x), MFS-ME (3x), AMB-ME (3x)] were compared with the cream formulation [MFS-CR 6x) and AMB-CR (6x)], and all formulations were able to reduce the fungal load of vaginal tissue, but the release-system formulations were the most advantageous compared to the cream formulation in order to reduce the cost and number of applications leading to greater patient comfort during the treatment of vaginal candidiasis. The results obtained show that among the analogs of MFS, compound 1 was the one that presented the best antifungal activity; and that AMB and/or MFS incorporated in controlled release systems (alginate nanoparticles and microemulsions) were able to reduce side effects (in the case of MFS) and reduce fungal load in infected tissues, and they could be therapeutic alternatives for treatment of the candidiasis.

In the present study, it was assessed antifungal activity of different essential oils obtained from plants traditionally used as condiments, against Candida isolates proven to be susceptible and resistant to the antifungal agent fluconazole. In this context, partial and total minimal concentration values, MICP e MICT, respectively, as well as minimal fungicidal concentration (MFC) of essential oils against different species of Candida were determined. In addition, it was evaluated minimal concentrations of oils that could inhibit germ tube formation by fluconazole susceptible and resistant isolates of C. albicans and C. dubliniensis. Candida species used in this study were: Candida albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis, C. glabrata and C. krusei. The essential oils were obtained from: Cinnamomum zeylanicum Breyn (cinnamon), Lippia graveolens HBK (Mexican oregano), Ocimum basilicum L. (basil), Origanum vulgare L. (oregano), Rosmarinus officinalis L. (rosemary), Salvia officinalis L. (sage), Thymus vulgaris L. (thyme) and Zingiber sp. (ginger). The methodology used was broth microdilution, according to M27-A2 document provided by National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2002). In order to assess inhibition of germ tube formation by essential oils, it was used the synthetic medium Phase M. Chemical composition of essential oils was obtained through gas chromatography-mass spectroscopy (GC-MS) and through calculation of retention index (RI). Results of antifungal activity tests were analyzed through Mann Whitney statistic test. Subsequently, it was noticed that basil, rosemary and sage essential oils did not show antifungal activity against Candida isolates on tested concentrations. However, cinnamon, Mexican oregano, oregano, thyme and ginger essential oils showed different levels of antifungal activity, being oregano oil the most potent and ginger oil the least efficient. Considering the extended spectrum of antifungal activity presented by these essential oils, it was noticed that similar concentrations could inhibit fungal growth or be fungicidal to isolates originally sensible and resistant to fluconazole. Besides, some oils also demonstrated moderate activity against Candida species which naturally show high fluconazole MICs, such as C. glabrata e C. krusei. All the essential oils inhibited germ tube formation, being oregano oil the most active and rosemary oil the least one. The majoritary constituents in the essential oils were: Z-isoeugenol (93,3%) for cinnamon; carvacrol (56,8%) and o-cymene (32,2%) for Mexican oregano; linalool (32,22%) and 1,8-cineole (23,61%) for basil; carvacrol (92,6%) for oregano; 1,8-cineole (28,59%) and camphor (26,31%) for rosemary; cis-thujone (40,61%) for sage; g-terpinene (64%) for thyme; and zingiberene (20,81%) for ginger essential oil. In conclusion, these results made possible evidencing that Candida spp isolates which are resistant to fluconazole, except for some particularities, were sensible to essential oils that demonstrated antifungal activity. / No presente estudo avaliou-se a atividade antifúngica de diferentes óleos essenciais obtidos de plantas tradicionalmente utilizadas como condimentos, frente a isolados de Candida comprovadamente sensíveis e resistentes ao fluconazol. Para tanto, determinou-se a concentração inibitória mínima parcial e total, CIMP e CIMT, respectivamente, bem como a concentração fungicida mínima (CFM) frente as diferentes espécies de Candida. Também foi avaliada a concentração mínima de óleo capaz de inibir a formação de tubos germinativos (CIMTG) em C. albicans e C. dubliniensis sensíveis e resistentes ao fluconazol. As espécies de Candida utilizadas na pesquisa incluíram: Candida albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis, C. glabrata e C. krusei. Os óleos essenciais testados foram obtidos de: Cinnamomum zeylanicum Breyn (canela), Lippia graveolens HBK (orégano mexicano), Ocimum basilicum L. (manjericão), Origanum vulgare L. (orégano), Rosmarinus officinalis L. (alecrim), Salvia officinalis L. (sálvia), Thymus vulgaris L. (tomilho) e Zingiber sp. (gengibre). A metodologia empregada foi a microdiluição em caldo, de acordo com o documento M27-A2 do National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2002). Para avaliar a inibição da formação de tubos germinativos pelos óleos essenciais, utilizou-se o meio sintético Fase M. A composição química dos óleos essenciais foi obtida através de cromatografia gasosa acoplada a um espectrômetro de massas (CG-EM) e através do cálculo do índice de retenção (IR). Os resultados encontrados para os testes de atividade antifúngica foram analisados através do teste estatístico de Mann Whitney. Diante disto, observou-se que os óleos essenciais de manjericão, alecrim e sálvia não evidenciaram atividade antifúngica frente aos isolados de Candida nas concentrações testadas. Entretanto, os óleos essenciais de canela, orégano mexicano, orégano, tomilho e gengibre demonstraram diferentes níveis de atividade antifúngica, sendo o óleo de orégano o mais potente, e o de gengibre, o de menor atividade. Em adição ao amplo espectro de atividade antifúngica dos óleos essenciais citados, observou-se que concentrações semelhantes de óleo essencial foram capazes de inibir o crescimento fúngico ou de serem fungicidas para isolados originalmente sensíveis e resistentes ao fluconazol. Além disso, alguns dos óleos também demonstraram moderada atividade contra espécies de Candida que naturalmente apresentam elevadas CIMs ao fluconazol, tais como C. glabrata e C. krusei. Todos os óleos essenciais inibiram a formação de tubos germinativos, havendo destaque para o de orégano, e menor inibição pelo óleo de alecrim. Os constituintes majoritários presentes nos óleos essenciais foram: Z-isoeugenol (93,3%) para a canela; carvacrol (56,8%) e o-cimeno (32,2%) para orégano mexicano; linalol (32,22%) e 1,8-cineol (23,61%) para o manjericão; carvacrol (92,6%) para o orégano; 1,8-cineol (28,59%) e cânfora (26,31%) para o alecrim; cis-tujona (40,61%) para a sálvia; g-terpineno (64%) para o tomilho; e zingibereno (20,81%) para o óleo essencial de gengibre. Em conclusão, os resultados permitiram constatar que Candida spp resistentes ao fluconazol, respeitadas algumas particularidades, foram sensíveis aos óleos essenciais que evidenciaram atividade antifúngica.