Bien que les bases physiopathologiques de beaucoup de maladies musculaires soient dorénavant connues, les myopathies congénitales à cores (MCs), maladies génétiques qui se présentent dès la naissance avec un retard du développement moteur, une faiblesse musculaire et des complications respiratoires et/ou cardiaques parfois mortelles, demeurent mal comprises. Des mutations dans RYR1, SEPN1, TTN, ACTA1, CFL2 et MEGF10 ont été associées aux MCs, pourtant dans plus de 50% des cas le gène responsable reste à identifier. L'objectif de ma thèse a été de clarifier les mécanismes physiopathologiques des MCs par l'identification de nouveaux gènes ou de nouvelles mutations. Cette thèse a eu une dimension internationale concrétisée par la mise en place d'une cotutelle UPMC (France) et UdeM (Québec). J'ai développé deux axes de recherche complémentaires. D'une part j'ai étudié 21 familles informatives avec MC récessive, scoliose et atteinte respiratoire, en combinant clonage positionnel et étude de gènes candidats et en utilisant des outils variés allant du génotypage au séquençage de nouvelle génération (NGS). En parallèle, j'ai étudié 24 familles avec une MC autosomique récessive affectant les muscles cardiaque et squelettique et dont le phénotype était semblable à celui observé chez des patients avec des délétions dans les 6 derniers exons de TTN. Ainsi pour l'analyse de cette deuxième cohorte, nous avons appliqué une stratégie de séquençage de gène candidat ciblée sur ces exons et de NGS pour le reste du gène. Pendant mon doctorat j'ai identifié les défauts génétiques de 8 des 45 familles étudiées (18 %), et caractérisé 3 nouvelles entités médicales, dont deux MCs dues à des nouvelles mutations de TTN. Ces résultats ont servi à l'identification de nouvelles interactions protéiques de la titine et contribuent à définir TTN comme une cause majeure de pathologies musculaires cardiaques et/ou squelettiques. Une troisième nouvelle forme de MC est provoquée par une mutation d'un coactivateur transcriptionnel peu connu et jamais associé à une maladie. Ces résultats ont révélé un nouvel acteur clef et une nouvelle voie de signalisation dans la physiopathologie du muscle, ont un bénéfice direct en termes de conseil génétique et ouvrent la voie pour le développement de thérapies

Les mutations du gène LMNA, codant les lamines A/C, des protéines ubiquitaires de l'enveloppe nucléaire, sont responsables de formes autosomiques de dystrophie musculaire d'Emery-Dreifuss (EDMD), pathologie associant une atteinte des muscles squelettiques et une cardiomyopathie dilatée (DCM) avec troubles rythmiques et/ou conductifs. Lors de ma thèse j'ai analysé le phénotype musculaire et cardiaque de souris LmnaΔK32/+ (Het), mutation identifiée chez des patients présentant une EDMD sévère. Les souris Het n'ont pas d'atteinte musculaire mais développent une DCM conduisant au décès entre l'âge de 35 et 7O semaines. Le niveau de lamines A/C est diminué de 50% dans le cœur des souris Het avant et au début de la DCM mais similaire aux Wt chez les souris Het souffrant de DCM. La diminution de la quantité de lamines A/C est liée à leur dégradation par le système ubiquitine-protéasome (UPS) dont la fonction est altérée dans le cœur des souris Het, conduisant à l'augmentation de la quantité de lamines K32 avec l'âge. In vitro, l'accumulation des lamines A/C K32 conduit à leur agrégation nucléaire, suggérant un effet dominant négatif de ces protéines mutées. Pour conclure, la souris LmnaΔK32/+ est le premier modèle murin porteur d'une mutation du gène Lmna qui développe une cardiomyopathie isolée à l'état hétérozygote. L'UPS joue un rôle important dans la dégradation des lamines A/C mutées, limitant leur effet délétère. Les mécanismes physiopathologiques à l'origine de la DCM chez les souris Het sont donc doubles : à l'haploinsuffisance des lamines A/C, connue comme préjudiciable pour le cœur, s'ajoute un effet poison des lamines mutées augmentant avec la dysfonction de l'UPS

Les patients atteints de dystrophies musculaires présentent de plus en plus fréquemment des complications cardiaques, qui sont majoritairement des cardiomyopathies dilatées (CMD), et qui déterminent leur pronostic vital. Dans ce contexte, les traitements de l'atteinte cardiaque sont ceux de l'insuffisance cardiaque, qui agissent sur l'environnement fonctionnel du cœur, mais pas directement sur l'atteinte myocardique.<br /> L'objectif de cette thèse a été d'évaluer les effets d'un traitement novateur de la CMD dans les dystrophies musculaires, en utilisant le hamster de la lignée CHF147. La démarche proposée est d'induire un phénomène compensateur de la dilatation cardiaque et ainsi d'améliorer le pronostic vital, en utilisant les propriétés de l'Insulin-like Growth Factor 1 (IGF-1).<br /> Des hamsters CHF147 jeunes ont été traités pendant un temps court, de façon systémique avec la protéine recombinante IGF-1 (rhIGF-1) à faible dose. Les effets macroscopiques, histologiques et fonctionnels du traitement ont été évalués 35 jours après le début de celui-ci et les voies de signalisation impliquées dans l'induction des effets observés ont été étudiées. Une étude de survie a été réalisée afin de mesurer les effets du traitement à long terme. L'évaluation des effets à court terme de l'administration de rhIGF-1 sur la CMD du hamster CHF147 indique un ralentissement de la dilatation des cavités cardiaques ainsi que de l'extension de la fibrose myocardique, et une préservation de multiples paramètres fonctionnels, tels que le débit cardiaque, le volume d'éjection, la pression de fin de diastole et, en particulier, la contractilité myocardique. Les effets observés sont dus en partie à des modifications au niveau des protéines impliquées dans le cycle du calcium. A long terme, la survie des hamsters CHF147 traités augmente significativement d'environ 20% et est associée à une préservation partielle de la fonction cardiaque.<br />Toutefois, une augmentation du niveau sérique d'IGF-1 pourrait augmenter le risque d'effets secondaires délétères. Afin de limiter les effets systémiques d'IGF-1 et de cibler son administration au cœur, nous avons injecté localement le plasmide pCMV-IGF1 codant pour l'IGF-1 dans le myocarde des hamsters CHF147. Les effets du traitement ont été évalués après 35 jours et montrent des résultats comparables à ceux obtenus avec la protéine rhIGF-1.<br />En conclusion, ce travail de thèse a montré qu'un traitement basé sur IGF-1 permet de ralentir l'évolution de la CMD des hamsters CHF147, en préservant la structure et la fonction cardiaques, et d'améliorer significativement leur survie. IGF-1 semble donc être un candidat prometteur pour la mise au point d'une approche par thérapie génique dans l'insuffisance cardiaque, due à une CMD, dans le contexte des dystrophies musculaires.

Thèse d'exercice : Médecine : Nancy 1 : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

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Thèse réalisée en cotutelle avec l'Université Pierre et Marie Curie, Paris 6(UPMC, Paris, France). / Bien que les bases physiopathologiques de beaucoup de maladies musculaires soient dorénavant connues, les myopathies congénitales à cores (MCs), maladies génétiques qui se présentent dès la naissance avec un retard du développement moteur, une faiblesse musculaire et des complications respiratoires et/ou cardiaques parfois mortelles, demeurent mal comprises. Des mutations dans RYR1, SEPN1, TTN, ACTA1, CFL2 et MEGF10 ont été associées aux MCs, pourtant, dans plus de 50% des cas, le gène responsable reste à identifier. L’objectif de ma thèse a été de clarifier les mécanismes physiopathologiques des MCs par l’identification de nouveaux gènes ou de nouvelles mutations. Cette thèse a eu une dimension internationale concrétisée par la mise en place d’une cotutelle UPMC (France) et UdeM (Québec). J’ai développé deux axes de recherche complémentaires. D’une part j’ai étudié 21 familles informatives avec MC récessive, scoliose et atteinte respiratoire, en combinant clonage positionnel et étude de gènes candidats et en utilisant des outils variés allant du génotypage au séquençage de nouvelle génération (NGS). En parallèle, j’ai étudié 24 familles avec une MC autosomique récessive affectant les muscles cardiaque et squelettiques et dont le phénotype était semblable à celui observé chez des patients avec des délétions dans les 6 derniers exons de TTN. Ainsi pour l'analyse de cette deuxième cohorte, nous avons appliqué une stratégie de séquençage de gène candidat ciblée sur ces exons et de NGS pour le reste du gène. Pendant mon doctorat j'ai identifié les défauts génétiques de 8 des 45 familles étudiées (18 %), et caractérisé 3 nouvelles entités médicales, dont deux MCs dues à des nouvelles mutations de TTN. Ces résultats ont servi à l’identification de nouvelles interactions protéiques de la titine et contribuent à définir TTN comme une cause majeure de pathologies musculaires cardiaques et/ou squelettiques. Une troisième nouvelle forme de MC est provoquée par une mutation d'un coactivateur transcriptionnel peu connu et jamais associé à une maladie. Ces résultats ont révélé un nouvel acteur clef et une nouvelle voie de signalisation dans la physiopathologie du muscle, ont eu un bénéfice direct en termes de conseil génétique et ouvrent la voie pour le développement de thérapies. / While the pathophysiological bases of many muscular diseases are nowadays well known, congenital core myopathies (CMs) remain poorly understood. CMs are genetic diseases which generally present at birth with delayed motor development, muscle weakness, and sometimes fatal respiratory or cardiological complications. Mutations in RYR1, SEPN1, ACTA1, TTN and MEGF10 have been associated with various CMs, yet for about 50% of CM cases the responsible gene has not been identified. The objective of my thesis was to clarify the pathophysiological mechanisms of new forms of CM through the identification of new genes or new mutations in known genes. This thesis had an international dimension as manifested by a UPMC (France) and UdeM (Québec) joint direction. I developed two complementary axes of research. First, I studied 21 informative families with a recessive CM with scoliosis and respiratory failure, for which I combined positional cloning and candidate gene studies, using various tools from genotyping to next generation sequencing (NGS). The second part of this work consisted on the analysis of 24 families with recessive CM affecting both cardiac and skeletal muscles. Their phenotype was similar to that previously observed in cases with deletions in the last 6 exons of the giant gene TTN. Thus we applied a candidate gene strategy through direct Sanger sequencing coupled with NGS for the analysis of this second cohort. During my PhD work I identified the molecular defect in 8 out of the 45 families included (18%), which led to the identification and characterization of 3 novel medical entities, including two new CMs due to novel defects of TTN. These results served to identify new titin protein interactions, and participate in the definition of TTN defects as a major cause of both cardiac and skeletal muscle conditions. A third new form of CM is due to mutations of a poorly-known transcriptional coactivator whose role in striated muscle physiology was unknown and which had never been associated to a human condition. Globally, these results unveiled a novel important protein and pathway in muscle pathophysiology, have direct health benefits (molecular diagnosis) and open the way for therapeutic investigations.

Les anomalies du système nerveux sympathique (SNS) contribuent au développement de certaines pathologies cardiovasculaires comme l'insuffisance cardiaque (IC) et les cardiomyopathies de stress. Ces anomalies impliquent une activation persistante, défavorable du SNS dans l'IC et une activation sympathique épisodique dans les cardiomyopathies de stress. Le rôle du SNS au cours des cardiopathies valvulaires reste quand à lui encore mal connu. Notre travail de thèse avait pour objectif d'analyser par microneurographie l'activité du SNS et sa modulation par les arcs réflexes physiologiques, au cours de l'IC avec ou sans comorbidités (notamment l'anémie, l'insuffisance rénale) ainsi qu'au cours des cardiomyopathies de stress et de la sténose aortique. L'hyperactivité du SNS participe à l'initiation et à la progression de l'IC et constitue un marqueur pronostique mais aussi une cible thérapeutique. Les mécanismes fondamentaux qui sous-tendent l'activation du SNS au cours de l'IC restent encore incertains. Une hypothèse engloberait une diminution des réflexes inhibiteurs, comme le baroréflexe artériel périphérique et une augmentation des réflexes excitateurs, comme le chémoréflexe artériel périphérique. Avec notre premier travail nous rapportons que l'augmentation de l'activité du chémoréflexe périphérique diminue directement la fonction du baroréflexe artériel chez les patients IC et que cette interaction contribue à l'hyperactivité sympathique. Notre équipe avait déjà démontré qu'au cours de l'IC, l'insuffisance rénale (IR) et l'anémie contribuent à l'augmentation de l'activité du SNS. Bien que la dysfonction rénale et l'anémie aient été largement étudiées séparément dans l'IC, des données épidémiologiques suggèrent également que l'IR peut coexister avec l'anémie chez les patients atteints d'IC dans ce qu'on désigne par le "syndrome d'anémie cardio-rénale". Nous avons démontré que ce syndrome au cours de l'IC est associé à une hyperactivité sympathique médiée à la fois par une activation tonique du chémoréflexe périphérique et une atténuation du baroréflexe artériel. Le syndrome du Tako Tsubo est une cardiomyopathie de stress caractérisée par une insuffisance ventriculaire gauche aiguë réversible. La physiopathologie exacte reste inconnue, mais l'hyperactivation sympathique semble jouer un rôle fondamental. Nous avons démontré par microneurographie la présence d'une hyperactivation du SNS dans la phase subaiguë de la maladie associée à une altération du baroréflexe périphérique. La sténose aortique (SA) est, dans les pays développés, la plus fréquente de toutes les maladies cardiaques valvulaires. Le remplacement valvulaire aortique transcathéter (TAVI) est une option thérapeutique émergente chez les patients avec une SA sévère symptomatique à haut risque chirurgical. La SA est associée à une morbi-mortalité cardiovasculaire accrue. Nous avons souhaité apprécier si au cours de la SA il existait une hyperactivité du SNS qui pouvait contribuer à expliquer le pronostic réservé des patients et être la cible du TAVI. Nous avons montré que les patients atteints de SA ont une activité du SNS augmentée et qui est associée à une diminution du gain du baroréflexe périphérique. Le TAVI normalise ces paramètres. Au total, ce travail de thèse a permis d'identifier de nouveaux mécanismes contribuant à l'hyperactivité du tonus sympathique au cours de l'insuffisance cardiaque, de la sténose aortique et de la cardiomyopathie du Tako Tsubo. L'hyperactivité du SNS jouant un rôle critique dans l'insuffisance cardiaque, la connaissance des mécanismes physiopathologiques qui la sous-tendent pourrait permettre l'identification et/ou la validation de nouvelles stratégies pour son traitement. / Sympathetic nervous system (SNS) abnormalities contribute to the development of some cardiovascular diseases such as heart failure (HF) and stress cardiomyopathies. These abnormalities involve persistent, adverse activation of SNS in HF and episodic sympathetic activation in stress cardiomyopathies. Less is still known about the role of SNS in valvular heart diseases. Our PhD work had as a purpose to analyse, by microneurography, the activity of SNS and its modulation by physiological reflex arcs, during HF, with and without comorbidities (including anemia and kidney failure), in stress cardiomyopathies and during aortic stenosis. SNS hyperactivity participates in the initiation and progression of HF being also a prognostic marker and a therapeutic target. The fundamental mechanisms underlying the activation of SNS in HF remain uncertain. One hypothesis would include a decrease in inhibitory reflexes activity, such as peripheral arterial baroreflex and an increase in excitatory reflexes activity, such as peripheral arterial chemoreflex. With our first work we report that the increased activity of peripheral chemoreflex directly decreases the arterial baroreflex function in HF patients and that this interaction contributes to sympathetic hyperactivity. Our team had already shown that during HF, renal dysfunction and anemia contribute to the increased activity of SNS. Although renal dysfunction and anemia have been widely studied separately in HF, epidemiological data also suggest that renal impairment can coexist with anemia in HF patients in the so called "cardio-renal anemia syndrome". We demonstrated that this syndrome during HF is associated with elevated sympathetic activity mediated by both tonic peripheral chemoreflex activation and arterial baroreflex impairment.The Tako Tsubo (TTC) is a stress cardiomyopathy characterized by acute reversible left ventricular failure. The exact pathophysiology remains unknown but sympathetic hyperactivation seems to play a fundamental role. We reported by microneurography the presence of SNS hyperactivation in the subacute phase of the disease associated with impairment in arterial baroreflex.In developed countries, aortic stenosis (AS) is the most prevalent of all valvular heart diseases. Transcatheter aortic valve implantation (TAVI) is an emerging therapeutic option in symptomatic patients with severe AS at high surgical risk. AS is associated with increased cardiovascular morbidity and mortality. We wanted to assess whether in AS sympathetic hyperactivity existed that could help to explain the poor prognosis of these patients and be the target of TAVI. We have shown that AS patients have an increased SNS activity that is associated with reduced peripheral baroreflex gain. The TAVI normalizes these parameters.On the whole this PhD work identified new mechanisms that contribute to SNS hyperactivity in heart failure, aortic stenosis and Tako Tsubo cardiomyopathy. Since SNS hyperactivity plays a critical role in heart failure, knowledge of the pathophysiological mechanisms that underlie it could allow identification and/or validation of new strategies for its treatment.

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Les stress physiopathologiques cardiaques sont associés dans la plupart des cas à une production d’espèces réactives oxygénées (ROS). Les ROS entrent dans plusieurs mécanismes physiologiques, cependant, des niveaux élevés de production de ROS produisent généralement des changements délétères dans la performance contractile et conduisent à un remodelage cardiaque défavorable. Il est maintenant établit qu’un stress oxydant important entraîne une altération de l'expression et/ou la fonction des protéines sarcomériques contribuant aux dysfonctions contractiles observées dans les diverses pathologies cardiaques. Ce travail de thèse a consisté à étudier l’impact du stress oxydant sur la fonction contractile cardiaque in-vivo, ex-vivo, et in-vitro dans diffèrent modèles de stress physiopathologiques cardiaques. Plus précisément, nous avons étudié le remodelage précoce de la machinerie contractile in-vitro, notamment les modifications post-traductionnelles des protéines sarcomériques dépendantes directement ou indirectement des ROS, mais aussi, la conséquence de ces modifications sur la fonction contractile cardiaque in-vivo et ex-vivo. Pour cela, nous avons généré deux modèles animaux de stress physiopathologiques cardiaques (exercice physique et chimiothérapie) ayants des mécanismes moléculaires différents tout en étant reliés par une perturbation commune : une production importante de ROS. Ainsi, ce travail de thèse s’est intéressé à la compréhension des mécanismes physiopathologiques à l’origine de : i) la dysfonction diastolique résultante d’un exerce physique épuisant, ii) la cardiomyopathie résultante de la prise d’anthracyclines. Dans ces études, nous avons étudié les modifications post-traductionnelles induites par les ROS des protéines sarcomériques (MyBP-C et TnI), ainsi que les conséquences sur la fonction cardiaque in-vivo, ex-vivo, et in-vitro. Ce travail de thèse a permis de montrer l’importance de la voie oxydative dans la régulation/dérégulation de la fonction cardiaque, aussi bien à l’échelle de l’organe qu’à l’échelle de la cellule. Il démontre notamment, que la voie oxydative peut interagir avec la voie adrénergique pour modifier les propriétés contractiles (étude #1). De plus, ce travail a permis de mettre en évidence que la voie oxydative induit des modifications précoces des propriétés contractiles qui sont hétérogènes à travers le ventricule gauche (étude #2). / Cardiac pathophysiological stress is generally associated with reactive oxygen species (ROS) production. ROSs are involved in several physiological mechanisms, however, high levels of ROS production induce deleterious changes in contractile performance and lead to adverse cardiac remodeling. It is now established that significant oxidative stress results in impaired expression and/or function of sarcomeric proteins and contribute to contractile dysfunctions observed in various cardiac pathologies.This work aim to study the oxidative stress impact on cardiac contractile function in-vivo, ex-vivo, and in-vitro, in different models of cardiac pathophysiological stress. Specifically, we studied the in-vitro contractile machinery early remodeling, including post-translational modifications of sarcomeric proteins directly or indirectly related to ROS, and the consequences of these modifications on cardiac contractile function in-vivo and ex-vivo. For this purpose, we used two animal models of cardiac pathophysiological stress (intense physical exercise and chemotherapy) having different molecular mechanisms but connected by an important ROS production.Thus, this thesis work focused on the pathophysiological mechanisms involved in diastolic dysfunction induced by an exhausting physical exercise and the anthracyclines induced cardiomyopathy. In these studies, we investigated ROS-induced post-translational modifications of sarcomeric proteins (MyBP-C and TnI), as well as, the consequences on cardiac function in-vivo, ex-vivo, and in-vitro. This work has shown the oxidative pathway importance in the cardiac function regulation/deregulation. Especially, it demonstrates that the oxidative pathway can interfere with the adrenergic pathway to modify contractile properties (study #1). In addition, this work has shown that the oxidative pathway induces early heterogeneous changes across the left ventricle in contractile properties (study #2).

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la conséquence de la perte de la dystrophine, protéine sous membranaire indispensable au maintien mécanique et fonctionnel du sarcolemme. Cette déficience augmenterait les influx cationiques par des microruptures de la membrane ou par la dérégulation de canaux tels que les canaux activés par l'étirement (SACs: Stretch-activated channel). Dans ce travail, les effets d'une stimulation mécanique ont été explorés sur des cardiomyocytes dans le contexte pathologique de la cardiomyopathie dilatée associée à la DMD. L'utilisation de fibres de carbone a permis de réaliser un étirement axial similaire aux conditions physiologiques de remplissage ventriculaire. Dans ces conditions, l'exploration de la topographie membranaire par la microscopie de conductance ionique à balayage n'a montré aucune évolution de la surface ni de lésion du sarcolemmel dans les conditions d'étirement. L'étude s'est donc focalisée sur l'activité de candidats moléculaires des SACs et plus particulièrement ceux appartenant à la famille des TRPs (Transient Receptor Potential) dans le dérèglement de l'homéostasie calcique induite par l'étirement. Les influx cationiques évalués par la technique d'extinction de fluorescence et l'étude de la concentration intracellulaire de Ca2+ ([Ca2+]i) grâce à la sonde Fluo8 montrent une implication des canaux TRPV2 et TRPCs. Les premiers semblent responsables d'une entrée cationique et d'une augmentation de [Ca2+]i importante dans les cardiomyocytes mdx. Les seconds, bien que responsables d'un influx, ne participeraient pas à l'augmentation de [Ca2+]i. Ces résultats révèlent que les canaux TRPV2 pourraient jouer un rôle important dans la dérégulation calcique observée dans les cardiomyocytes déficients en dystrophine. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the consequence of the loss of dystrophin, a subsarcolemmal protein essential for mechanical and functional maintenances of the sarcolemma. This deficiency could increase cationic influxes by membrane microruptures or by dysregulation of channels such as stretch-activated channels (SACs). In this work, the effects of a mechanical stretch were explored on cardiomyocytes in the pathological context of dilated cardiomyopathy associated with DMD. Using carbon fibers, an homogenous axial stretch was performed to mimic physiological conditions of ventricular filling. In these conditions, exploration of membrane topography using the scanning ion conductance microscopy did not show any surface evolution or sarcolemma disruption in stretch condition. The study was thus focused on activity and identification of molecular candidates for SACs, especially the TRPs (Transient Receptor Potential) channels in the stretch-induced. Ca2+ homeostasis dysregulation. Cationic influxes assessed by Mn2+-quenching and assessment of the intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i) using fluo-8 fluorescence demonstrated an involvement of TRPV2 and TRPCs channels. The first ones seem to be responsible for cationic entry and [Ca2+]i increase in mdx cardiomyocytes. The latter, though responsible for an influx, do not contribute to [Ca2+]i increase. These findings reveal that TRPV2 channels could play an important role in calcium dysregulation observed in dystrophin-deficient cardiomyocytes.