Submitted by LARISSA SPÓSITO null (lari_sposito@hotmail.com) on 2017-07-27T13:11:28Z No. of bitstreams: 1 Dissertação versão final encaminhada pós- PDF.pdf: 2246283 bytes, checksum: 9ebe4c751ba29fc9cf4495fdb7288e5e (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-07-31T18:31:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 sposito_l_me_arafcf.pdf: 2393152 bytes, checksum: cd33f70c4383729bdf5dc49ce9d3375f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-31T18:31:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sposito_l_me_arafcf.pdf: 2393152 bytes, checksum: cd33f70c4383729bdf5dc49ce9d3375f (MD5) Previous issue date: 2017-06-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O uso de produtos naturais na terapêutica convencional vem ganhando destaque nos últimos anos com relação a atividade antimicrobiana devido à alta taxa de efeitos tóxicos e ao excessivo crescimento do número de cepas multirresistentes aos antimicrobianos convencionais empregados na prática. Entre as novas triagens terapêuticas frente às afecções bacterianas, as infecções causadas pelo Helicobacter pylori merecem atenção especial, uma vez que estão diretamente relacionadas com quadros clínicos severos, como a gastrite crônica, úlcera péptica e câncer gástrico. A Casearia sylvestris Swartz é uma planta popularmente conhecida como guaçatonga ou erva-de-bugre, utilizada na medicina popular no tratamento de transtornos gástricos que nos últimos anos vem despertando interesse na comunidade científica, por suas importantes propriedades com potencial terapêutico como atividade anti-inflamatório, antiofídico, cicatrizante, citotóxica em linhagens de células tumorais e principalmente antiulcerogênica. Neste contexto, uma excelente alternativa para o aprimoramento dos parâmetros biodisponíveis dos extratos vegetais muito utilizada na atualidade é a incorporação destes em sistemas nanotecnológicos de liberação de fármaco para que o produto ativo tenha uma melhor ação. Deste modo, o presente trabalho teve por objetivo avaliar o potencial biológico antibacteriano in vitro do extrato etanólico, extrato aquoso, fração e subfrações das folhas de Casearia sylvestris Swartz, incorporar em um sistema de liberação de fármacos os derivados mais ativos e a partir dos resultados realizar o experimento in vivo contra a cepa ATCC 43504 de H. pylori. Os extratos foram preparados por infusão e maceração. Para as análises biológicas utilizamos a técnica de microdiluição para determinar a concentração inibitória mínima e o biofilme formado. O estudo foi desenvolvido aplicando-se metodologias in vitro e in vivo para elucidar o perfil antibacteriano pretendido, obtendo-se resultados satisfatórios, deixando esse estudo mais interessante, já que a literatura mostra que a C.sylvestris tem perfil anti-ulcerogênico. A partir desses resultados pudemos concluir que os derivados de C. sylvestris apresentaram estatisticamente atividades antibacterianas tanto in vitro como in vivo, sendo que a maioria dos derivados vegetais com exceção dos extratos aquosos, fração 1 e 3 e a subfração 17, tiveram alguma atividade frente ao micro-organismo. Essa atividade provavelmente esta relacionada aos diterpenos clerodânicos que estão em abundância nos derivados da C. sylvestris. A incorporação no sistema nanoestruturado não potencializou a atividade dos derivados vegetais como esperado na maioria dos teste, isto talvez seja pelo fato de a composição dos derivados vegetais e do sistema não serem compatíveis quimicamente. Desde que a literatura mostrou a atividade antiulcerogênica dos derivados vegetais da C. sylvestris, eles podem ser utilizados tanto na cicatrização das lesões como também para a erradicação do H. pylori. / The use of natural products in conventional therapeutics has been gaining highlight in recent years relative to the antimicrobial activity due to the high rate of toxic effects and the excessive growth of the number of multiresistant strains to he conventional antimicrobials used in practice. Among the new therapeutic screenings for bacterial diseases, infections caused by Helicobacter pylori deserve special attention, since they are directly related to severe clinical conditions, such as chronic gastritis, peptic ulcer and gastric cancer. Casearia sylvestris Swartz is a plant popularly known as guaçatonga or erva-de-bugre, used in popular medicine to the treatment of gastric disorders that in recent years has gained the interest of the scientific community due to its important properties with therapeutic potential as an anti-inflammatory, antiofidic, healing, cytotoxicity against tumor cells and mainly antiulcerogenic. In this context, an excellent alternative for the improvement of the bioavailability parameters of the vegetal extracts that is used today is the incorporation of these in nanotechnological systems of drug release so that the active product has a better action. Thus, the aim of this study was to evaluate the in vitro antibacterial potential of the ethanolic extract, aqueous extract, fraction and subfractions of the leaves of Casearia sylvestris Swartz, and incorporate into a drug delivery system the most active derivatives and from these results carry out the in vivo experiment against the H. pylori ATCC strain. The extracts were prepared by infusion and maceration. For the biological analyzes we use the microdilution technique to determine the minimum inhibitory concentration and the formed biofilm. The study was developed applying in vitro and in vivo methodologies to elucidate the antibacterial profile. From the results, we can conclude that the C. sylvestris derivatives showed statistically antibacterial activities both in vitro and in vivo. Most of the vegetal derivatives with the exception of aqueous extracts, fractions 1 and 3 and subfraction 17, had some activity against to the microorganism. This activity is probably related to clerodan diterpenes that are abundant in C. sylvestris derivatives. The incorporation into the nanostructured system did not potentiate the activity of the vegetable derivatives as expected in most tests, this is perhaps due to the fact that the composition of the plant derivatives and the system are not chemically compatible. Since the literature shows an antiulcerogenic activity of C. sylvestris derivatives, they could be used both for wound healing and for H. pylori eradication.

A planta Casearia sylvestris, popularmente conhecida como guaçatonga, é comumente utilizada para o tratamento de diversas afecções como queimaduras, ferimentos, herpes labial e genital, distúrbios do trato gastrointestinal, como gastrites, úlceras, gengivites, aftas, halitose; além disto, atribui-se à planta ação cicatrizante, tônica, depurativa, anti-reumática, antiinflamatória, antiofídica, antidiarréica, entre outras. Atualmente, é catalogada como planta medicinal de interesse ao Sistema Único de Saúde no Brasil. Entretanto, até o momento, não haviam estudos relativos à avaliação de sua toxicidade. Assim, o objetivo desta pesquisa foi o de estudar, em ratos, os possíveis efeitos tóxicos da C. sylvestris. Para tal, foram realizados os testes de citotoxicidade com o objetivo de analisar o potencial tóxico das diferentes formas de extração da planta, e estudos pré-clínicos de toxicidade oral aguda, e em doses repetidas, por 28 e 90 dias, realizados de acordo com protocolos preconizados pelas agências reguladoras nacionais (Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA) e internacionais (Organization for Economic Cooperation and Development - OECD) de avaliação de risco para substâncias químicas. No presente estudo, o extrato fluido (EF) de C. sylvestris foi administrado, a ratos, por via oral, através de gavagem, em dose única de 2000mg/kg; ou em doses repetidas, durante 28 ou 90 dias, nas doses 60, 120 e 240mg/kg,. Foram avaliados sinais sistêmicos de toxicidade, ganho de peso e consumo de ração, hemograma completo, avaliação bioquímica (AST, ALT, GGT, ALP, uréia, creatinina, ácido úrico, colesterol, triglicerídes, glicose, albumina, proteínas totais e cloreto), análise macroscópica e histopatológica de órgãos e avaliação do peso relativo dos órgãos linfóides baço e timo e celularidades do baço e medula óssea para averiguar os possíveis efeitos imunotóxicos. Além disso, foi obtido o perfil cromatográfico (fingerprint) utilizando a técnica analítica CLAE/UV. Os resultados mostraram que o EF de C. sylvestris não causou efeitos tóxicos quando administrado em dose única 2000mg/kg no estudo de toxicidade aguda, assim como também não mostrou efeitos sistêmicos de toxicidade ou efeitos imunotóxicos nos estudos em doses repetidas por 28 e 90 dias. Estes dados aqui encontrados permitem sugerir que o EF da C.sylvestris é seguro quando utilizado mesmo prolongadamente. No entanto, outros estudos, como por exemplo, de genotoxicidade e de carcinogenicidade, devem ser realizados para complementar esta etapa de avaliação pré-clínica. / Casearia sylvestris Sw commonly known in Brazil as guaçatonga, is currently used to treat many diseases such as burns, wounds, labial and genital herpes, gastrointestinal disorders- gastritis, ulcers, gingivitis, aphthae and halitoses. C.sylvestris has been also used as cicatrizant in skin diseases, blood purifier and general detoxification, anti-inflammatory, antiofidic, diarrhea, among others. In our country it is considered as medicinal plant and for this reason C.sylvestris is catalogued at The Unified Health System (Sistema Único de Saúde - SUS) as a plant of interest for Brazilian population .However, no toxicological studies concerned the safety of extract fluid of this plant have been reported. Thus, the aim of this study was to evaluate the possible toxic effects of fluid extract (EF) of C. sylvestris. For this, it was performed citotoxicity tests in order to analyze the toxic potential of different extracts of the plant. It was also performed preclinical studies, in rats, according the guidelines proposed by National Health Surveillance Agency (Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA) and OECD (Organization for Economic Cooperation and Development) being performed the following tests: acute oral toxicity and repeated dose 28 and 90-day. The EF of C. sylvestris was administered by gavage at a single dose of 2000 mg/kg, or during 28 and 90 days with doses 60, 120 e 240mg/kg. It was evaluated systemic signs of toxicity, body weights and food consumption, hematology, serum biochemistry (AST, ALT, GGT, ALP, urea: creatinine, uric acid cholesterol, triglycerides, glucose, albumin, total proteins, and chloride) macroscopic and histopathological analysis of different organs and evaluation of relative weight of lymphoid organs, spleen and thymus and the cellularity of spleen and bone marrow to investigated the possible immunotoxic effects. We also obtained the fingerprint chromatogram of C. sylvestris, using CLAE/UV. The results showed that there were no toxic effects by the EF when administered as a single dose at 2000mg/kg in acute toxicity study, as well as showed no systemic effects of toxicity or immunotoxic effects in studies with repeated doses of 28 and 90 days. This data suggest that the EF of the plant is safety even used for long period. However, other studies, eg, genotoxicity and carcinogenicity studies should be performed to complement the preclinical evaluation.

Submitted by Fernando Bombarda Oda null (fer_oda@fcfar.unesp.br) on 2017-07-20T17:23:30Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Fernando_Oda_Final.pdf: 7648101 bytes, checksum: f78680181e6caaa8a443897d877a8eae (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-07-21T18:30:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 oda_fb_me_arafcf_parc.pdf: 1138705 bytes, checksum: a9ec30f0d79f53facd0d1b055e2a1bc4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-21T18:30:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 oda_fb_me_arafcf_parc.pdf: 1138705 bytes, checksum: a9ec30f0d79f53facd0d1b055e2a1bc4 (MD5) Previous issue date: 2017-06-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Casearia sylvestris Swartz, conhecida como guaçatonga, está distribuída em todo Brasil e é muito utilizada na medicina popular, com registro etnofarmacológico desde 1877. Muitos desses usos, como o antiofídico, antiulcerogênico e antiinflamatório já foram comprovados em estudos farmacológicos, os quais mostraram também a baixa toxicidade aguda por via oral de seus derivados vegetais. Estudos in vivo revelaram que os diterpenos clerodânicos são os responsáveis pelas atividades antiulcerogênica e anti-inflamatória de C. sylvestris, o que valoriza ainda mais o uso medicinal desta planta. Entretanto, a constatação de que os diterpenos clerodânicos podem sofrer degradação em meio ácido levantaram dúvidas sobre quais substâncias realmente chegam aos receptores e têm atividade: diterpenos ou seus produtos de degradação? Para elucidar essa questão, os diterpenos clerodânicos isolados casearina J (cas J) e O (cas O) foram submetidos isoladamente à degradação ácida em fluido gástrico simulado sem enzimas (PDA) e, posteriormente, metabolizados com enzimas hepáticas da fração S9 (PDA-ME). A metabolização direta dos diterpenos com a fração S9 também foi realizada (PME). As respectivas casearinas remanescentes foram quantificadas em todos os produtos de metabolização. Posteriormente, foram conduzidos ensaios de síntese e/ou liberação de óxido nítrico em macrófagos RAW 267.7 estimulados por LPS in vitro. Para a determinação estrutural dos derivados formados foram utilizadas técnicas cromatográficas (CLAEDAD) e espectrométricas (CLUE-EM, RMN de 1H e 13C). Foram identificadas dez substâncias formadas após degradação ácida da cas J (PDA-J), além da casearina remanescente (5,05%) e seu epímero (PDA-J8). As estruturas propostas desses produtos resultaram da hidrólise do grupamento éster em C-18 (PDA-J1), hidrólise do grupamento éster em C-19 (PDA-J3), formação de dialdeído após quebra do anel diacetálico C (PDA-J2, majoritário), e adições nos grupos aldeídos do PDA-J2 de uma molécula de água (PDJ-7), uma (PDA-J4 e PDA-J4.1) ou duas de etanol (PDJ-5) e hidrólise do éster em C-18 do PDA-J2 (PDJ-6). Foram identificadas nove substâncias formadas após degradação ácida da cas O, além da casearina remanescente (13,1%). Suas estruturas resultaram da hidrólise dos grupos ésteres em C-18 (PDA-O1) e C-19 (PDA-O3), formação do dialdeído após quebra do anel C (PDA-O2, majoritário), adições nos grupos aldeídos do PDA-O2 de uma (PDA-O4 e PDA-O 4.1) ou duas moléculas de etanol (PDA-O5) e hidrólise do éster em C-7 do PDA-O2 (PDA-O5), além da hidrólise do grupamento esterificado em C-6 do PDA-O5 (PDA-O6 ou PDA-O6.1). A metabolização da cas J pela fração S9 gerou duas substâncias correspondentes à quebra do butanoato em C-18 (PME-J1) e formação do seu epímero (PME-J2), permanecendo 36,8% íntegra. Em relação à metabolização da cas O, 36,5% permaneceu íntegra, e ocorreu a formação de uma molécula após quebra dos substituintes esterificados em C-18 e C-19 (PME-O1) e de outra após a formação do dialdeído no anel C (PME-O2). As análises indicaram que as metabolizações enzimáticas dos PDA resultaram nas mesmas substâncias. Os ensaios em macrófagos estimulados por LPS in vitro mostraram que os produtos de degradação ácida e/ou metabolização enzimática das casearinas não têm atividade antiinflamatória in vitro na inibição da liberação e/ou produção de NO, igualmente às casearinas J e O íntegras. / Casearia sylvestris Swartz known as guaçatonga is distributed throughout Brazil and has been widely used in folk medicine since 1877. Many of these uses, such as anti-fungal, antiulcerogenic and anti-inflammatory, have already been proven in pharmacological studies, also demonstrating low acute oral toxicity. In vivo studies have shown that clerodane diterpenes are responsible for the antiulcerogenic and antiinflammatory activities of C. sylvestris, which further enhances the medicinal use of this plant or its derivatives. However, the finding that clerodane diterpenes may suffer degradation in acid medium have raised doubts about the actual substances reached the receptors and carry out activity: diterpenes or their degradation products? In order to elucidate this issue, purified clerodane diterpenes casearin J (cas J) and O (cas O) were subjected to acid degradation in simulated gastric fluid without enzymes (PDA) alone and subsequently metabolized with S9 fraction (PDAME) liver enzymes. A direct metabolization of diterpenes with a S9 fraction (PME) was also performed. Respective remaining casearins were quantified in all the metabolizing products. In the end, macrophage stimulated by LPS in vitro assays of nitric oxide synthesis were conducted using as sample the purified cas J and O, PDA, PME and PDAME. Chromatographic (HPLC-PDA) and spectrometric techniques (UPLC-PDA-MS, 1H and and 13C NMR) were used for the structural determination of the generated derivatives. Ten substances were identified after the acid degradation of cas J (PDA-J), in addition to the remaining casearin (5.05%) and its epimer. Proposed structures of these compounds result of ester group hydrolysis in C-18 (PDA-J1), and in C-19 (PDA-J7), dialdehyde formation after diacetal C ring breaking (PDA-J2, majority), and additions in the aldehyde groups of the PDA-J2 of a water molecule (PDJ-3), one (PDA-J4 and PDA-J4.1) or two ethanol molecules (PDJ-5) and ester hydrolysis in C-7 of PDA-J2 (PDJ-6). Besides the remaining cas O (13.1%), nine compounds were identified after acid degradation. Their structures result of hydrolysis of the esterified groups in C-18 and C-19 (PDA-O1), dialdehyde formation after C-ring rupture (PDA-O2, majority), additions in the PDA-O2 aldehyde groups of one (PDA-O3 and PDA -O3.1) or two ethanol molecules (PDA-O4) and ester hydrolysis at C-6 (PDA-O5). Metabolization of casearin J by the S9 fraction generated two substances corresponding to the breakdown of n-butanoate in C-18 (PME-J1) and formation of cas J epimer (PME-J2), remaining 36.8% intact. In relation to the metabolization of casearin O, 36.5% remained intact and one molecule was formed after breaking the esterified substituents in C-6 and C-7 (PME-O1) and the other after the formation of dialdehyde at C ring (PME-O2). The analyzes indicated that the enzymatic metabolism of the PDA resulted in the same substances. In vitro LPS stimulated macrophage assays have shown that PDA and PME do not have in vitro anti-inflammatory activity of NO inhibition, as well as intact J and O casearins. / CNPq: 130329/2015-0

A planta Casearia sylvestris, popularmente conhecida como guaçatonga, é comumente utilizada para o tratamento de diversas afecções como queimaduras, ferimentos, herpes labial e genital, distúrbios do trato gastrointestinal, como gastrites, úlceras, gengivites, aftas, halitose; além disto, atribui-se à planta ação cicatrizante, tônica, depurativa, anti-reumática, antiinflamatória, antiofídica, antidiarréica, entre outras. Atualmente, é catalogada como planta medicinal de interesse ao Sistema Único de Saúde no Brasil. Entretanto, até o momento, não haviam estudos relativos à avaliação de sua toxicidade. Assim, o objetivo desta pesquisa foi o de estudar, em ratos, os possíveis efeitos tóxicos da C. sylvestris. Para tal, foram realizados os testes de citotoxicidade com o objetivo de analisar o potencial tóxico das diferentes formas de extração da planta, e estudos pré-clínicos de toxicidade oral aguda, e em doses repetidas, por 28 e 90 dias, realizados de acordo com protocolos preconizados pelas agências reguladoras nacionais (Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA) e internacionais (Organization for Economic Cooperation and Development - OECD) de avaliação de risco para substâncias químicas. No presente estudo, o extrato fluido (EF) de C. sylvestris foi administrado, a ratos, por via oral, através de gavagem, em dose única de 2000mg/kg; ou em doses repetidas, durante 28 ou 90 dias, nas doses 60, 120 e 240mg/kg,. Foram avaliados sinais sistêmicos de toxicidade, ganho de peso e consumo de ração, hemograma completo, avaliação bioquímica (AST, ALT, GGT, ALP, uréia, creatinina, ácido úrico, colesterol, triglicerídes, glicose, albumina, proteínas totais e cloreto), análise macroscópica e histopatológica de órgãos e avaliação do peso relativo dos órgãos linfóides baço e timo e celularidades do baço e medula óssea para averiguar os possíveis efeitos imunotóxicos. Além disso, foi obtido o perfil cromatográfico (fingerprint) utilizando a técnica analítica CLAE/UV. Os resultados mostraram que o EF de C. sylvestris não causou efeitos tóxicos quando administrado em dose única 2000mg/kg no estudo de toxicidade aguda, assim como também não mostrou efeitos sistêmicos de toxicidade ou efeitos imunotóxicos nos estudos em doses repetidas por 28 e 90 dias. Estes dados aqui encontrados permitem sugerir que o EF da C.sylvestris é seguro quando utilizado mesmo prolongadamente. No entanto, outros estudos, como por exemplo, de genotoxicidade e de carcinogenicidade, devem ser realizados para complementar esta etapa de avaliação pré-clínica. / Casearia sylvestris Sw commonly known in Brazil as guaçatonga, is currently used to treat many diseases such as burns, wounds, labial and genital herpes, gastrointestinal disorders- gastritis, ulcers, gingivitis, aphthae and halitoses. C.sylvestris has been also used as cicatrizant in skin diseases, blood purifier and general detoxification, anti-inflammatory, antiofidic, diarrhea, among others. In our country it is considered as medicinal plant and for this reason C.sylvestris is catalogued at The Unified Health System (Sistema Único de Saúde - SUS) as a plant of interest for Brazilian population .However, no toxicological studies concerned the safety of extract fluid of this plant have been reported. Thus, the aim of this study was to evaluate the possible toxic effects of fluid extract (EF) of C. sylvestris. For this, it was performed citotoxicity tests in order to analyze the toxic potential of different extracts of the plant. It was also performed preclinical studies, in rats, according the guidelines proposed by National Health Surveillance Agency (Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA) and OECD (Organization for Economic Cooperation and Development) being performed the following tests: acute oral toxicity and repeated dose 28 and 90-day. The EF of C. sylvestris was administered by gavage at a single dose of 2000 mg/kg, or during 28 and 90 days with doses 60, 120 e 240mg/kg. It was evaluated systemic signs of toxicity, body weights and food consumption, hematology, serum biochemistry (AST, ALT, GGT, ALP, urea: creatinine, uric acid cholesterol, triglycerides, glucose, albumin, total proteins, and chloride) macroscopic and histopathological analysis of different organs and evaluation of relative weight of lymphoid organs, spleen and thymus and the cellularity of spleen and bone marrow to investigated the possible immunotoxic effects. We also obtained the fingerprint chromatogram of C. sylvestris, using CLAE/UV. The results showed that there were no toxic effects by the EF when administered as a single dose at 2000mg/kg in acute toxicity study, as well as showed no systemic effects of toxicity or immunotoxic effects in studies with repeated doses of 28 and 90 days. This data suggest that the EF of the plant is safety even used for long period. However, other studies, eg, genotoxicity and carcinogenicity studies should be performed to complement the preclinical evaluation.