Reproduction de : Thèse de doctorat : Sciences de la vie et de la santé : Lille 1 : 2006. / N° d'ordre (Lille 1) : 3867. Articles en anglais reproduits dans le texte et en annexe. Résumé en français et en anglais. Titre provenant de la page de titre du document numérisé. Bibliogr. p. 73-109.

Promastigotas de Leishmania são encontradas no trato digestivo do inseto vetor e podem ser cultivados em alguns meios de cultura, onde ocorre a diferenciação regulada geneticamente entre procíclicos e metacíclicos infectivos. Amastigotas são intracelulares e irão se estabelecer e se multiplicar dentro dos vacúolos parasitóforos dos macrófagos. Os metacíclicos e os amastigotas possuem capacidade de evasão do sistema de defesa do hospedeiro vertebrado e conseguem estabelecer uma relação parasita/hospedeiro bem-sucedida. A apoptose, em organismos multicelulares, é uma forma controlada geneticamente de suicídio celular. A eliminação das células apoptóticas é feita pelos fagócitos sem que seja induzida uma resposta inflamatória. Em Leishmania, os eventos da apoptose parecem seguir os mesmos dos encontrados em metazoários, tais como: queda do potencial da mitocôndria, ativação de caspases, clivagem de substratos naturais de caspases, além da externalização de fosfatidilserina (PS) e seu papel na modulação da fagocitose. Nossos dados demonstraram que Leishmania é capaz de mimetizar e utilizar um dos fenômenos observados na apoptose em metazoários, a exposição de PS, como um mecanismo adaptativo para se estabelecer como um parasita de mamíferos. / Promastigotes of Leishmania are found in the midgut environment of the vector insect and can be grown in some culture medium. In culture the genetically regulated differentiation from procyclic to infective metacyclic can be observed. Amastigotes are intracellular parasites and which multiply inside phagolysosomes of macrophages. Metacyclics and amastigotes are endowed with the capacity to evade from the innate and adaptive immune system of the vertebrate host and to establish successful infections. Apoptosis, in multicellular organisms, is a form genetically controlled cellular suicide. The elimination of apoptotic cells is made by phagocytes without initiating an inflammatory event. In Leishmania, the events of apoptosis are similar to those observed in multicellular organisms such as: decrease in mitochondrial transmembrane potential, caspase activation, cleavage of caspase substrates besides exposure of phosphatidylserine (PS) and its role in the modulation of phagocytosis. Our data showed that Leishmania is capable of mimicking one of the features of apoptosis, mainly PS exposure, and to use as an adaptive mechanism for survival in mammalian hosts.

Apoptosis is a programmed cell death mechanism that is evolutionary conserved from worms to humans. Apoptosis is mediated by initiator and effector caspases. The initiator caspases carry long pro-domains for their interaction with scaffolding proteins to form a cell-death platform, which is essential for their activation. Activated initiator caspases then cleave effector caspases that execute cell death through cleaving downstream targets. In addition to their apoptotic function, caspases also participate in events where caspase activity is not required for cell killing, but for regulating other functions, so-called non-apoptotic functions of caspases. The Drosophila initiator caspase Dronc, the ortholog of mammalian caspase-2 and caspase-9 has a CARD domain that is essential for its interaction with the scaffolding protein Dark to form the apoptosome. Apoptosome formation is crucial for activation of Dronc. Activity of both initiator and effector caspases are further kept in control by the ubiquitin system to avoid inappropriate caspase activity. However, mechanistic details of how the ubiquitin system regulates activation of Dronc are not clear. Therefore, I investigated the ubiquitylation status of Dronc and its function in Drosophila. I found that Dronc is mono-ubiquitylated at Lys78 (K78) in its CARD domain, which blocks its interaction with Dark and formation of the apoptosome. Furthermore, I demonstrated that K78 mono-ubiquitylation plays an inhibitory role in Dronc’s non-apoptotic functions, which may not require its catalytic activity but may be important for the survival of the fly. This thesis study unveils the link between the ubiquitin system and caspases through a regulatory mechanism where a single mono-ubiquitylation event could inhibit both apoptotic and non-apoptotic functions of a caspase.

Les protéines receptor-interacting protein kinase 1 (RIP1) et RIP3 ont été identifiées comme intervenant dans la régulation de la mort cellulaire apoptotique ou nécroptotique mais également dans la survie cellulaire. Ces deux protéines possèdent un domaine sérine/thréonine kinase, un domaine d'interaction spécifique RHIM (RIP homotypic interacting motif) et diffèrent dans leur domaine C-terminal car seule RIP1 possède un domaine de mort. Ces protéines font partie d'un ensemble de protéines régulatrices nommé ripoptosome. Des études ont montré une altération du ripoptosome dans les leucémies lymphoïdes chroniques (LLC) et les leucémies aigües lymphoïdes (LAL). Nous nous sommes intéressés aux leucémies aigües myéloïdes (LAM). L'analyse de l'expression des protéines RIP1 et RIP3 a été réalisée dans des blastes triées CD34+ de patients atteints de LAM ou dans des cellules CD34+ de donneurs sains en Q-RT-PCR. Les premières analyses montrent que RIP3 est significativement sous-exprimée chez les patients atteints de LAM en comparaison avec les cellules CD34+ issues de donneurs sains. Aucune différence n'a été mise en évidence pour l'expression de RIP1 dans les deux types de cellules CD34+. Afin de comprendre l'implication de l'extinction de RIP3 dans les LAM, nous avons étudié sa réexpression dans une lignée cellulaire leucémique murine (DA1-3b) où RIP3 n'est pas exprimée par métylation de son promoteur, au moyen d'un système d'expression conditionnelle (LacSwith II, IPTG). Après 10h d'induction de l'expression, on constate que la protéine RIP3 sauvage (RIP3-WT) induit une apoptose dans les cellules DA1-3b. Afin de déterminer l'implication des domaines de RIP3, nous avons utilisé une protéine mutante kinase Dead (RIP3-KD, activité kinase abolie) et une protéine mutante dans la séquence d'interaction spécifique avec RIP1 (RIP3-RHIM). L'analyse de la mortalité cellulaire en cytométrie en flux et en microscopie électronique montre que les protéines RIP3-WT et -KD induisent toutes les deux la mort apoptotique des cellules DA1-3b respectivement de 15% et de 50% après 10h d'expression. On constate donc que la protéine RIP3-KD induit une mort plus importante et plus précoce que la protéine sauvage. La protéine RIP3 mutée dans son domaine RHIM ne peut plus induire de mort cellulaire. Il semble donc que le domaine kinase de RIP3 jouerait un rôle régulateur dans la mort cellulaire induite par RIP3. L'utilisation du modèle de leucémie murine DA1-3b a permis de réaliser un étude in vivo de l'expression conditionnelle de RIP3-WT et -KD. Seule l'expression de RIP3-KD est capable de prolonger significativement la survie des souris.De plus, il a été démontré que RIP3 pouvait également induire la nécroptose dans les cellules lorsque l'apoptose ne peut aboutir, notament lorsque les caspases sont inhibées à l'aide d'un inhibiteur de pan-caspases le Z-VAD-FMK. Le traitement des cellules exprimant RIP3-WT par 50µM de Z-VAD-FMK induit une plus forte mortalité (45%) des cellules tandis que dans les cellules exprimant RIP3-KD, l'inhibiteur des caspases inhibe complètement le processus apoptotique et permet la survie des cellules (10%). Une étude en microscopie électronique a permis de déterminer que la présence de Z-VAD-FMK induit un switch de l'apoptose vers la nécroptose. Il semble donc que le domaine de kinase possède un rôle important dans la signalisation de la nécroptose car la protéine RIP3-KD n'est plus capable d'initier le switch entre l'apoptose et la nécroptose. Quelques données préliminaires semblent indiquer que les calpaïnes ainsi que la caspase 12 pourraient également être impliquées dans la balance apoptose/nécroptose. [...]

Le récepteur à neurotrophine TrkC a été identifié comme étant un récepteur à dépendance : en l'absence de son ligand NT-3, il déclenche l'apoptose. En effet, la survie des cellules qui expriment ces récepteurs dépend de la disponibilité en ligand, un mécanisme qui inhibe la prolifération incontrôlée et la migration des cellules tumorales. TrkC, en tant que récepteur à tyrosine kinase, est généralement considéré comme un proto-oncogène. Or nous montrons que l'expression TrkC est diminuée dans une grande fraction des cancers colorectaux humains, principalement par méthylation du promoteur de TrkC. En outre, ce mécanisme confère un avantage sélectif aux lignées cellulaires colorectales pour inhiber la mort des cellules tumorales. De plus, la réexpression de TrkC dans les lignées tumorales colorectales est associée à la mort des cellules tumorales et à l'inhibition in vitro des caractéristiques de transformation cellulaire, et in vivo de la croissance tumorale. Ensemble, ces données permettent de conclure que TrkC est un gène suppresseur de tumeur dans le cancer colorectal. Le mécanisme moléculaire par lequel TrkC déclenche l'apoptose implique le clivage de son domaine intracellulaire, ce qui libère un fragment pro-apoptotique (TrkC KF). Nous montrons que TrkC KF interagit avec Cobra1, un cofacteur de BRCA1, et que Cobra1 est nécessaire à l'apoptose induite par TrkC. Cobra1 conduit TrkC KF à la mitochondrie, où il favorise l'apoptose apoptosome-dépendante. Ainsi, nous proposons qu'en l'absence de NT-3, le clivage protéolytique de TrkC conduit à la libération d'un fragment tueur qui déclenche l'apoptose mitochondriale, via le recrutement de Cobra1

Apoptose spielt eine wichtige Rolle bei der Generierung eines funktionellen Lymphozytenrepertoirs. Während der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose werden potentiell autoreaktive Zellen eliminiert. Da die molekularen Mechanismen der B-Zell Apoptose weitgehend unbekannt sind, sollten in dieser Arbeit assoziierte Proteine und Gene identifiziert werden. Durch Subklonierung wurde eine Burkitt Lymphom B Zellinie BL60-2 generiert, die sensitiv auf den anti-IgM Stimulus ist. Für den Vergleich apoptotischer und nicht apoptotischer Zellen wurde eine Methode entwickelt in der apoptotische, Phosphatidylserin (PS) positive Zellen, über eine magnetische Separation mit einer Reinheit von bis zu 95 Prozent von nicht apoptotischen Zellen angereichert werden konnten. Mittels der hochauflösenden 2D-Gelelektrophorese wurden die aufgereinigten Fraktionen apoptotischer und nicht apoptotischer Zellen analysiert und die Proteinmuster verglichen. Anhand massenspektrometrischer Analysen und Edman Abbau konnten bisher folgende differentiell erscheinende Proteinspots identifiziert werden: Lamin B1, b-Aktin, neutrales Calponin, Nucleolin, D4-GDI, hnRNP A1, hnRNP C1/C2, hnRNP K, LSP1, HHR23B, das FUSE-binding Protein, dUTPase, P0, HP1 a. Die Proteine D4-GDI, hnRNPA1 und der Transkriptionsfaktor SP1 werden spezifisch während der anti-IgM induzierten Apoptose gespalten. Der zeitliche Verlauf wurde in einer eindimensionalen Western Blot Analyse bestimmt. Das diese Spaltungen ein Resultat der Aktivierung der Proteasen der Caspase 3 Familie sind, konnte durch Inhibitor Studien mit dem Tetrapeptid z-DEVD-fmk bewiesen werden. Die Spaltung des Transkriptionsfaktors SP1 wurde ebenfalls in in vitro untersucht. Rekombinante Caspase 3 und 7 generieren die gleichen Spaltprodukte, die zuvor in vivo nach anti-IgM induzierter Apoptose detektiert wurden, Caspase 6 hingegen generiert nur ein Fragment. Die spezifische Spaltung des Transkriptionsfaktors beinflußt die DNA Bindungsaktivität, was in einem elektro mobility shift assay gezeigt werden konnte. Die Intensität des SP1/DNA-Komplexes nimmt nach Apoptose-Induktion stark ab, hingegen nimmt die Intensität eines kleineren Komplexes stark zu, was auf die Bindung eines der Spaltprodukte schließen ließ, das möglicherweise transkriptionell inaktiv ist und damit einen wichtigen Apoptose Effektor darstellt. Die Proteasen der Caspase 3 Familie konnten erstmalig als zentrale Regulatoren während der anti-IgM induzierten Apoptose identifiziert werden. Durch die Hemmung mit dem Inhibitor z-DEVD-fmk konnte die Apoptose, sowie charakteristische morphologische Veränderungen, wie die Kernfragmentierung und PS auf die Zelloberfläche gehemmt werden und als Caspase 3 abhängige Veränderungen bestimmt werden. Über verschiedene Methoden der differentiellen Hybridisierung von neu hergestellten l-Zap cDNA-Phagenbanken von nicht stimulierten und anti-IgM stimulierten Burkitt Lymphom Zellen sowie der subtraktiven Klonierung sollten Gene identifiziert werden, die während der anti-IgM induzierten Apoptose differentiell exprimiert werden. Apoptose spezifische Sequenzen wurden angereichert, kloniert und sequenziert. / Apoptosis or programmed cell death is essential in the process controlling lymphocyte growth and selection. During anti-IgM induced B cell apoptosis autoreactive cells are eliminated. Since the molecular mechanisms underlying the process of B cell apoptosis are still not well understood the goal of this study was to identify proteins and genes in apoptosis. Subcloning lead to the selection of a human Burkitt lymphoma B cell line clone (BL60-2) which is highly sensitive towards the anti-IgM stimulus. In order to compare apoptotic and non apoptotic cells a novel method was established, which allows separation of apoptotic, Phosphatidylserine (PS) positive cells from non apoptotic, PS negative cells by magnetic cell sorting. This method generates fractions of apoptotic and non apoptotic cells with a purity of up to 95 %. Cell lysates from those fractions were analyzed using high-resolution two-dimensional gel electrophoresis and the protein patterns were compared. Using mass spectrometry and Edman sequencing the following differentially appearing proteins were identified: Lamin B1, b-Actin, neutral Calponin, Nucleolin, D4-GDI, hnRNP A1, hnRNP C1/C2, hnRNP K, LSP1, HHR23B, FUSE-binding protein, dUTPase, P0, HP1 a. The specific cleavage of the D4-GDI, hnRNPA1 and the transcription factor SP1 which occurs after anti-IgM induced apoptosis was detected by western blot analysis. It was determined by inhibition studies with the tetrapeptide inhibitor z-DEVD-fmk that the cleavage is a result of the Caspase 3 family. Cleavage of the transcription factor SP1 was also investigated by in vitro cleavage assays. The activity of recombinant caspase 3 and 7 generate the same cleavage products as observed in vivo after anti-IgM induction. The specific cleavage of the transcription factor influences it´s DNA binding activity as observed by the decrease of the full lenght protein-DNA complex. The increase of a smaller protein-DNA complex was apparent, which may represent the binding of at least one cleavage product. In this work proteases of the Caspase 3 family could be identified as central regulators during anti-IgM induced apoptosis. Anti-IgM induced apoptosis can be completly inhibited by inhibition of Caspase 3 proteases. Characteristic morphological changes, nuclear fragmentation and PS translocation to the outer membrane leaflet of the cells could be determined as a consequence of the Caspase 3 activation during the process of apoptosis. By differential hybridisation of newly generated l-Zap c-DNA librarys from unstimulated and anti-IgM stimulated B cells as well as with subtractive cDNA librays, it should be feasable to identify newly transcribed genes. Apoptosis specific sequences were enriched, cloned and sequenced.

Even though anti‐cancer chemotherapy has been continuously improved during the last decades. problems with adverse effects and drug resistance still constitutes a considerable obstacle and sets a demand for new effective treatment options. Tissue homeostasis in multi‐cellular organisms is maintained through intrinsic cell death, apoptosis, which removes unwanted or damaged cells. Disrupted apoptosis is an important factor in tumorgenesis and drug resistance, therefore induction or restoration of apoptotic pathways is also important for the treatment of cancer. Several naturally occurring bacterial toxins have the ability to induce apoptosis and could thus be candidates to complement or improve the therapeutic effect of other anticancer drugs. The bacterial toxins, adenylate cyclase (AC) toxin from Bordetella pertussis, α‐toxin from Staphylococcus aureus and verotoxin‐1 (VT‐1) from Escherichia coli were investigated for their ability to induce apoptosis in different tumor cell lines. Toxin induction of cell death was investigated by cell viability assays, end‐stage apoptosis induction by DNA‐fregmentation (TUNEL) assay. Toxin receptor expression and signal transduction pathways to apoptosis were investigated by flow cytometry, caspase enzyme activity assays and western blot. Immunohistochemistry was used for identification of toxin receptor expression in tumor tissue samples. AC‐toxin was cytotoxic and induced apoptosis in cultured malignant plural mesothelioma (MPM) and small‐cell lung cancer (SCLC) cells. Low‐toxic concentrations of AC‐toxin enhanced cisplatin cytotoxicity and apoptosis in both cell lines. MPM‐cells with acquired cisplatin resistance were more sensitive to α‐toxin than the less resistant parental MPM cell line. A low‐toxic concentration of α‐toxin re‐sensitized resistant MPM cells to cisplatin cytotoxicity by apoptosis induced through the mitochondrial pathway without detectable activation of common up‐stream apoptosis signalling proteins. VT‐1 was highly cytotoxic and induced apoptosis in globotriosylceramide (Gb3) ‐expressing glioma, breast cancer and non‐small‐cell lung cancer (NSCLC) cells but was not cytotoxic to non‐Gb3‐expressing cells. PPMP, an inhibitor of glucosylceramide synthesis which makes exposed cells unable to synthesize Gb3 rendered Gb3‐expressing cells resistant to VT‐1. MPM cells with acquired‐cisplatin resistance expressed Gb3 in contrast to the absent of expression in the less resistant parental cell line. Gb3, could however be up‐regulated by cisplatin in Gb3‐negative MPM‐cells. Presence of a low‐toxic concentration of VT‐1 potentiated cisplatin‐induced cytotoxicity and apoptosis in the cisplatin‐resistance MPM cell line. VT‐1 was a potent inducer of apoptosis, probably via stress‐induced Mitogen‐activated protein kinase (MAPK)‐signaling involving c‐Jun N‐terminal kinase (JNK) and p38, leading to disruption of the mitochondrial membrane integrety, activation of caspase‐9 and ‐3, and ultimately DNA fragmentation and cell death. Gb3 expression was demonstrated in clinical specimens of glioblastoma and breast cancer making these tumor types interesting for further VT‐1 studies. We conclude that bacterial toxins may be used to induce apoptosis in several types of cancer cells. Low concentrations of verotoxin‐1 and α‐toxin may potentially be used to overcome acquired cisplatin‐resistance in cancer patients.

Diss. (sammanfattning) Linköping : Linköpings universitet, 2008. / Härtill 4 uppsatser.

Thesis (Ph.D. in Pharmacology) -- University of Colorado Denver, 2008. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 112-125). Free to UCD Anschutz Medical Campus. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

Thesis (Ph.D.)--University of Florida, 2004. / Typescript. Title from title page of source document. Document formatted into pages; contains 87 pages. Includes Vita. Includes bibliographical references.