Ziel der vorliegenden Arbeit war die nanoskopische Analyse struktureller Differenzierung und Plastizität präsynaptischer aktiver Zonen (AZs) an der NMJ von Drosophila melanogaster mittels hochauflösender, lichtmikroskopischer Bildgebung von Bruchpilot (Brp). In erster Linie wurde das lokalisationsmikroskopische Verfahren dSTORM angewendet. Es wurden neue Analyse-Algorithmen auf der Basis von HDBSCAN entwickelt, um eine objektive, in weiten Teilen automatisierte Quantifizierung bis auf Ebene der Substruktur der AZ zu ermöglichen. Die Differenzierung wurde am Beispiel phasischer und tonischer Synapsen, die an dieser NMJ durch Is- und Ib-Neurone gebildet werden, untersucht. Phasische Is-Synapsen mit hoher Freisetzungswahrscheinlichkeit zeigten kleinere, kompaktere AZs mit weniger Molekülen und höherer molekularer Dichte mit ebenfalls kleineren, kompakteren Brp-Subclustern. Akute strukturelle Plastizität wurde am Beispiel präsynaptischer Homöostase, bei der es zu einer kompensatorisch erhöhten Neurotransmitterfreisetzung kommt, analysiert. Interessanterweise zeigte sich hier ebenfalls eine kompaktere Konfiguration der AZ, die sich auch auf Ebene der Subcluster widerspiegelte, ohne Rekrutierung von Molekülen. Es konnte demonstriert werden, dass sich eine höhere Moleküldichte in der Lokalisationsmikroskopie in eine höhere Intensität und größere Fläche in der konfokalen Mikroskopie übersetzt, und damit der Zusammenhang zu scheinbar gegensätzlichen Vorbefunden hergestellt werden. Die Verdichtung bzw. Kompaktierung erscheint im Zusammenhang mit der Kopplungsdistanz zwischen VGCCs und präsynaptischen Vesikeln als plausibles Muster der effizienten Anordnung molekularer Komponenten der AZ. Die hier eingeführten Analysewerkzeuge und molekularbiologischen Strategien, basierend auf dem CRISPR/Cas9-System, zur Markierung von AZ-Komponenten können zukünftig zur weiteren Klärung der Bedeutung der molekularen Verdichtung als allgemeines Konzept der AZ-Differenzierung beitragen. / The aim of this work was a nanoscopic analysis of structural differentiation and plasticity of presynaptic active zones (AZs) at the NMJ of Drosophila melanogaster using super-resolution light microscopy of Bruchpilot (Brp). The localization microscopy technique dSTORM was primarily used. New analysis algorithms based on HDBSCAN were developed to ensure objective and largely automatized quantification including the substructure of the AZ. Differentiation was assessed using the model of phasic and tonic neurons that are represented by type Is and type Ib neurons at this NMJ. Phasic Is synapses with higher release probability displayed smaller, more compact AZs with less molecules and an enhanced molecular density with smaller, more compact Brp subclusters. For acute structural plasticity the model of presynaptic homeostasis, which is accompanied by a compensatory increase of neurotransmitter release, was used. Interestingly, this again showed a more compact arrangement of the AZ, that was also found in Brp subclusters, without addition of molecules. It could be demonstrated that a higher molecular density in localization microscopy translates into a higher intensity and area in confocal microscopy and, thus, the apparent discrepancy to earlier studies could be explained. With respect to the coupling distance between VGCCs and presynaptic vesicles compaction appears to be a plausible mechanism for an efficient remodeling of AZ components. The analysis tools and molecular biology strategies, based on the CRISPR/Cas9-System, introduced here will be useful to further clarify the importance of molecular compaction as a general concept of AZ differentiation.

Die Hypophosphatasie (HPP) ist eine seltene Erberkrankung, welche durch compound-heterozygote oder dominant negative heterozygote Mutationen des ALPL Gens zu einem Funktionsverlust der gewebeunspezifischen Alkalischen Phosphatase (TNAP) führt. Die daraus resultierenden Mineralisierungsstörungen betreffen sowohl den Knochen als auch in milderen Ausprägungsformen die Zähne und den Zahnhalteapparat. Das zahnmedizinische Leitsymptom und in vielen Fällen das erste Anzeichen der HPP ist dabei der vorzeitige Verlust der Milchzähne ohne physiologische Wurzelresorption. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene TNAP defiziente immortalisierte Zellen des parodontalen Ligaments (PDL) mittels der CRISPR/Cas9 Methode generiert und anschließend fünf Zelllinien charakterisiert. Die dabei entstandenen Mutationen variierten von einer moderaten heterozygoten Punktmutation zu einer schwerwiegenden homozygoten Deletion eines einzelnen Nukleotids, welche in einem vorzeitigen Stopcodon resultierte. Analysen der ALPL Expression (qPCR), TNAP Aktivitätsmessungen (CSPD Assay) und TNAP Färbungen zeigten einen signifikanten Rückgang in allen TNAP-defizienten Zelllinien mit einer starken Korrelation zwischen der Restaktivität und dem Ausmaß der Mutation, welche in Einklang mit der komplexen Genotyp-Phänotyp Korrelation bei HPP zu bringen ist. Das Potential der osteogenen Differenzierung der hTERT PDL Zellen wurde in der homozygot mutierten Zelllinie komplett unterdrückt. Mögliche Mechanismen des vorzeitigen Zahnverlustes bei HPP Patienten ist die geminderte Formation und Mineralisation des Wurzelzements und die fehlerhafte Insertion der parodontalen Fasern. Die hier erstmalig etablierten Zellkulturmodelle liefern ein valides spenderunabhängiges in vitro Modell der HPP, welches dazu beitragen kann, die molekularbiologischen Zusammenhänge der dentalen Aspekte der Hypophosphatasie zu ergründen und daraus gegebenenfalls neue Therapieansätze abzuleiten. / Hypophosphatasia (HPP) is a rare inherited disorder caused by loss-of-function mutations in the ALPL gene encoding the Tissue Nonspecific Alkaline Phosphatase (TNAP). Besides skeletal symptoms, some patients also present dental abnormalities like for example the premature loss of deciduous teeth. Here we generated and characterized five different TNAP-deficient periodontal ligament (PDL) derived cell lines using the method of CRISPR-Cas9. The mutations varied from a moderate heterozygous point mutation to a severe homozygous deletion leading to a premature stop codon. Analysis of the ALPL expression and TNAP activity measurements in CSPD Assays and TNAP stainings revealed a decrease for all TNAP-deficient cell lines with a strong correlation between the residual activity and the extend of the mutation. The already limited differentiation capacity of immortalized hTERT (human telomerase reverse transcriptase) PDL cells is completely abolished in the homozygously mutated cell line. Putative key mechanisms for the premature exfoliation in HPP are the restricted formation and mineralization of the cementum and the impaired insertion of elastic dental fibers. The newly generated TNAP-deficient cell lines provide a promising and donor independent in vitro model to gain better understanding of the molecular mechanisms of dental problems in HPP.

Hypophosphatasie (HPP) beschreibt eine seltene Erbkrankheit, die hauptsächlich durch heterozygote Mutationen im ALPL-Gen verursacht wird. Diese führen zu einer verminderten Aktivität der gewebeunspezifischen alkalischen Phosphatase (TNAP). Neben skelettalen Symptomen sind Zahnanomalien wie der vorzeitige Verlust von Milchzähnen ohne resorbierte Wurzel sowie eine gestörte Mineralisierung der Zahnhart-substanzen ein typisches Merkmal der HPP. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind bisher noch nicht vollständig verstanden. In der vorliegenden Arbeit wurden Zelllinien des parodontalen Ligaments mit Mutationen im ALPL-Gen charakterisiert, um anschließend mögliche Therapiestrategien für die HPP auf molekularer Ebene zu untersuchen. Im Rahmen der basalen Charakterisierung wurden die Zelllinien hinsichtlich der TNAP-Expression (Immunhistochemie, Western Blot), des Stoffwechselprofils (ATP-Assay) und des osteogenen Differenzierungspotenzials (Alizarin-Färbung) analysiert. Von Interesse war auch, ob durch CRISPR/Cas9-basiertes Genediting Off-Target Mutationen entstanden sind. Zur Untersuchung der molekularen Auswirkungen von PTH, welches die ALPL-Expression steigern kann, wurden zwei Protokolle etabliert, die eine kontinuier-liche, kurzzeitige bzw. intermittierende Präsenz von PTH in-vitro imitieren. Anschließend wurde die ALPL-Expression (qPCR) sowie TNAP-Aktivität (CSPD-Assay) ermittelt. Die basale TNAP-Expression war variabel und reichte vom völligen Fehlen in den Zell-linien mit Deletionen bis hin zu einer starken TNAP-Expression in der Zelllinie mit einer heterogenen Punktmutation. Eine niedrige Expression ging mit einer verringerten Zell-proliferation sowie extrazellulären ATP einher. Es zeigte sich ein unterschiedliches Mineralisierungspotenzial, das hauptsächlich das TNAP-Expressionsniveau in den verschiedenen Zelllinien widerspiegelt, während die PTH-Stimulation keine Wirkung auf die Differenzierung hatte. Im Gegensatz zu klinischen Beobachtungen deuten die Ergebnisse auf eine hohe Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp in-vitro hin, die in-vivo noch bestätigt werden müssen. Die Sequenzierung bestätigte, dass durch die Geneditierung keine Off-Target Mutationen aufgetreten sind, welche somit keinen limitierenden Faktor hinsichtlich der Differenzierungskapazität darstellen können. Die Stimulation mit PTH führte zwar nicht zu einer gesteigerten ALPL-Expression, doch konnte die TNAP-Aktivität in den ALPL-defizienten Zelllinien punktuell gesteigert werden und bildet somit eine solide Basis für weitere Experimente, die zur Therapieentwicklung für die Odonto-HPP beitragen können. / Hypophosphatasia (HPP) describes a rare inherited disorder caused mainly by heterozygous mutations in the ALPL gene. These lead to impaired activity of tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP). In addition to skeletal symptoms, dental abnormalities such as premature loss of deciduous teeth without resorption of the roots and impaired mineralization of tooth hard tissues are typical features of HPP. The underlying molecular mechanisms are not yet fully understood. In the present study, cell lines of the periodontal ligament with mutations in the ALPL gene were characterized to subsequently investigate potential therapeutic strategies for HPP at the molecular level. As part of the basal characterization, the cell lines were analyzed with respect to TNAP expression (immunohistochemistry, Western blot), metabolic profile (ATP assay) and osteogenic differentiation potential (alizarin staining). Also of interest was whether off-target mutations resulted from CRISPR/Cas9-based gene editing. To investigate the molecular effects of Parathyroid Hormone (PTH), which can increase ALPL expression, two protocols were established that mimic continuous, short-term, and intermittent presence of PTH in-vitro. ALPL gene expression (qPCR), as well as TNAP activity (CSPD assay) were then determined. Basal TNAP expression was variable, ranging from complete absence in the cell lines with deletions to strong TNAP expression in the cell line with a heterogeneous point mutation. Low expression was associated with decreased cell proliferation as well as extracellular ATP. There was a differential mineralization potential mainly reflecting the TNAP expression level in the different cell lines, whereas PTH stimulation had no effect on differentiation. In contrast to clinical observations, the results indicate a high correlation between genotype and phenotype in-vitro, which remains to be confirmed in-vivo. Sequencing confirmed that no off-target mutations occurred as a result of gene editing, which thus cannot be a limiting factor with respect to differentiation capacity. Although stimulation with PTH did not result in increased ALPL expression, TNAP activity was selectively increased in the ALPL-deficient cell lines, providing a solid basis for further experiments that may contribute to therapy development for Odonto-HPP.

Le gouvernement du Canada rapporte un taux d'abandon se situant en moyenne autour de 50% au doctorat (Universités Canada, 2020). Parmi les causes sous-jacentes entraînant l’interruption du programme d'études se trouve le manque d'expérience et de compétences en rédaction universitaire (Lison et Bourget, 2016). Cette lacune peut freiner la progression des étudiants dans leurs études, mais aussi, leur intégration à une communauté universitaire comme chercheurs novices. En effet, les études doctorales permettent la socialisation au métier de chercheur, alors le doctorant se doit d'intégrer les normes et les pratiques s'y rattachant (Skakni, 2011). À cette fin, il existe un dispositif qui se nomme cafés de rédaction universitaire (CRU), dont la popularité est en essor au Canada, comme dans d'autres pays occidentaux. Notre recherche doctorale de nature qualitative interprétative porte sur le phénomène de socialisation des doctorants au métier de chercheur. À ce sujet, elle vise à mieux comprendre les trajectoires de socialisation qui s'opérationnalisent entre des membres d'une communauté d’apprentissage dans le contexte des CRU. Les trajectoires de socialisation proviennent de la mise en relation des éléments de notre cadre théorique qui est composé des concepts de sentiment d'efficacité personnelle (Bandura, 1997) et d'attribution causale (Weiner, 1972). En tant qu'étude de cas instrumental (Stake, 1995), nous examinons une communauté d'apprentissage nommée Thèsez-vous Ensemble qui compte plus de 4 000 membres aux études supérieures. Pour ce faire, nous avons mené 25 entrevues semi-dirigées (Savoir-Zajc, 2009) avec des candidats au doctorat provenant de 12 universités canadiennes. Nous avons également effectué de la capture de textes numériques (Radford, 2019) à même le compte Facebook de la communauté où s'échangent des ressources utiles à la socialisation au métier de chercheur. Les résultats de la recherche ont révélé que la participation des candidats au doctorat à des CRU, en présence de leurs pairs, leur permet de rehausser leur sentiment d'efficacité personnelle et de mieux comprendre les causes attribuables à leurs réussites et leurs échecs rédactionnels. Notre étude a permis d'approfondir les connaissances face au phénomène de socialisation au métier de chercheur qui a été peu étudié dans des contextes non institutionnels. Nous avons aussi formulé des pistes d'exploration subséquentes face à des concepts théoriques, des approches méthodologiques et des terrains de recherche dans une approche multidisciplinaire en enseignement supérieur.

This thesis presents a new method to estimate the Apparent Proper Motion (APM) vector and its uncertainty for supernova light echoes (LEs) and tests its usefulness in practice on LEs due to two old Galactic supernovae (SNe) - Cas A and Tycho. Ten instances of two-dimensional cross-correlation (2-D CC) of images containing light echoes at diferent epochs are employed to examine how well this new method works in practice. The images selected for this work originate from KPNO 4m Mosaic 1.1 images and were originally processed by the Pan-STARRS pipeline. All the APM estimates reported in this thesis are within 1sigma of estimates based on supernova distance and age provided reasonable inclinations are assumed. It was found that several factors tend to reduce the expected precision of this method and these include: 1) the existence of more than one LE feature for each epoch, 2) longer intervals between the two epochs lead to a bias, and 3) the existence of dust filaments at more than one depth along the line of sight. The results of three LE fields which were in common with the previous studies by Rest et al. in 2008 and 2011, were compared and a good agreement was found between them in difference-images with the same time interval. Since pixel values have a significant role in the introduced method, a control region is considered to eliminate the defect of the irrelevant residuals to the LE features. Hence, the introduced method was not straightforward. In addition, this method was not thoroughly manual independent, as the benefits of the visual measurement from the previous method reported by Rest et al. (2008) and (2011) were adopted for this method. However, compared to the previous manual technique, there were much less manual measurements were taken for the whole LE features in one frame. Considering all the challenges, the CC method is favourable as the APM vector uncertainty can be determined, which has not been achievable with previous method before. / Thesis / Master of Science (MSc)

The development of a preimplantation embryo is a stepwise process consisting of morphological, biochemical, and genomic changes. Much remains unknown about the attainment of embryo competency to develop and establish pregnancy. To investigate this, we compared methods of selection at the oocyte or embryo level for improved blastocyst production. Brilliant cresyl blue staining was used to sort oocytes by their growth status (not fully grown vs. fully grown) and the timing of the first embryonic cell division to sort embryos. We found that an embryo's cleavage kinetics are more indicative of their competency than the growth status of the oocyte that gave rise to that embryo. We further investigated the cryopreservation survival of embryos with fast or slow cleavage kinetics and found no significant differences in their ability to hatch post-thawing. Next, we used the complete sequence of the cattle Y chromosome to identify oligonucleotides for efficient sexing of samples. These materials may be used to understand sexual dimorphism as a biological factor in future experiments. Finally, we designed a new method to induce targeted DNA sequence deletions and mRNA cleavage in zygotes using CRISPR-Cas. We targeted the gene OCT4, since the literature shows variable knockout outcomes. Our method improved deletion efficiency while accounting for preexisting or maternally inherited mRNA of the target gene. Our findings can be used to better understand early embryo development and biological drivers of quality, which can be leveraged to improve embryo production and transfer outcomes. / Master of Science / The development of an early embryo involves many biological and structural changes. Much remains unknown about the influences on embryo quality and ability to successfully develop. To investigate this, we compared methods for selecting the highest quality cattle eggs or embryos. We found that the observation of an embryo's development speed is better for selecting high quality embryos than egg quality. We further investigated the freezing survival of embryos with fast or slow growth. We found that the freezing survival of fast and slow growing embryos is not different. Next, we used the complete sequence of the cattle Y chromosome to identify PCR primers for determining sample sex. These resources can help us understand how an individual's sex can influence biological differences. Finally, we designed a new method for removing the total function of a gene in embryos. For this, we deleted segments of DNA and cut RNAs. Our findings can be used to better understand early embryo development and biological drivers of quality, which can be leveraged to improve embryo production and transfer outcomes.

L’implication d’une infirmière agente locale de changement (IALC) peut faciliter l’implantation d’un programme multidimensionnel et multidisciplinaire d’interventions de soins palliatifs (PMMISP) destiné aux personnes atteintes de démence avancée vivant en centre d’hébergement et de soins de longue durée (CHSLD). À l’aide de la version intégrée du cadre conceptuel Promoting Action on Research Implementation in Health Services (i- PARIHS), une étude de cas unique visait à identifier les caractéristiques de cette infirmière ainsi que les activités organisées par cette dernière pour faciliter l’implantation du programme. Ce cadre a également été utilisé afin d’identifier les éléments ayant favorisé ou limité cette implantation. Cette étude a été réalisée dans quatre unités de soins d’un CHSLD de Québec. Les données recueillies sont issues d’entrevues individuelles (n=3) et de groupes de discussion (n=5) auprès de I’IALC, ainsi que de professionnels de la santé, bénévoles et gestionnaires, d’une période d’observation directe et participante d’une durée de 15 mois et de l’étude de documents officiels. Les résultats suggèrent que la crédibilité de l’infirmière ALC, certaines de ses qualités personnelles, dont l’authenticité, le respect, la disponibilité, l’enthousiasme ainsi que ses habiletés de gestion de projet, de communication et d’autonomisation du personnel soignant ont particulièrement contribué à faciliter l’implantation du PMMISP. Parmi les activités de facilitation organisées par l’infirmière ALC, la consultation régulière des infirmières, infirmières auxiliaires et préposés aux bénéficiaires et leur participation à la prise de décisions ont tout particulièrement facilité le processus d’implantation. L’adéquation entre le contenu du programme implanté, les besoins et les valeurs du milieu ainsi que le soutien indéfectible de la direction ont également favorisé cette implantation tandis que la pénurie de personnel qualifié, la difficulté pour les infirmières à exercer pleinement leur rôle en raison de leurs nombreuses tâches cléricales et administratives et la disponibilité d’une seule IALC l’ont limitée / The involvement of a local change agent nurse (LCAN) can facilitate the implementation of a multidisciplinary and multidimensional palliative care intervention program (MMPCIP) for patients with advanced dementia in a long-term care centre (LTCC). The integrated version of the Promoting Action on Research Implementation in Health Services (i-PARIHS) framework was used in a single-case study design aiming to identify the different characteristics of the LCAN and activities she performed to facilitate the implementation of the program, as well as the elements promoting and limiting this implementation. The use of the i-PARIHS framework also enabled identification of contextual elements that promoted or limited this implementation. The study was conducted in four different care units within the same LTCC. Data was collected through individual (n=3) and group interviews (n=5), with the LCAN, health professional, managers and volunteers, a 15-month direct and participatory observation period and review of official documentation. Results suggest that the LCAN’s credibility, personal qualities including authenticity, respect, accessibility and enthusiasm, as well as her skills in project management, communication and the empowerment of caregiving staff were instrumental in facilitating the implementation of the palliative care intervention program. Of the activities organized by the LCAN, those enabling the involvement of nurses, nursing assistants and nursing aides through regular consultation and participation in the decision process were particularly critical in facilitating implementation Elements that promoted the implementation included the alignment of the program with the stakeholders’ values and needs, and strong support from management, while limiting factors included a lack of qualified personnel, nurses being restricted in their role by an overload of clerical and administrative tasks, and the presence of a single LCAN

La présente recherche s'inscrit dans une démarche de diffusion du savoir sur les ambiances architecturales et urbaines. Elle propose d'aider à la lecture des ambiances physiques, à travers une technique de représentation compilant dans une interface numérique deux types de données, sensorielles et filmiques. Ces données sont relevées grâce à un casque muni de senseurs (APMAP, Potvin 1997, 1999, 2004) ainsi que la prise d'information vidéo de l'environnement en mouvement. La méthode est baptisée APMAP/Vidéo. Le mémoire en présente les différentes phases de développement ainsi que son utilisation dans une étude de cas. Le chapitre 1 traite des ambiances physiques dans leur fonctionnement et leurs composantes, puis dresse un bilan sur les modes de représentation adaptés à celles-ci. Le chapitre 2 introduit la technique APMAP/VIDÉO, ses critères de développement et le choix des outils. Le chapitre 3 présente les étapes de réalisation. Le chapitre 4 porte sur l'application de la technique dans le cadre d'un relevé. Le chapitre 5 dresse finalement le bilan de la technique, les avantages et les limites de son utilisation. Étant donné que la technique élaborée exploite la dimension spatiale et temporelle des ambiances, son mode de représentation est dynamique. Un CD ROM accompagne le texte, permettant de visualiser les séquences des différentes versions, du prototype à la version finale, ainsi que les fichiers informatiques nécessaires à une utilisation éventuelle.

Ce mémoire s'intéresse à la construction identitaire des étudiants originaires de milieux francophones minoritaires au Canada. Dans une perspective sociologique, cette recherche est basée sur une étude de cas auprès de 21 étudiants francophones originaires de la Saskatchewan, de l'Ontario et du Nouveau-Brunswick. La cueillette des données a été réalisée à partir d'entretiens individuels semi-dirigés de type récits de vie. Les données ont été analysées à partir d'un cadre théorique qui s'inscrit dans la perspective de l'interactionnisme symbolique. Selon cette approche, l'identité est le produit des diverses interactions que vit un individu au cours de sa vie. Les résultats de l'analyse des épisodes d'interaction montrent que le contact avec l'autre conduit à une négociation qui permet aux étudiants de se (re)définir et de se (ré)affirmer au plan identitaire. Ce mémoire contribue au développement de connaissances utiles dans le champ de l'orientation en ce qui concerne les transitions étudiantes et la construction identitaire.

Cette recherche vise à étudier la relation entre la morphologie urbaine, les microclimats et le confort thermique dans les espaces publics extérieurs par des relevés dynamiques in situ. En milieu urbain, les paramètres microclimatiques tels que la chaleur et la lumière peuvent varier en fonction de l'espace et du temps. Ces variations souvent générées par la morphologie urbaine peuvent être plus au moins appropriées aux conditions du confort thermique et visuel, dépendamment des facteurs tels que les conditions climatiques, la forme des constructions, la nature de l'espace et son mode d'occupation. C'est dans une optique plutôt physiologique que nous avons exploré la diversité de l'environnement thermique et visuel en milieu urbain. Le but est de démontrer l'effet de cette dynamique environnementale sur la perception des ambiances thermiques et visuelles d'un piéton. Les données sur l'environnement thermique et visuel de trois tissus urbains situés au centre-ville de Québec ont été mesurées en mouvement à l'aide d'un appareil portatif de mesure des ambiances physiques (APMAP-4). Les calculs des indicateurs de la morphologie urbaine sont basés sur plusieurs techniques (mesure sur carte, traitement d'images satellites et relevés photographiques). Le croisement des données a permis de (1) démontrer la dynamique de l'environnement thermique et visuel d'un parcours urbain, (2) d'analyser les conditions du confort thermique de trois tissus urbains et (3) d'identifier les différents niveaux d'adaptation caractérisant un parcours urbain pendant une journée typique d'été et l'automne.