Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El cáncer mamario es la neoplasia que se presenta con mayor frecuencia en la hembra canina reproductivamente entera. Diversos investigadores han demostrado que lovastatina exhibe un efecto antitumoral in vitro sobre diversas líneas celulares neoplásicas humanas, sin embargo, su potencial efecto aún no ha sido evaluado sobre células de carcinoma mamario canino. Lovastatina inhibe a la enzima hidroxi-metil-glutaril coenzima A (HMG-CoA) reductasa, bloqueando la biosíntesis de colesterol y de sus isoprenoides farnesil pirofosfato (FPP) y geranil-geranil pirofosfato (GGPP), importantes mediadores de algunas vías de transducción de señales asociadas a sobrevida celular. El objetivo de este estudio fue determinar los efectos de lovastatina sobre la proliferación, invasión y apoptosis de células de carcinoma mamario canino CF41.Mg. Se cultivaron células CF41.Mg y se trataron con lovastatina (0-20 μM) por diferentes tiempos. Luego, se evaluó viabilidad celular (método de reducción de MTS), invasión celular (método Transwell) y apoptosis (ensayo de Anexina V/Yoduro de Propidio). Lovastatina indujo una disminución significativa en la viabilidad celular (p ≤ 0.05), efecto que fue dependiente de su concentración y el tiempo. La invasión celular fue inhibida en respuesta a concentraciones no citotóxicas de lovastatina (p ≤ 0.05). Además, esta droga ejerció un efecto pro-apoptótico dependiente del tiempo (p ≤ 0.05). Estos resultados demuestran que lovastatina cumpliría un importante papel sobre la proliferación y capacidad invasiva de células de carcinoma mamario canino CF41.Mg, lo cual sustenta futuros estudios clínicos con esta droga / Mammary cancer is the tumor that occurs most frequently in the reproductively intact female dog. Several researchers have shown that lovastatin exhibits an in vitro antitumor effect on various human neoplastic cell lines, however, its potential effect has not yet been evaluated in canine mammary carcinoma cells. Lovastatin inhibits HMG-CoA reductase, blocking the biosynthesis of cholesterol and its isoprenoids FPP and GGPP, important mediators of some signal transduction pathways associated with cell survival. The aims of this study were to determine the effects of lovastatin on the proliferation, invasion and apoptosis of canine mammary carcinoma cells CF41.Mg. CF41.Mg cells were cultured and treated with lovastatin (0-20 μM) for different times. Then, cell viability (MTS reduction method), cell invasion (Transwell method) and apoptosis (Annexin V/Propidium Iodide assay) were evaluated. Lovastatin induced a significant decrease in cell viability (p ≤ 0.05), an effect that was dependent on its concentration and time. Cell invasion was inhibited in response to non-cytotoxic concentrations of lovastatin (p ≤ 0.05). In addition, lovastatin exerted a pro-apoptotic effect dependent on time (p ≤ 0.05). These results demonstrate that lovastatin would play an important role in the proliferation and invasive capacity of canine mammary carcinoma cells CF41.Mg, which supports future clinical studies with this drug / Proyecto Fondecyt 11110148

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Patología Animal. / Introducción. El cáncer mamario es el tipo de tumor más prevalente en la hembra canina. Información reciente demuestra que simvastatina exhibe un efecto antitumoral in vitro e induce autofagia sobre diversas líneas celulares neoplásicas. Sin embargo, no hay evidencia de que ocurra en células de carcinoma mamario canino. La autofagia es un proceso catabólico que permite a las células sobrevivir bajo condiciones de estrés metabólico, cumpliendo un rol dual en cáncer asociado a supresión y promoción tumoral dependiendo del contexto celular. En ese contexto, la autofagia jugaría un rol en la sobrevida y muerte de células tumorales en respuesta a agentes antitumorales. El objetivo de este estudio fue analizar los efectos de simvastatina sobre la autofagia y la viabilidad de células de carcinoma mamario canino CF41.Mg. Materiales y métodos. Células CF41. Mg fueron cultivadas y tratadas con simvastatina (1 y 5 M) por 24 horas y analizadas mediante citometría de flujo utilizando naranja de acridina. Se analizó la expresión de LC3 y beclina-1 en células tratadas con simvastatina y 3-metiladenina (inhibidor de autofagia) mediante inmunocitoquímica. Adicionalmente, se realizó un ensayo de viabilidad celular mediante el método de exclusión de azul tripan con células tratadas con simvastatina en presencia de Q-VD-OPh (inhibidor de apoptosis) y 3-metiladenina. Resultados Tanto la actividad autofágica como la expresión de LC3 y beclina-1 fueron inducidas por simvastatina (p<0.05). Estos efectos fueron revertidos por 3-metiladenina. Simvastatina inhibió la viabilidad celular en forma significativa, aún en presencia de 3-metiladenina (p<0.05). Q-VD-OPh bloqueó el efecto antiproliferativo desencadenado por simvastatina. Conclusiones El efecto antiproliferativo de simvastatina sobre células de carcinoma mamario canino CF41.Mg no es dependiente de la autofagia inducida por la misma droga. La citotoxicidad de simvastatina se explica casi completamente por la activación de caspasas / Introduction Mammary cancer is the most prevalent type of tumor in the female dogs. Recent data shows that simvastatin exhibit an antitumor effect in vitro and it is able to induce autophagy in some neoplastic cell lines. However, there is still no evidence in canine mammary cancer cells. Autophagy is a mayor catabolic process that allows the cells to survive under metabolic stress, performing a dual role in cancer associated to tumor suppression/progression depending on cellular context. Under this context, the autophagy may play a role in the survival and death of tumoral cell in response to anti-tumoral agents. The object of this study was to analyze the effects of simvastatin over the autophagy and viability of canine mammary carcinoma cells CF41.Mg. Materials and methods CF41.Mg cells were treated with simvastatin (1 y 5 M) for 24 hours and analyzed by flow cytometry using acridine orange dye. The expression of LC3 and beclin-1 in cells treated with simvastatin/3-methyladenine (autophagy inhibitor) by immunocytochemistry was analyzed. Cell proliferation assays with trypan blue dye in presence of simvastatin, Q-VD-OPh hydrate (pancaspase inhibitor) and 3-methyladenine were performed. Results Both autophagy activity and LC3/beclin-1 expression were induced by simvastatin (p<0.05). These effects were reversed by 3-methyladenine. This statin inhibited the cell viability, even in the presence of 3-methyladenine (p<0.05). Q-VD-OPh hydrate blocked the anti-proliferative effect of simvastatin. Conclusions The anti-proliferative effect of simvastatin over canine mammary carcinoma cells CF41.Mg it’s non-depending of the autophagy induced by the drug. The cytotoxicity of simvastatin it’s explained almost completely by the caspases activation / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No. 11110148.

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias . / La neoplasia mamaria es la patología tumoral de mayor frecuencia de presentación en la hembra canina. Dado que las terapias disponibles son limitadas, no selectivas y pueden desencadenar potenciales efectos adversos, se hace necesario estudiar nuevas alternativas de tratamiento antitumoral más inocuas e idealmente selectivas. El extracto comercial derivado de la planta Solanum dulcamara L -BIRM- ha sido usado empíricamente para una amplia variedad de enfermedades, incluyendo cáncer. Sin embargo, hay escasos estudios que revelan su potencial antitumoral. BIRM induce un efecto antiproliferativo y pro-apoptótico sobre células de carcinoma de próstata humana, especialmente en células andrógeno-dependientes, donde disminuye la expresión y promueve la degradación del receptor de andrógenos (RA). Ya que sobre el 80% de las neoplasias mamarias caninas de alto grado histológico exhiben la presencia del RA, pareció interesante analizar si BIRM induce también efectos antiproliferativos sobre células de carcinoma mamario canino CF41.Mg, línea celular representativa de tumores mamarios de alto grado. Con este objeto, se estudió proliferación, capacidad clonogénica y potencial citotóxico de dichas células en presencia de BIRM. Complementariamente, se analizó el efecto del extracto sobre la habilidad de estas células para migrar e invadir. BIRM disminuyó la proliferación celular y capacidad clonogénica de las células estudiadas, efectos que fueron dependientes de la concentración. Afín a estos resultados, el extracto indujo un arresto en G0/G1. BIRM no es selectivo, dado que disminuyó también la proliferación de células no tumorales MDCK. Adicionalmente, BIRM indujo apoptosis y una disminución significativa en la migración e invasión de células CF41.Mg. Estos resultados demuestran que BIRM, induce un efecto antiproliferativo y anti-invasivo sobre células de carcinoma mamario canino y sustenta la idea que este representaría un potencial agente terapéutico para el manejo del cáncer mamario canino. / Mammary tumors are the most frequent oncologic pathology in the female dog. Since available therapies are limited, non-selective and may trigger potential adverse effects, it`s becomes necessary to study new, harmless and ideally selective antitumor treatment alternatives. Commercial herbal extract derived from Solanum DulcamaraL -BIRM- has been used empirically for a wide variety of diseases, including cancer. However, there are few studies that reveal its antitumor potential. BIRM induces an antiproliferative and pro-apoptotic effect on human prostate carcinoma cells, especially in androgen-dependent cells, where it decreases expression and promotes androgen receptor (AR) degradation. Since over 80% of high histological grade canine mammary tumors exhibit the presence of RA, it appeared interesting to analyze whether BIRM also induces antiproliferative effects on CF41.Mg canine mammary carcinoma cells, a cell line representative of high grade mammary tumors. For this purpose, proliferation, clonogenic capacity and potential cytotoxicity were studied in the presence of BIRM. In addition, the effect of the extract on the ability of CF41.Mg cells to migrate and invade was analyzed. BIRM decreased cell proliferation and clonogenic ability of the cells studied, effects that were concentration-dependent. In parallel, the extract induced an arrest in G0/G1. BIRM is not selective, since the proliferation of non-tumoral MDCK cells also decreased in presence of herbal extract. Moreover, BIRM induced apoptosis and a significant decrease in the migration and invasion of CF41.Mg. cells. These results demonstrate that BIRM induces an antiproliferative and anti-invasive effect on canine mammary carcinoma cells and, supports the idea that it would represent a potential new therapeutic agent for the management of canine mammary cancer.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La neoplasia mamaria es una enfermedad que afecta comúnmente a hembras caninas. En el microambiente tumoral existe una subpoblación de células tumorales que exhiben características de troncalidad (CSC), que pueden formar esferas in vitro, resistir tratamientos antitumorales, explicando en parte la recurrencia de algunas neoplasias. Previamente, se ha descrito que esferas derivadas de células de carcinoma mamario canino CF41.Mg exhiben características de troncalidad. Melatonina ha mostrado efectos antitumorales sobre células tumorales mamarias; sin embargo, sus efectos han sido pobremente evaluados en CSC mamarias caninas. Melatonina modula la expresión de proteínas relacionadas con transición epitelio-mesénquima en CSC mamarias, como E-cadherina y OCT-4. El objetivo de este estudio fue determinar los efectos de melatonina sobre la proliferación, migración e invasión de células CF41.Mg y esferas derivadas de ellas. Se cultivaron células CF41.Mg en DMEM alto en glucosa suplementado con suero fetal bovino y L-glutamina. Las esferas se cultivaron en placas de ultra-baja adherencia con DMEM/F12 en presencia de EGF, bFGF, insulina, B27 y heparina. La proliferación (reducción de MTS) y los ensayos de migración/invasión (transwell) celular se realizaron en presencia de melatonina (0,01, 0,1 o 1 mM). Melatonina indujo un efecto antiproliferativo a 1 mM (P<0.05), sin embargo, el efecto sobre las esferas fue mayor (P<0.0001). La migración/invasión celular fue inhibida en respuesta a concentraciones no citotóxicas de melatonina (P<0.05) en ambos tipos celulares. Estos resultados indican que melatonina juega un papel en la actividad proliferativa e invasiva de células CF41.Mg, siendo un potencial agente contra CSC mamarias. / Mammary cancer is a common disease affecting female dogs. In the tumor microenvironment there is a subpopulation of cancer cells with stem cell-like features (CSC), that can form in vitro spheres and resist conventional antitumor treatments explaining in part the recurrence of some cancers. It has been previously reported that spheres derived from CF41.Mg canine mammary carcinoma cells exhibit some stemness features. Melatonin has shown antitumor effects on cancer mammary cells; nevertheless, its effects has been poorly evaluated on canine mammary CSC. Recent reports have showed that melatonin modulates the expression of proteins related to epithelial-mesenchymal transition in breast CSC, such as E-cadherin, vimentin and OCT-4. The aim of this study was to determine the effects of melatonin on proliferation, migration and invasion of canine mammary carcinoma CF41.Mg cells and spheres derived from them. CF41.Mg cells were grown in DMEM high glucose supplemented with FBS and L-glutamine. CF41.Mg-spheres were cultured in ultra-low attachment plates with serum-free DMEM/F12 in presence of EGF, bFGF, insulin, B27 and heparin. Cell proliferation (MTS reduction) and migration/invasion (transwell) assays were conducted in presence of melatonin (0.01, 0.1 or 1 mM). Melatonin induced an antiproliferative effect at 1 mM (P<0.05), however the effect on spheres was higher (P<0.0001) than in parental cells. Cell migration/invasion was inhibited in response to non-cytotoxic concentrations of melatonin (P<0.05) both in spheres and in parental cells. These results indicate that melatonin plays a role in the proliferative and invasive activity of CF41.Mg cells, representing a valuable potential agent against mammary CSC.