O carcinoma mucoepidermóide de pulmão, um tipo histológico que deriva das glândulas mucosas traqueobrônquicas, manifesta-se com sintomas obstrutivos e tende a comprometer a traqueia. Com finalidade curativa ou paliativa da doença, atualmente há uma forte tendência na oncologia em desenvolver estratégias terapêuticas que visam à administração de compostos com elevado potencial de otimizar o efeito do tratamento com a radiação ionizante, de modo a aumentar a morte de células tumorais e preservar íntegras as células dos tecidos sadios adjacentes. A intensa busca por tais estratégias evidenciou resultados promissores apresentados pelo composto denominado Resveratrol (3,4,5-trihidroxiestilbeno), tornando-o amplamente divulgado e alvo de intensas pesquisas. O principal objetivo do presente estudo foi determinar o efeito do resveratrol em cultura celular de carcinoma mucoepidermóide de pulmão exposta a diferentes doses de radiação ionizante. Para tal, os estudos de citotoxicidade utilizando o método de incorporação do vermelho neutro, e da determinação da dose letal 50 % (DL50) da radiação ionizante, foram realizados em cultura de células da linhagem NCI-H292 [H292] (ATCC® CRL-1848TM), CCIAL069. Com base nos resultados do IC50% (401,5 μM) e da DL50 (693 Gy) foram realizados o teste in vitro do micronúcleo e os ensaios para avaliar o efeito do resveratrol no ciclo celular, reparo da lesão no DNA e processo de lesão radioinduzida, necrose e apoptose celular. Os resultados evidenciaram que o resveratrol na concentração de 30 μM apresenta uma importante capacidade em promover danos às células NCI-H292 após 24 h da irradiação. / Mucoepidermoid lung carcinoma is a histological type that derives from the tracheobronchial mucous glands. It is manifested by trachea symptoms. Curative or palliative purpose for the disease, nowadays presents a strong oncology tendency to develop therapeutic strategies aimed at the administration of high potential compounds to improve the ionizing radiation treatments, so as to increase the radiation effects on tumor cells while minimizing these effects to surrounding normal tissues. The intensive search for such strategies showed promising results by the compound called Resveratrol, making it widely available and subject of many studies. The main of this study was to determine in vitro resveratrol effect in mucoepidermoid lung carcinoma cells NCI-H292 [H292] (ATCC® CRL-1848TM), CCIAL069, exposed to ionizing radiation doses. For this purpose, there were performed in vitro cytotoxicity studies by neutral red uptake assay, as well as the lethal dose 50 % (LD50) of ionizing radiation. On the basis of the IC50% (401.5 μM) and LD50 (693 Gy) results, there were performed in vitro micronucleus test and other tests in order to evaluate the cell cycle, repair and injury processes, cellular apoptosis and necrosis inductions. The results showed that resveratrol in 30 μM concentrations showed an important capability to injury NCI-H292 cells after 24 h of irradiation.

O carcinoma mucoepidermóide de pulmão, um tipo histológico que deriva das glândulas mucosas traqueobrônquicas, manifesta-se com sintomas obstrutivos e tende a comprometer a traqueia. Com finalidade curativa ou paliativa da doença, atualmente há uma forte tendência na oncologia em desenvolver estratégias terapêuticas que visam à administração de compostos com elevado potencial de otimizar o efeito do tratamento com a radiação ionizante, de modo a aumentar a morte de células tumorais e preservar íntegras as células dos tecidos sadios adjacentes. A intensa busca por tais estratégias evidenciou resultados promissores apresentados pelo composto denominado Resveratrol (3,4,5-trihidroxiestilbeno), tornando-o amplamente divulgado e alvo de intensas pesquisas. O principal objetivo do presente estudo foi determinar o efeito do resveratrol em cultura celular de carcinoma mucoepidermóide de pulmão exposta a diferentes doses de radiação ionizante. Para tal, os estudos de citotoxicidade utilizando o método de incorporação do vermelho neutro, e da determinação da dose letal 50 % (DL50) da radiação ionizante, foram realizados em cultura de células da linhagem NCI-H292 [H292] (ATCC® CRL-1848TM), CCIAL069. Com base nos resultados do IC50% (401,5 μM) e da DL50 (693 Gy) foram realizados o teste in vitro do micronúcleo e os ensaios para avaliar o efeito do resveratrol no ciclo celular, reparo da lesão no DNA e processo de lesão radioinduzida, necrose e apoptose celular. Os resultados evidenciaram que o resveratrol na concentração de 30 μM apresenta uma importante capacidade em promover danos às células NCI-H292 após 24 h da irradiação. / Mucoepidermoid lung carcinoma is a histological type that derives from the tracheobronchial mucous glands. It is manifested by trachea symptoms. Curative or palliative purpose for the disease, nowadays presents a strong oncology tendency to develop therapeutic strategies aimed at the administration of high potential compounds to improve the ionizing radiation treatments, so as to increase the radiation effects on tumor cells while minimizing these effects to surrounding normal tissues. The intensive search for such strategies showed promising results by the compound called Resveratrol, making it widely available and subject of many studies. The main of this study was to determine in vitro resveratrol effect in mucoepidermoid lung carcinoma cells NCI-H292 [H292] (ATCC® CRL-1848TM), CCIAL069, exposed to ionizing radiation doses. For this purpose, there were performed in vitro cytotoxicity studies by neutral red uptake assay, as well as the lethal dose 50 % (LD50) of ionizing radiation. On the basis of the IC50% (401.5 μM) and LD50 (693 Gy) results, there were performed in vitro micronucleus test and other tests in order to evaluate the cell cycle, repair and injury processes, cellular apoptosis and necrosis inductions. The results showed that resveratrol in 30 μM concentrations showed an important capability to injury NCI-H292 cells after 24 h of irradiation.

Carcinoma mucoepidermóide (CME) é o tumor maligno de glândulas salivares mais comum, representando cerca de 30% dos tumores malignos. O tratamento do CME é a ressecção cirúrgica com eventual radioterapia. Assim, o tratamento do CME pode levar a varias complicações estéticas e funcionais. A quimioterapia tem sido utilizadas apenas em casos recorrentes ou com metástases à distancia. Vários relatos na literatura tem mostrado que o tratamento com drogas isoladas ou combinadas possuem uma resposta insatisfatória e de curta duração em grande parte devido a aquisição de resistência a quimioterapia. Recentemente, a quimiorresistência tem sido relacionada com a presença de Células-Tronco Tumorais (CTT). Essa resistência tem sido associada ao fato de que as essa células são quiescentes e possuem altos níveis de proteínas associadas ao reparo do DNA e baixos níveis das proteínas que levam a apoptose. Recentemente mostrou-se que a resistência a quimioterapia tem sido relacionada com modificações de histonas, uma vez que as células quimiorresistentes possuem núcleo pequeno e baixos níveis de acetilação de histonas, adicionalmente as células sensíveis são relacionadas com núcleo aumentado. O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos do tratamento com IHDAC e cisplatina sobre a população de CTT de CME. Inicialmente analisamos os níveis de acetilação do histona através da expressão imuno-histoquímica de acetil histona H3 em casos de CME, sendo encontrado altos níveis de acetilação de histona principalmente nas células epiteliais do ducto excretor. Adicionalmente, demonstramos que o tratamento com SAHA (inibidor de histona deacetilase) impacta diretamente a população de CTT, de uma maneira mais eficiente do que a cisplatina ou da combinação de SAHA e cisplatina. É interessante que o tratamento com cisplatina resultou no acúmulo de uma subpopulação especifica de CTT em um processo que inclui o aumento na expressão da via de sinalização do mTOR. Estes achados sugerem que o uso de IHDAC constitui uma forma eficiente de tratamento de CME através da depleção da população de CTT , porém mais estudos são necessários para validar estes achados para uso clinico. / Mucoepidermoid carcinoma (MEC) is the most common malignant salivary tumor compromising about 30% of all salivary malignances. Managing MEC patients remain challenging especially due to the heterogeneous response of tumor cells to available therapy. For this reason clinical outcome remains unpredictable. Current treatment of MEC encompasses surgical resection with eventual adjuvant radiotherapy, which frequently leads to functional and aesthetic complications. The use of chemotherapy is often reserved for recurrent and metastatic tumors. Administration of single-agent or combination therapy has showed activity, however overall response rates are unsatisfactory and of short duration. Emerging evidences suggest that the modest response of tumor cells to therapy resulting in high recurrence rates and poor survival, are associated with the presence of cancer stem cells (CSC). Quiescence of CSC is achieved by the reduced levels of transcription in a process that requires tight folding of DNA driven by core histone proteins. Changes in DNA folding are responsible for different cellular phenotypes mediated by a cell type-specific chromatin organization. Of interest, we also found that acetylation of HNSCC tumor histones driven by histone deacetylase (HDAC) inhibitors abrogate tumor resistance to chemotherapy. We investigate the effects of HDACi and cisplatin in the population of CSCs of MEC. Initially, we found that MEC tumors are composed by a heterogeneous population of squamous-like and mucous-like cells presenting distinct acetylation levels of histone 3 (Lys9). Tumor cells where treated with cisplatin and SAHA, a Food and Drug Administration (FDA) approved histone deacetylase inhibitor. Surprisingly, we found that administration of SAHA resulted in complete depletion of MEC CSCs. In facts, SAHA alone surpassed the inhibitory therapeutic effects of cisplatin and the combined therapy using SAHA and cisplatin over the population of CSCs. We also found that administration of cisplatin to MEC tumor cells result in unexpected accumulation of a sub population of CSC (paraclones), suggesting a correlation between the administration of intercalating agents such as cisplatin to the development of resistance of MEC cells to chemotherapy.

Carcinoma mucoepidermóide (CME) é o tumor maligno de glândulas salivares mais comum, representando cerca de 30% dos tumores malignos. O tratamento do CME é a ressecção cirúrgica com eventual radioterapia. Assim, o tratamento do CME pode levar a varias complicações estéticas e funcionais. A quimioterapia tem sido utilizadas apenas em casos recorrentes ou com metástases à distancia. Vários relatos na literatura tem mostrado que o tratamento com drogas isoladas ou combinadas possuem uma resposta insatisfatória e de curta duração em grande parte devido a aquisição de resistência a quimioterapia. Recentemente, a quimiorresistência tem sido relacionada com a presença de Células-Tronco Tumorais (CTT). Essa resistência tem sido associada ao fato de que as essa células são quiescentes e possuem altos níveis de proteínas associadas ao reparo do DNA e baixos níveis das proteínas que levam a apoptose. Recentemente mostrou-se que a resistência a quimioterapia tem sido relacionada com modificações de histonas, uma vez que as células quimiorresistentes possuem núcleo pequeno e baixos níveis de acetilação de histonas, adicionalmente as células sensíveis são relacionadas com núcleo aumentado. O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos do tratamento com IHDAC e cisplatina sobre a população de CTT de CME. Inicialmente analisamos os níveis de acetilação do histona através da expressão imuno-histoquímica de acetil histona H3 em casos de CME, sendo encontrado altos níveis de acetilação de histona principalmente nas células epiteliais do ducto excretor. Adicionalmente, demonstramos que o tratamento com SAHA (inibidor de histona deacetilase) impacta diretamente a população de CTT, de uma maneira mais eficiente do que a cisplatina ou da combinação de SAHA e cisplatina. É interessante que o tratamento com cisplatina resultou no acúmulo de uma subpopulação especifica de CTT em um processo que inclui o aumento na expressão da via de sinalização do mTOR. Estes achados sugerem que o uso de IHDAC constitui uma forma eficiente de tratamento de CME através da depleção da população de CTT , porém mais estudos são necessários para validar estes achados para uso clinico. / Mucoepidermoid carcinoma (MEC) is the most common malignant salivary tumor compromising about 30% of all salivary malignances. Managing MEC patients remain challenging especially due to the heterogeneous response of tumor cells to available therapy. For this reason clinical outcome remains unpredictable. Current treatment of MEC encompasses surgical resection with eventual adjuvant radiotherapy, which frequently leads to functional and aesthetic complications. The use of chemotherapy is often reserved for recurrent and metastatic tumors. Administration of single-agent or combination therapy has showed activity, however overall response rates are unsatisfactory and of short duration. Emerging evidences suggest that the modest response of tumor cells to therapy resulting in high recurrence rates and poor survival, are associated with the presence of cancer stem cells (CSC). Quiescence of CSC is achieved by the reduced levels of transcription in a process that requires tight folding of DNA driven by core histone proteins. Changes in DNA folding are responsible for different cellular phenotypes mediated by a cell type-specific chromatin organization. Of interest, we also found that acetylation of HNSCC tumor histones driven by histone deacetylase (HDAC) inhibitors abrogate tumor resistance to chemotherapy. We investigate the effects of HDACi and cisplatin in the population of CSCs of MEC. Initially, we found that MEC tumors are composed by a heterogeneous population of squamous-like and mucous-like cells presenting distinct acetylation levels of histone 3 (Lys9). Tumor cells where treated with cisplatin and SAHA, a Food and Drug Administration (FDA) approved histone deacetylase inhibitor. Surprisingly, we found that administration of SAHA resulted in complete depletion of MEC CSCs. In facts, SAHA alone surpassed the inhibitory therapeutic effects of cisplatin and the combined therapy using SAHA and cisplatin over the population of CSCs. We also found that administration of cisplatin to MEC tumor cells result in unexpected accumulation of a sub population of CSC (paraclones), suggesting a correlation between the administration of intercalating agents such as cisplatin to the development of resistance of MEC cells to chemotherapy.

O carcinoma mucoepidermóide (CME) é o tumor mais comum entre as neoplasias malignas de glândula salivar. Recentemente, uma rara população de células com características de multipotência, autorrenovação e potencial tumorigênico, denominadas como células tronco tumorais (CTT), foi descrita no CME. As CTT são resistentes as terapias atuais, e têm sido consideradas responsáveis pela recorrência e metástase, levando a um pior prognóstico para o paciente. A descoberta de que as CTT do CME superexpressam componentes da via de sinalização mTOR, levantou a hipótese que os pacientes poderiam ser beneficiados com o uso inibidores de mTOR como terapia para eliminação das CTT. O objetivo desse estudo foi avaliar o potencial uso de inibidores de mTOR como terapia para o CME com foco em CTT, assim como, investigar o funcionamento da via de sinalização mTOR e os efeitos moleculares do tratamento com inibidores dessa via nas CTT do CME. Foi realizada imuno-histoquímica para p-mTOR e p-S6K-1 em casos de pacientes diagnosticados com CME, os resultados foram correlacionados com os dados clínicos dos pacientes e também foi realizada dupla marcação por imunofluorescência para ALDH/p-mTOR. Estudos in vitro foram realizados em 3 linhagens de CME (UM-HMC-1, -3A, -3B) e com inibidores da via de sinalização mTOR. Após exposição aos inibidores, realizou-se ensaios de western blot (proteínas da via mTOR e BMI-1), citometria de fluxo para ALDH/CD44; salisfera; e apoptose, esse último comparando com quimioterápicos utilizados atualmente. Adicionalmente, foi utilizado o silenciamento genético de mTOR para confirmar os resultados obtidos com inibidores químicos. Por fim, foram realizados ensaios in vivo com as células silenciadas e com o inibidor de mTOR tensirolimo. Os resultados evidenciaram que a via de sinalização mTOR está ativa no CME, é correlacionada com pior prognóstico clínico e está superexpressa nas CTT. O tratamento com inibidores da via mTOR levaram a diminuição da fração de CTT, devido a perda de autorrenovação e apoptose das CTT. A apoptose, junto a diminuição de p-AKT revelada por western blot, sugeriram que esteja ocorrendo inibição de mTORC2 nas CTT, um importante componente na eficácia do tratamento com inibição de mTOR no câncer. Além disso, também houve redução de vasos sanguíneos, nichos das CTT, e diminuição do crescimento tumoral com uso de inibidores ou silenciando mTOR in vivo. Coletivamente, os resultados mostraram que a inibição de mTOR foi capaz de agir nas CTT por mecanismos diretos (indução de apoptose e diminuição da autorrenovação) e indiretamente através da redução de angiogênese, sugerindo que o uso de inibidores de mTOR no tratamento do CME é uma estratégia molecular eficiente para a redução de CTT, e uma potencial terapia adjuvante. / Mucoepidermoid carcinoma (MEC) is the most common tumor among malignant salivary gland neoplasms. Recently, a rare population of multipotent, self-renewing, and tumorigenic cells, termed cancer stem cells (CSC), was described in MEC. CSC are resistant to current therapies, and have been considered responsible for recurrence and metastasis, leading to worse patient prognosis. The discovery that CSC from MEC overexpressed the mTOR signaling pathway raised the hypothesis that use of mTOR inhibitors as therapy for CSC elimination could benefit patients. The objective of this study was to evaluate the potential use of mTOR inhibitors as a therapy for MEC targeting CTT, as well to investigate the functioning of mTOR signaling pathway and the molecular effects of treatment with mTOR inhibitors in MEC CSC. Immunohistochemistry was performed for p-mTOR and p-S6K-1 in paraffin samples from patients diagnosed with MEC and results were correlated with clinical data, in addition, co-immunoflorescence was performed for ALDH/p-mTOR. In vitro studies were performed with 3 MEC cell lines (UM-HMC-1, -3A, -3B) and with inhibitors of the mTOR signaling pathway. After exposure to inhibitors the following assays were performed: western blot (mTOR signaling pathway proteins and BMI-1), flow cytometry for ALDH/CD44, salispheres, and apoptosis, the latter comparing with currently chemotherapeutic agents used as treatment for cancer patients. In addition, mTOR genetically silent was used to confirm results with chemical inhibitors. Finally, in vivo assays were performed with knockdown cells and with mTOR inhibitor temsirolimus treatment. Results showed that mTOR signaling pathway is active in MEC, it is correlated with worse clinical prognosis and it is overexpressed in CSC. Treatment with inhibitors of mTOR signaling pathway led to a decrease in CSC fraction, caused by loss of self-renewal and apoptosis. Apoptosis, together with the decrease in p-AKT revealed by western blot, suggest that inhibition of mTORC2, an important compound in the efficacy of mTOR inhibition for cancer treatment, is occurring. In addition, there was reduction of blood vessels, CSC niches, and decreased tumor growth using mTOR inhibitors or silencing mTOR. Collectively, results showed that inhibition of mTOR was able to act in CSC by direct mechanisms (induction of apoptosis, decreased self-renewal) and indirectly through reduction of angiogenesis, suggesting that the use of mTOR inhibitors in treatment of MEC is an efficient molecular strategy to reduce fraction of CSC, and a potential therapy.

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A via de sinalização Sonic Hedgehog (Hh) e o Transdutor de sinal e ativador da transcrição 3 (STAT3) desempenham funções importantes na proliferação celular, favorecendo o desenvolvimento tumoral e a proteína MCM3 tem sido considerada uma nova classe de marcadores de proliferação celular. Portanto, o presente trabalho propõe-se a estudar componentes da via Hh, bem como o STAT3 e o MCM3 em neoplasias de glândula salivar, na tentativa de adicionar informações sobre as características biológicas dessas neoplasias. Foram utilizados 9 casos de AP, 17 casos de CAC e 20 casos de CME e, por meio da técnica imunoistoquímica, realizou-se a detecção das seguintes proteínas: SHH, GLI1, SUFU, HHIP, STAT3 e MCM3. No AP, observou-se alta expressão citoplasmática de SHH e SUFU, e baixa expressão de STAT3 e MCM3. No CAC, observou-se alta expressão de GLI1, HHIP e STAT3 e baixa expressão de SHH, SUFU e MCM3. No CME, observou-se alta expressão de SHH, GLI1, SUFU e HHIP e baixa expressão de STAT3 e MCM3. Quando comparado entre os tipos tumorais, observou-se diferença estatisticamente significante para expressão de SHH (p=0.0064), STAT3 (p=0.0003) e MCM3 (p=0.0257). Ao comparar a marcação parenquimal e estromal, observou-se maior expressão em parênquima para todos os tumores (p<0.05). Em glândula salivar normal, observou-se marcação citoplasmática das células ductais para SHH, GLI1, SUFU e HHIP, uma discreta marcação citoplasmática para STAT3 e ausência de marcação para MCM3. Não foi observada correlação entre a via Hh e STAT3 nos tumores de glândula salivar (p>0.05). Os resultados desse trabalho apontam para uma possível participação da via Hh na morfogênese e no desenvolvimento do AP, CAC e CME, assim como a participação do STAT3 no desenvolvimento do CAC. Em adição, o MCM3 não parece ser um bom marcador de proliferação para tumores de glândula salivar. Sugerimos que novos estudos sejam realizados visando compreender o mecanismo pelo qual a via Hh e o STAT3 promovem o crescimento e progressão desses tumores e identificar inibidores dessas vias. / The pleomorphic adenoma (PA), mucoepidermoid carcinoma (MEC) and the adenoid cystic carcinoma (ACC) are common tumors arising from salivary glands. The Sonic Hedgehog signaling pathway (Hh) and signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) play important roles in cell proliferation, favoring tumor growth. The MCM3 protein has been considered as a novel class of cell proliferation markers. The aim of this investigation was to study components of the Hh pathway, as well as STAT3 and MCM3 in salivary gland neoplasms in an attempt to add information about the biological characteristics of these neoplasms. We used 9 cases of PA, 17 cases of ACC and 20 cases of MEC. Using immunohistochemistry, were investigated: SHH, GLI1, Sufu, HHIP, STAT3 and MCM3. In PA, there was high expression of cytoplasmic SHH and Sufu, and low expression of STAT3 and MCM3. In the ACC, there was high expression of GLI1, HHIP and STAT3 and low expression of SHH, SUFU and MCM3. In the MEC, we observed high expression of SHH, GLI1, SUFU and HHIP and low expression of STAT3 and MCM3. There was a statistically significant difference between SHH (p=0.0064), STAT3 (p=0.0003) and MCM3 (p=0.0257) when all tumors were compared. And a higher expression in parenchyma for all tumors when stroma and parenchyma were compared (p<0.05). In normal salivary gland, ductal segment showed imunolabeling for SHH, GLI1, SUFU and HHIP, a discrete cytoplasmic labeling for STAT3 and MCM3 was negative. No correlation was observed between the Hh pathway and STAT3 in salivary gland tumors (p>0.05). The findings suggest a possible role of Hh pathway in the morphogenesis and development of AP, CAC and CME, as well as the participation of STAT3 in the development of ACC. In addition, the MCM3 did not seem to be a good marker of proliferation for salivary gland tumors. It is important that further studies be conducted to understand the mechanism by which the Hh pathway and the STAT3 promote the growth and progression of these tumors and inhibitors of these pathways might be identified.