The design and development of fluorescent reporters focussed on highly sensitive, specific, and selective imaging of cancer targets is described. These novel optical molecular probes were synthesised with the aim of creating bio-imaging breakthroughs that will aid the clinical analysis of cancer. A specific target of the project was to develop fluorescent reporters for Caspases; intracellular endopeptidases that play an essential role in apoptosis. Lack of activation of the ‘Caspase Cascade’ causes uncontrolled proliferation of cells and has been deemed a ‘Hallmark of Cancer’. In particular, low Caspases-3/7 activities have been associated with a range of cancers, thus molecular detection of Caspases-3/7 activities could therefore lead to advances in oncology. A 14-member FRET library, based upon Caspases-3/7 specific peptide sequences, was initially developed. The cleavage rates and KM values were evaluated for Caspases-3/7, along with the cleavage rates for Cathepsin B, to determine the peptide with the greatest affinity and specificity for Caspase-3. Also developed was a set of internally quenched activity based molecular reporters constructed by attaching fluorophores to a tribranched dendron through the Caspase specific peptide, developed from the FRET Library. The KM values of the dendron probes with Caspase-3 were also evaluated. Furthermore, the dendron reporters were attached to cell penetrating peptides to enable delivery to intracellular Caspase and allow in situ detection of activated Caspase-3 within live cells. In addition, a new labelling moiety was developed enabling dual detection of reporters through fluorescence and MRI imaging. To achieve this, a perfluoro tag (C8F17) was tethered to a Cy5 dye to enable dual detection. The dual 19F-MRI/Cy5 dye was conjugated onto to a cell penetrating peptide to enable in vivo detection of the probe by 19F-MRI and fluorescent imaging.

No description available.

Apoptosis is executed by caspase-mediated cleavage of various proteins. Elucidating the consequence of substrate cleavage provides us with insight into cell death and other biological processes. In this study, we applied the diagonal gel approach, a proteomic strategy, to identify substrates of the inflammatory caspase, caspase-1 and the cell death executioner caspase, caspase-3. Our results showed significant overlap between the substrates cleaved by both caspase-1 and -3. Such substrates are implicated in common cellular functions, including maintenance of the cytoskeleton, folding of proteins, translation, glycolysis, bioenergetics, signaling and trafficking. An important finding is that many glycolysis enzymes were targeted specifically by caspase-1. Processing of these glycolysis enzymes by caspase-1 was confirmed by cleaving in vitro transcribed and translated substrates with recombinant caspase-1. We have focused our further analysis on certain glycolysis enzymes. We have characterized the caspase-1 cleavage site in GAPDH. Point mutation of the Aspartic acid at position 189 to Alanine (D189A) in GAPDH blocked its cleavage by caspase-1. In vivo, in a mice model of septic shock, characterized by hyperactivation of caspase-1, we observed depletion of the full-length forms of these glycolysis enzymes in the diaphragm muscle. Further studies in caspase-1 deficient mice will confirm whether this depletion, in caspase-1 proficient mice, was due to caspase-1 processing of the glycolysis enzymes. This provides a direct link between caspase-1 activation and inhibition of glycolysis, which might have important implications on loss of muscle contractility in septic shock.

No description available.

O estresse causa modificações no epitélio intestinal, tais como o aumento de células caliciformes e da taxa de apoptose. O uso de alimentos nutracêuticos tem sido uma alternativa para amenizar essas modificações sobre o tecido epitelial. Desta forma, este trabalho teve como objetivo avaliar se a inclusão de colostro bovino, o qual é constituído de fatores antioxidantes, imunes e de crescimento, seria capaz de amenizar as consequências do estresse crônico sob o intestino. Para isso, juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus) adensados a 50 kg/m3 foram alimentados duas vezes ao dia até a saciedade com ração peletizada e semi-purificada sem (0%CBL) e com a inclusão de colostro bovino liofilizado em concentrações crescentes (10, 20 e 30%CBL), (n=4). Após 28 dias, foram coletados segmentos do intestino médio, S1 e S2, e reto. Os tecidos foram marcados com corantes histológicos para a quantificação de células caliciformes contendo mucinas neutras, ácidas (incluindo sialo e sulfomucinas) e ácidas-neutras. Também foram mensurados o volume (Vv) e a densidade da superfície (Sv) da mucosa, por análise estereológica, e a espessura da camada muscular. A razão do número de cada tipo e subtipo de célula caliciforme sobre o Vv e Sv foi calculada para estimar a densidade de células caliciformes, Dv e Ds, respectivamente. A taxa apoptótica foi analisada qualitativamente através da intensidade (alta, média e baixa) da imunomarcação da caspase-3 nas células epiteliais. As dietas não influenciaram os parâmetros zootécnicos analisados (P>0,05). No reto, os grupos que receberam 20 e 30%CBL apresentaram menor número de células caliciformes contendo sulfomucinas e menor Ds em relação a 0 e 10% (P=0,0148 e 0,0198, respectivamente). No RT, Dv total e Dv de células caliciformes contendo mucinas ácidas foi maior em 0 e 30%CBL em relação a 20%CBL (P=0,0155 e 0,225, respectivamente). No S1, 10 e 30%CBL apresentaram maior Dv em relação a 20%CBL (P=0,0540). A espessura da camada muscular, o Vv e a Sv não diferiram entre os tratamentos (P>0,05). No S2 e RT, a taxa de apoptose teve relação inversa à concentração de colostro bovino liofilizado adicionado na ração. Nos três segmentos, houve maior proporção de células caliciformes contendo mucinas ácidas do que neutras, sendo a maioria representada por sulfomucinas. Assim, a inclusão de colostro bovino liofilizado nas rações de juvenis de pacu adensados diminuiu a apoptose nos segmentos intestinais S2 e RT e também diminuiu o número de células caliciformes contendo sulfomucinas no RT, indicando que o colostro bovino liofilizado pode ser utilizado como alimento nutracêutico para pacus (Piaractus mesopotamicus) adensados, a fim de diminuir a taxa apoptótica e proteger o intestino contra enzimas bacterianas, uma das principais funções das sulfomucinas. / The stress causes changes in the intestinal epithelium, such as the increase in the number of goblet cells and on the rate of apoptosis. The use of nutraceutical foods has been an alternative to soften these modifications on the epithelial tissue. Thus, this study aimed to evaluate if the inclusion of bovine colostrum, which is composed of antioxidant, immune and growth factors, would be able to attenuate the consequences of chronic stress on the intestine. For this, pacu juveniles (Piaractus mesopotamicus), stocked at density of 50 kg/m3, were fed twice daily until satiety with pelleted and semi-purified diet without (0% LBC) and with the inclusion of lyophilized bovine colostrum in increasing concentrations (10, 20 and 30% LBC), (n = 4). After 28 days, segments of the middle gut, S1 and S2, and rectum (RT) were collected. The tissues were stained with histological dyes for the quantification of goblet cells containing neutral, acidic (including sialo and sulphomucins) and acid-neutral mucins. The volume (Vv) and surface density (Sv) of the mucosa were also measured by stereological analysis and the thickness of the muscular layer. The ratio between the number of each goblet cell type and subtype and the Vv or Sv was calculated to estimate the density of goblet cells, Dv and Ds, respectively. The apoptotic rate was analyzed qualitatively according to the intensity (high, medium and low) of caspase-3 immunostaining in epithelial cells. The diets did not influence the zootechnical parameters analyzed (P> 0.05). In the rectum, the groups that received 20 and 30% LBC presented lower number of goblet cells containing sulphomucins and lower Ds in relation to 0 and 10% (P = 0.0148 and 0.0198, respectively). In RT, total Dv and Dv of goblet cells containing acid mucins were higher in 0 and 30% LBC in relation to 20% LBC (P = 0.0155 and 0.225, respectively). In S1, 10 and 30% LBC presented higher Dv in relation to 20% LBC (P = 0.0540). Muscle layer thickness, Vv and Sv did not differ between treatments (P> 0.05). In S2 and RT, the rate of apoptosis was inversely related to the concentration of lyophilized bovine colostrum added in the diet. In the three segments, there was higher proportion of goblet cells containing acidic than neutral mucins, most of them being sulphomucins. Thus, the inclusion of lyophilized bovine colostrum in diets of pacu juveniles reduced apoptosis in the intestinal segments S2 and RT and also decreased the number of goblet-containing sulphomucins in the RT, indicating that lyophilized bovine colostrum can be used as a nutraceutical feed for pacus (Piaractus mesopotamicus) under high stocking density to decrease the apoptotic rate and protect the intestine against bacterial enzymes, one of the main functions of sulphomucins.

A apoptose é um processo fisiológico que desempenha papel crucial no desenvolvimento, remodelagem e senescência teciduais, inclusive placentários. A placenta, enquanto órgão temporário, atravessa todas estas fases em aproximadamente 10 meses, na espécie bubalina. O crescimento da placenta e a nutrição fetal requerem altas taxas de renovação e diferenciação celulares, e a maturação placentária está relacionada à redução das células epiteliais das criptas carunculares maternas. As modificações morfológicas celulares decorrentes do processo de apoptose são fruto de eventos bioquímicos complexos promovidos por uma família de cisteína-proteases, as caspases, especialmente as caspases executoras, dentre as quais se destaca a caspase-3, capaz de degradar várias proteínas citoplasmáticas e nucleares. Durante a apoptose, ocorre a clivagem caspase-mediada da citoqueratina 18, proteína dos filamentos intermediários do citoesqueleto, e com isso a formação de um neoepítopo específico. Por meio de métodos imunoistoquímicos pode-se detectar a presença tanto deste neoepítopo, quanto da forma ativa da caspase-3, o que demonstra que a célula entrou em estágio irreversível de morte celular. Morfologicamente, algumas das principais alterações celulares observadas são condensação da cromatina, a degradação e fragmentação do DNA, a formação de ?blebs? (pregas/bolhas) na membrana plasmática, além da fragmentação celular em corpúsculos apoptóticos, os quais podem ser identificados em cortes corados pelo método de rotina hematoxilina e eosina, utilizando-se microscópio de imunofluorescência, devido à eosinofluorescência das células em apoptose. Assim como a apoptose, a proliferação celular participa no equilíbrio homeostático tissular. Neste estudo, pretende-se avaliar a ocorrência de apoptose e proliferação celular em 42 placentônios de diferentes animais em diversas fases gestacionais (2-10 meses de gestação), em tecidos fixados em 4% paraformoldeído, incluídos em paraplast e submetidos à imunoistoquímica (anticorpo monoclonal M30 CytoDeath; Caspase-3 Clivada; PCNA - antígeno de marcação nuclear), sendo também avaliada a presença de corpúsculos apoptóticos eosinofluorescentes nas amostras. Utilizando-se M30 e caspase-3 clivada pudemos constatar a ocorrência de apoptose nos epitélios uterino e trofoblástico, em células gigantes placentárias e, ocasionalmente, em células mesenquimais fetais, do estroma uterino e endoteliais. Não houve diferenças significativas (p<0.05) entre os métodos adotados, mas sim entre os estágios gestacionais. Para o M30, houve um aumento significante da apoptose do primeiro grupo (2-4.5 meses) em relação ao quarto grupo (9-10 meses); no caso da Caspase-3 Clivada houve um aumento estatísticamente significante (p<0.05) entre os três primeiros grupos (2-4.5; 5-6.5; e 7-8.5 meses de gestação, respectivamente) de animais em relação ao quarto grupo. Para o PCNA, ocorreu uma diminuição no número de células em proliferação dos dois primeiros grupos de animais em relação ao quarto grupo (p<0.05). A presença de corpúsculos apoptóticos eosinofluorescentes pôde ser observada em todas as amostras. Nossos resultados sugerem haver uma relação entre a ocorrência de apoptose e a maturação, senescência e liberação placentárias em ruminantes. / Apoptosis is a physiological process that plays a crucial role in the development, remodeling and aging of the placenta. The placenta is a temporary organ that undergoes growth and development, followed by senescence and death in 10 months in the buffalo species. Placental growth and fetal nutrition require high rates of cellular turnover and differentiation, and placental maturation is correlated to the reduction of the number of epithelial cells of the maternal crypts. The morphological changes of the apoptotic cells are product of complex variety of biochemical events promoted by a family of cystein-proteases, the caspases, mainly the effectors caspases, and among them the caspase-3, which is able to degrade cytoplasmic and nuclear proteins. During apoptosis, the caspase-mediated cleavage of cytokeratin 18, which is one of the first intermediate filament proteins of the cytoskeleton, leads to the formation of a specific neo-epitope. It is possible to detect the presence of this neo-epitope by immunohistochemistry, as well as the active form of caspase-3, showing that the cell has entered an irreversible stage of cell death. Morphologically, some of the main observed cellular alterations are condensation of the chromatin, degradation and spalling of the DNA, blebbing of the cell membrane and the formation of apoptotic bodies. These bodies can be identified in slides stained by hematoxilin and eosin with a fluorescent microscope, due to the eosinofluorescent property of the apoptotic cells. Like apoptosis, cellular proliferation also contributes to the tissue homeostasis. In the present study, we intend to evaluate the occurrence of apoptosis and cellular proliferation in 42 placentomes, collected from different animals in several gestacional phases (2-10 months of gestation), fixed in 4% paraformaldehyde, processed for embedding in paraplast and cut in sections, through immunohistochemistry (monoclonal antibody M30 CytoDeath; Cleaved Caspase-3; PCNA - antigen of nuclear proliferation). The presence of eosinofluorescent apoptotic bodies were also studied in the samples. M30 and Cleaved Caspase-3 allowed to show the occurrence of apoptosis in the uterine and trophoblastic ephitelium, in placental giant cells and, occasionally, in the fetal mesenquimal cells, in the uterine stroma and endothelium cells. There were no significant differences (p<0.05) between the adopted methods, although there were differences between the gestational phases studied. For M30, there was an increase of the number of apoptotic cells (p<0.05) from the first group (2-4.5 months) in relation to the fourth group of animals (9-10 months); for the Cleaved Caspase-3 there was a statistical significant increase (p<0.05) between the first three groups of animals (2-4.5; 5-6.5; and 7-8.5 months of gestation, respectively) and the last one. In relation to the PCNA, a decrease in the number of proliferative cells occurred from the first two groups of animals to the fourth group (p<0.05). The occurrence of eosinofluorescent apoptotic bodies was observed in all the samples studied . Our data suggest a relationship between apoptosis and the maturation, senescence and release of the ruminant placenta.

Apoptose é uma forma de morte celular extremamente conservada que tem papel primordial no desenvolvimento animal e na homeostasia celular, agindo como mecanismo de controle de qualidade com a função de remover células danificadas, em excesso ou não-funcionais. Este processo tem papel importante no desenvolvimento embrionário pré-implantacional, pois as células embrionárias estão sujeitas aos danos no DNA que podem ativar mecanismos de reparo de DNA ou induzir apoptose, que culmina com a ativação da enzima caspase-3 responsável pela clivagem de vários substratos celulares. Deste modo, o presente trabalho teve como objetivos determinar a presença da Caspase-3 ativa (+casp-3) e sua influência no desenvolvimento de embriões suínos no estágio de pré-implantação, bem como investigar a detecção de proteínas que atuam no mecanismo de lesão e reparo do DNA. Foram realizados 4 experimentos com oócitos imaturos de fêmeas pré-púberes, obtidos de ovários oriundos de abatedouro, maturados in vitro (MIV) por 44-46 horas. Oócitos em metáfase II (MII) foram ativados partenogeneticamente (AP) com ionomicina e cloreto de estrôncio e cultivados in vitro em PZM3 a 38ºC e 5% CO2 em ar e alta umidade. No primeiro experimento os embriões foram classificados em 4 grupos de acordo com o tempo de clivagem e o número de células: R4 - clivado às 24 horas e com &ge;4 células às 48 horas; R2 - clivado às 24 horas e com 2 ou 3 células às 48 horas; L4 - não clivado às 24 horas e com &ge;4 células às 48 horas; L2 - não clivado às 24 horas e com 2 ou 3 células às 48 horas. Os embriões foram então avaliados no D-6 do CIV para determinação do índice de desenvolvimento até o estágio de blastocisto. Os embriões do grupo R apresentaram maiores índices de blastocisto, R4 - 66,1 (174/263) e R2 - 59,6 (62/104) e maior número de núcleos por blastocisto, R4 - 40,1 e R2 - 37,8, quando comparados ao grupo L, L4 - 15,4 (6/39) e L2-16,8 (13/77); L4-18,5 e L2-18,3 (Qui-quadrado e Tukey-Kramer, respectivamente, P<0,05); entretanto, não houve diferença entre os grupos R4 e R2 e L4 e L2. Para o segundo experimento utilizou-se apenas embriões R e L, classificados às 24hs do início do CIV. Ambos os grupos (R e L) foram destinados à análise de imunocitoquímica para +casp-3 fixados nos D2, D4 e D6, sendo cada um destes dias considerado um sub-experimento e realizado em manipulações diferentes. Foi observada localização citoplasmática da +casp-3 do D2 ao D6 e nuclear a partir do D5 de cultivo. A quantificação relativa da +casp-3 nos grupos R e L de cultivo foi de 2,4 vs 1,4; 1,1 vs 1,0 e 1,1 vs 1,2 para o D2, D4 e D6, respectivamente. Para avaliar a influência da +casp-3 no desenvolvimento de embriões suínos foi realizado o terceiro experimento utilizando o inibidor de caspase z-DEVD-fmk (100uM) durante a MIV, no início (D0 ao D2) ou no final (D4 ao D6) do cultivo. Embriões produzidos sem inibidor foram usados como controle. A presença do inibidor durante a MIV e no final do cultivo não afetou os índices de blastocistos. No entanto, a presença do inibidor durante as primeiras 48 horas de cultivo resultou em maior índice de blastocisto do que o grupo controle, 55,1 (59/107) e 37,5 (39/104) (Qui-quadrado, P<0,05). O último experimento foi realizado para investigar a presença das proteínas de reparo de lesão de DNA, &gamma;H2AX, 53BP1, NSB1 e RAD52, em embriões desenvolvimento R e L. Não foi detectada 53BP1 em embriões suínos AP durante o desenvolvimento inicial. Embriões do grupo L apresentaram maior quantidade de &gamma;H2AX no D-5 quando comparado ao grupo R; entretanto, não houve diferença de marcação para NSB1 e RAD52. Estes dados indicam que o mecanismo de apoptose interfere no desenvolvimento embrionário inicial com efeito positivo do inibidor de caspase, na taxa de blastocisto de embriões suínos AP. Embriões de desenvolvimento L apresentaram um aumento da sinalização às injúrias do DNA, entretanto, a diferenças quanto ao potencial de reparo do DNA lesado em embriões de diferentes potenciais de desenvolvimentos, ainda precisam ser melhor investigadas. / Apoptosis is a highly conserved form of cell death that plays a major role in animal development and cellular homeostasis by acting as a quality control mechanism to remove cells that are damaged, nonfunctional, misplaced or supranumerary. This form of cell death plays a major role on preimplantation embryonic development since embryonic cells are often subject to DNA damage, triggering either DNA damage and repair mechanisms or apoptosis. Once initiated the apoptotic process leads to caspase activation and cleavage of cellular substrates. The aim of the present study was to quantify active Caspase-3 (+casp-3) and to determine the role of this pro-apoptotic enzyme on the development of preimplantation porcine embryos, as well as to investigate the presence and localization of DNA damage and repair proteins. Four experiments were conducted using slaughterhouse immature oocytes collected from pre-pubertal gilt ovaries and in vitro matured (IVM) for 44-46 h. Metaphase II (MII) oocytes were parthenogenetically activated (PA) using ionomycin and strontium chloride and cultured in PZM-3 at 38&ordm;C, 5% CO2 in air and high humidity. In the first study embryos were distributed into 4 groups according to cleavage time and cell number: R4 - cleaved at 24 h with &ge;4-cells at 48 h; R2 - cleaved at 24 h with 2-3 cells at 48 h; L4 - non-cleaved at 24 h with &ge;4-cells at 48 h; L2 - non-cleaved at 24 h with 2-3 cells at 48 h. Group R embryos showed higher blastocyst rates R4-66.1 (174/263) and R2-59.6 (62/104) and more nuclei per blastocyst, R4-40.1 and R2-38.9, when compared to group L L4-15.4 (6/39) and L2-16.8 (13/77); L4-18.5 and L2-18.3 (Chi-square and Tukey-Kramer, P<0.05); however, there were no differences between R4 and R2 or L4 and L2. The second experiment used only early-(R) and late-cleaved embryos (L), classified at 24 h of IVC, fixed at D-2, D-4 and D-6 and then stained for +casp-3 immunofluorescence. In this embryos fixed at D-2, D-4 and D-6 were considered as sub-experiments conducted in different replicates. Active Caspase-3 cytoplasmic signal was detected in cultured embryos from D2 to D6 and nuclear signal was detected from D5 to D6. The relative amount of immunofluorescence signal for +casp-3 for groups R and L at D2, D4 and D6 of culture was 2.4 vs. 1.4; 1.1 vs. 1.0 and 1.1 vs. 1.2, respectively. A third experiment was conducted to evaluate the role of +casp-3 on porcine preimplantation embryos. In this study the Caspase inhibitor Z-DEVD-fmk (100 uM) was supplemented during maturation of porcine oocytes or embryo culture (D0 to D2 or D4 to D6). Addition of the caspase inhibitor during IVM or D4 to D6 of culture did not affect blastocyst rate. However, caspase inhibition from D0 to D2 increased development of porcine embryos to the blastocyst stage [55.1 (59/107) and 37.5 (39/104) for control and Z-DEVD-fmk, respectively; Chi-square, P<0.05). The last experiment investigated the presence of DNA damage and repair proteins &gamma;H2AX, 52BP1, NSB1, and Rad52 in early- and late-cleaved embryos by immunofluorescence. There was no 53BP1 signal in PA porcine embryos at beginning of IVC. Late-cleaved embryos showed higher &gamma;H2AX signal than early-cleaved embryos; however, there was no difference between NSB1 and Rad52 staining between these embryos. In conclusion, apoptosis and DNA damage and repair mechanisms play a role on development of porcine embryos. Active caspase-3 is present in porcine embryos throughout the preimplantation period and inhibition of this enzyme at early stages of in vitro culture can increase blastocyst rate of PA embryos. Moreover, late-cleaved embryos carry higher DNA damage than early-cleaved embryos. Therefore, the relationship between DNA repair mechanism and developmental potential of porcine embryos need to be further investigated.

Apoptose é uma forma de morte celular extremamente conservada que tem papel primordial no desenvolvimento animal e na homeostasia celular, agindo como mecanismo de controle de qualidade com a função de remover células danificadas, em excesso ou não-funcionais. Este processo tem papel importante no desenvolvimento embrionário pré-implantacional, pois as células embrionárias estão sujeitas aos danos no DNA que podem ativar mecanismos de reparo de DNA ou induzir apoptose, que culmina com a ativação da enzima caspase-3 responsável pela clivagem de vários substratos celulares. Deste modo, o presente trabalho teve como objetivos determinar a presença da Caspase-3 ativa (+casp-3) e sua influência no desenvolvimento de embriões suínos no estágio de pré-implantação, bem como investigar a detecção de proteínas que atuam no mecanismo de lesão e reparo do DNA. Foram realizados 4 experimentos com oócitos imaturos de fêmeas pré-púberes, obtidos de ovários oriundos de abatedouro, maturados in vitro (MIV) por 44-46 horas. Oócitos em metáfase II (MII) foram ativados partenogeneticamente (AP) com ionomicina e cloreto de estrôncio e cultivados in vitro em PZM3 a 38ºC e 5% CO2 em ar e alta umidade. No primeiro experimento os embriões foram classificados em 4 grupos de acordo com o tempo de clivagem e o número de células: R4 - clivado às 24 horas e com &ge;4 células às 48 horas; R2 - clivado às 24 horas e com 2 ou 3 células às 48 horas; L4 - não clivado às 24 horas e com &ge;4 células às 48 horas; L2 - não clivado às 24 horas e com 2 ou 3 células às 48 horas. Os embriões foram então avaliados no D-6 do CIV para determinação do índice de desenvolvimento até o estágio de blastocisto. Os embriões do grupo R apresentaram maiores índices de blastocisto, R4 - 66,1 (174/263) e R2 - 59,6 (62/104) e maior número de núcleos por blastocisto, R4 - 40,1 e R2 - 37,8, quando comparados ao grupo L, L4 - 15,4 (6/39) e L2-16,8 (13/77); L4-18,5 e L2-18,3 (Qui-quadrado e Tukey-Kramer, respectivamente, P<0,05); entretanto, não houve diferença entre os grupos R4 e R2 e L4 e L2. Para o segundo experimento utilizou-se apenas embriões R e L, classificados às 24hs do início do CIV. Ambos os grupos (R e L) foram destinados à análise de imunocitoquímica para +casp-3 fixados nos D2, D4 e D6, sendo cada um destes dias considerado um sub-experimento e realizado em manipulações diferentes. Foi observada localização citoplasmática da +casp-3 do D2 ao D6 e nuclear a partir do D5 de cultivo. A quantificação relativa da +casp-3 nos grupos R e L de cultivo foi de 2,4 vs 1,4; 1,1 vs 1,0 e 1,1 vs 1,2 para o D2, D4 e D6, respectivamente. Para avaliar a influência da +casp-3 no desenvolvimento de embriões suínos foi realizado o terceiro experimento utilizando o inibidor de caspase z-DEVD-fmk (100uM) durante a MIV, no início (D0 ao D2) ou no final (D4 ao D6) do cultivo. Embriões produzidos sem inibidor foram usados como controle. A presença do inibidor durante a MIV e no final do cultivo não afetou os índices de blastocistos. No entanto, a presença do inibidor durante as primeiras 48 horas de cultivo resultou em maior índice de blastocisto do que o grupo controle, 55,1 (59/107) e 37,5 (39/104) (Qui-quadrado, P<0,05). O último experimento foi realizado para investigar a presença das proteínas de reparo de lesão de DNA, &gamma;H2AX, 53BP1, NSB1 e RAD52, em embriões desenvolvimento R e L. Não foi detectada 53BP1 em embriões suínos AP durante o desenvolvimento inicial. Embriões do grupo L apresentaram maior quantidade de &gamma;H2AX no D-5 quando comparado ao grupo R; entretanto, não houve diferença de marcação para NSB1 e RAD52. Estes dados indicam que o mecanismo de apoptose interfere no desenvolvimento embrionário inicial com efeito positivo do inibidor de caspase, na taxa de blastocisto de embriões suínos AP. Embriões de desenvolvimento L apresentaram um aumento da sinalização às injúrias do DNA, entretanto, a diferenças quanto ao potencial de reparo do DNA lesado em embriões de diferentes potenciais de desenvolvimentos, ainda precisam ser melhor investigadas. / Apoptosis is a highly conserved form of cell death that plays a major role in animal development and cellular homeostasis by acting as a quality control mechanism to remove cells that are damaged, nonfunctional, misplaced or supranumerary. This form of cell death plays a major role on preimplantation embryonic development since embryonic cells are often subject to DNA damage, triggering either DNA damage and repair mechanisms or apoptosis. Once initiated the apoptotic process leads to caspase activation and cleavage of cellular substrates. The aim of the present study was to quantify active Caspase-3 (+casp-3) and to determine the role of this pro-apoptotic enzyme on the development of preimplantation porcine embryos, as well as to investigate the presence and localization of DNA damage and repair proteins. Four experiments were conducted using slaughterhouse immature oocytes collected from pre-pubertal gilt ovaries and in vitro matured (IVM) for 44-46 h. Metaphase II (MII) oocytes were parthenogenetically activated (PA) using ionomycin and strontium chloride and cultured in PZM-3 at 38&ordm;C, 5% CO2 in air and high humidity. In the first study embryos were distributed into 4 groups according to cleavage time and cell number: R4 - cleaved at 24 h with &ge;4-cells at 48 h; R2 - cleaved at 24 h with 2-3 cells at 48 h; L4 - non-cleaved at 24 h with &ge;4-cells at 48 h; L2 - non-cleaved at 24 h with 2-3 cells at 48 h. Group R embryos showed higher blastocyst rates R4-66.1 (174/263) and R2-59.6 (62/104) and more nuclei per blastocyst, R4-40.1 and R2-38.9, when compared to group L L4-15.4 (6/39) and L2-16.8 (13/77); L4-18.5 and L2-18.3 (Chi-square and Tukey-Kramer, P<0.05); however, there were no differences between R4 and R2 or L4 and L2. The second experiment used only early-(R) and late-cleaved embryos (L), classified at 24 h of IVC, fixed at D-2, D-4 and D-6 and then stained for +casp-3 immunofluorescence. In this embryos fixed at D-2, D-4 and D-6 were considered as sub-experiments conducted in different replicates. Active Caspase-3 cytoplasmic signal was detected in cultured embryos from D2 to D6 and nuclear signal was detected from D5 to D6. The relative amount of immunofluorescence signal for +casp-3 for groups R and L at D2, D4 and D6 of culture was 2.4 vs. 1.4; 1.1 vs. 1.0 and 1.1 vs. 1.2, respectively. A third experiment was conducted to evaluate the role of +casp-3 on porcine preimplantation embryos. In this study the Caspase inhibitor Z-DEVD-fmk (100 uM) was supplemented during maturation of porcine oocytes or embryo culture (D0 to D2 or D4 to D6). Addition of the caspase inhibitor during IVM or D4 to D6 of culture did not affect blastocyst rate. However, caspase inhibition from D0 to D2 increased development of porcine embryos to the blastocyst stage [55.1 (59/107) and 37.5 (39/104) for control and Z-DEVD-fmk, respectively; Chi-square, P<0.05). The last experiment investigated the presence of DNA damage and repair proteins &gamma;H2AX, 52BP1, NSB1, and Rad52 in early- and late-cleaved embryos by immunofluorescence. There was no 53BP1 signal in PA porcine embryos at beginning of IVC. Late-cleaved embryos showed higher &gamma;H2AX signal than early-cleaved embryos; however, there was no difference between NSB1 and Rad52 staining between these embryos. In conclusion, apoptosis and DNA damage and repair mechanisms play a role on development of porcine embryos. Active caspase-3 is present in porcine embryos throughout the preimplantation period and inhibition of this enzyme at early stages of in vitro culture can increase blastocyst rate of PA embryos. Moreover, late-cleaved embryos carry higher DNA damage than early-cleaved embryos. Therefore, the relationship between DNA repair mechanism and developmental potential of porcine embryos need to be further investigated.

A apoptose é um processo fisiológico que desempenha papel crucial no desenvolvimento, remodelagem e senescência teciduais, inclusive placentários. A placenta, enquanto órgão temporário, atravessa todas estas fases em aproximadamente 10 meses, na espécie bubalina. O crescimento da placenta e a nutrição fetal requerem altas taxas de renovação e diferenciação celulares, e a maturação placentária está relacionada à redução das células epiteliais das criptas carunculares maternas. As modificações morfológicas celulares decorrentes do processo de apoptose são fruto de eventos bioquímicos complexos promovidos por uma família de cisteína-proteases, as caspases, especialmente as caspases executoras, dentre as quais se destaca a caspase-3, capaz de degradar várias proteínas citoplasmáticas e nucleares. Durante a apoptose, ocorre a clivagem caspase-mediada da citoqueratina 18, proteína dos filamentos intermediários do citoesqueleto, e com isso a formação de um neoepítopo específico. Por meio de métodos imunoistoquímicos pode-se detectar a presença tanto deste neoepítopo, quanto da forma ativa da caspase-3, o que demonstra que a célula entrou em estágio irreversível de morte celular. Morfologicamente, algumas das principais alterações celulares observadas são condensação da cromatina, a degradação e fragmentação do DNA, a formação de ?blebs? (pregas/bolhas) na membrana plasmática, além da fragmentação celular em corpúsculos apoptóticos, os quais podem ser identificados em cortes corados pelo método de rotina hematoxilina e eosina, utilizando-se microscópio de imunofluorescência, devido à eosinofluorescência das células em apoptose. Assim como a apoptose, a proliferação celular participa no equilíbrio homeostático tissular. Neste estudo, pretende-se avaliar a ocorrência de apoptose e proliferação celular em 42 placentônios de diferentes animais em diversas fases gestacionais (2-10 meses de gestação), em tecidos fixados em 4% paraformoldeído, incluídos em paraplast e submetidos à imunoistoquímica (anticorpo monoclonal M30 CytoDeath; Caspase-3 Clivada; PCNA - antígeno de marcação nuclear), sendo também avaliada a presença de corpúsculos apoptóticos eosinofluorescentes nas amostras. Utilizando-se M30 e caspase-3 clivada pudemos constatar a ocorrência de apoptose nos epitélios uterino e trofoblástico, em células gigantes placentárias e, ocasionalmente, em células mesenquimais fetais, do estroma uterino e endoteliais. Não houve diferenças significativas (p<0.05) entre os métodos adotados, mas sim entre os estágios gestacionais. Para o M30, houve um aumento significante da apoptose do primeiro grupo (2-4.5 meses) em relação ao quarto grupo (9-10 meses); no caso da Caspase-3 Clivada houve um aumento estatísticamente significante (p<0.05) entre os três primeiros grupos (2-4.5; 5-6.5; e 7-8.5 meses de gestação, respectivamente) de animais em relação ao quarto grupo. Para o PCNA, ocorreu uma diminuição no número de células em proliferação dos dois primeiros grupos de animais em relação ao quarto grupo (p<0.05). A presença de corpúsculos apoptóticos eosinofluorescentes pôde ser observada em todas as amostras. Nossos resultados sugerem haver uma relação entre a ocorrência de apoptose e a maturação, senescência e liberação placentárias em ruminantes. / Apoptosis is a physiological process that plays a crucial role in the development, remodeling and aging of the placenta. The placenta is a temporary organ that undergoes growth and development, followed by senescence and death in 10 months in the buffalo species. Placental growth and fetal nutrition require high rates of cellular turnover and differentiation, and placental maturation is correlated to the reduction of the number of epithelial cells of the maternal crypts. The morphological changes of the apoptotic cells are product of complex variety of biochemical events promoted by a family of cystein-proteases, the caspases, mainly the effectors caspases, and among them the caspase-3, which is able to degrade cytoplasmic and nuclear proteins. During apoptosis, the caspase-mediated cleavage of cytokeratin 18, which is one of the first intermediate filament proteins of the cytoskeleton, leads to the formation of a specific neo-epitope. It is possible to detect the presence of this neo-epitope by immunohistochemistry, as well as the active form of caspase-3, showing that the cell has entered an irreversible stage of cell death. Morphologically, some of the main observed cellular alterations are condensation of the chromatin, degradation and spalling of the DNA, blebbing of the cell membrane and the formation of apoptotic bodies. These bodies can be identified in slides stained by hematoxilin and eosin with a fluorescent microscope, due to the eosinofluorescent property of the apoptotic cells. Like apoptosis, cellular proliferation also contributes to the tissue homeostasis. In the present study, we intend to evaluate the occurrence of apoptosis and cellular proliferation in 42 placentomes, collected from different animals in several gestacional phases (2-10 months of gestation), fixed in 4% paraformaldehyde, processed for embedding in paraplast and cut in sections, through immunohistochemistry (monoclonal antibody M30 CytoDeath; Cleaved Caspase-3; PCNA - antigen of nuclear proliferation). The presence of eosinofluorescent apoptotic bodies were also studied in the samples. M30 and Cleaved Caspase-3 allowed to show the occurrence of apoptosis in the uterine and trophoblastic ephitelium, in placental giant cells and, occasionally, in the fetal mesenquimal cells, in the uterine stroma and endothelium cells. There were no significant differences (p<0.05) between the adopted methods, although there were differences between the gestational phases studied. For M30, there was an increase of the number of apoptotic cells (p<0.05) from the first group (2-4.5 months) in relation to the fourth group of animals (9-10 months); for the Cleaved Caspase-3 there was a statistical significant increase (p<0.05) between the first three groups of animals (2-4.5; 5-6.5; and 7-8.5 months of gestation, respectively) and the last one. In relation to the PCNA, a decrease in the number of proliferative cells occurred from the first two groups of animals to the fourth group (p<0.05). The occurrence of eosinofluorescent apoptotic bodies was observed in all the samples studied . Our data suggest a relationship between apoptosis and the maturation, senescence and release of the ruminant placenta.

O estresse causa modificações no epitélio intestinal, tais como o aumento de células caliciformes e da taxa de apoptose. O uso de alimentos nutracêuticos tem sido uma alternativa para amenizar essas modificações sobre o tecido epitelial. Desta forma, este trabalho teve como objetivo avaliar se a inclusão de colostro bovino, o qual é constituído de fatores antioxidantes, imunes e de crescimento, seria capaz de amenizar as consequências do estresse crônico sob o intestino. Para isso, juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus) adensados a 50 kg/m3 foram alimentados duas vezes ao dia até a saciedade com ração peletizada e semi-purificada sem (0%CBL) e com a inclusão de colostro bovino liofilizado em concentrações crescentes (10, 20 e 30%CBL), (n=4). Após 28 dias, foram coletados segmentos do intestino médio, S1 e S2, e reto. Os tecidos foram marcados com corantes histológicos para a quantificação de células caliciformes contendo mucinas neutras, ácidas (incluindo sialo e sulfomucinas) e ácidas-neutras. Também foram mensurados o volume (Vv) e a densidade da superfície (Sv) da mucosa, por análise estereológica, e a espessura da camada muscular. A razão do número de cada tipo e subtipo de célula caliciforme sobre o Vv e Sv foi calculada para estimar a densidade de células caliciformes, Dv e Ds, respectivamente. A taxa apoptótica foi analisada qualitativamente através da intensidade (alta, média e baixa) da imunomarcação da caspase-3 nas células epiteliais. As dietas não influenciaram os parâmetros zootécnicos analisados (P>0,05). No reto, os grupos que receberam 20 e 30%CBL apresentaram menor número de células caliciformes contendo sulfomucinas e menor Ds em relação a 0 e 10% (P=0,0148 e 0,0198, respectivamente). No RT, Dv total e Dv de células caliciformes contendo mucinas ácidas foi maior em 0 e 30%CBL em relação a 20%CBL (P=0,0155 e 0,225, respectivamente). No S1, 10 e 30%CBL apresentaram maior Dv em relação a 20%CBL (P=0,0540). A espessura da camada muscular, o Vv e a Sv não diferiram entre os tratamentos (P>0,05). No S2 e RT, a taxa de apoptose teve relação inversa à concentração de colostro bovino liofilizado adicionado na ração. Nos três segmentos, houve maior proporção de células caliciformes contendo mucinas ácidas do que neutras, sendo a maioria representada por sulfomucinas. Assim, a inclusão de colostro bovino liofilizado nas rações de juvenis de pacu adensados diminuiu a apoptose nos segmentos intestinais S2 e RT e também diminuiu o número de células caliciformes contendo sulfomucinas no RT, indicando que o colostro bovino liofilizado pode ser utilizado como alimento nutracêutico para pacus (Piaractus mesopotamicus) adensados, a fim de diminuir a taxa apoptótica e proteger o intestino contra enzimas bacterianas, uma das principais funções das sulfomucinas. / The stress causes changes in the intestinal epithelium, such as the increase in the number of goblet cells and on the rate of apoptosis. The use of nutraceutical foods has been an alternative to soften these modifications on the epithelial tissue. Thus, this study aimed to evaluate if the inclusion of bovine colostrum, which is composed of antioxidant, immune and growth factors, would be able to attenuate the consequences of chronic stress on the intestine. For this, pacu juveniles (Piaractus mesopotamicus), stocked at density of 50 kg/m3, were fed twice daily until satiety with pelleted and semi-purified diet without (0% LBC) and with the inclusion of lyophilized bovine colostrum in increasing concentrations (10, 20 and 30% LBC), (n = 4). After 28 days, segments of the middle gut, S1 and S2, and rectum (RT) were collected. The tissues were stained with histological dyes for the quantification of goblet cells containing neutral, acidic (including sialo and sulphomucins) and acid-neutral mucins. The volume (Vv) and surface density (Sv) of the mucosa were also measured by stereological analysis and the thickness of the muscular layer. The ratio between the number of each goblet cell type and subtype and the Vv or Sv was calculated to estimate the density of goblet cells, Dv and Ds, respectively. The apoptotic rate was analyzed qualitatively according to the intensity (high, medium and low) of caspase-3 immunostaining in epithelial cells. The diets did not influence the zootechnical parameters analyzed (P> 0.05). In the rectum, the groups that received 20 and 30% LBC presented lower number of goblet cells containing sulphomucins and lower Ds in relation to 0 and 10% (P = 0.0148 and 0.0198, respectively). In RT, total Dv and Dv of goblet cells containing acid mucins were higher in 0 and 30% LBC in relation to 20% LBC (P = 0.0155 and 0.225, respectively). In S1, 10 and 30% LBC presented higher Dv in relation to 20% LBC (P = 0.0540). Muscle layer thickness, Vv and Sv did not differ between treatments (P> 0.05). In S2 and RT, the rate of apoptosis was inversely related to the concentration of lyophilized bovine colostrum added in the diet. In the three segments, there was higher proportion of goblet cells containing acidic than neutral mucins, most of them being sulphomucins. Thus, the inclusion of lyophilized bovine colostrum in diets of pacu juveniles reduced apoptosis in the intestinal segments S2 and RT and also decreased the number of goblet-containing sulphomucins in the RT, indicating that lyophilized bovine colostrum can be used as a nutraceutical feed for pacus (Piaractus mesopotamicus) under high stocking density to decrease the apoptotic rate and protect the intestine against bacterial enzymes, one of the main functions of sulphomucins.