Os estudos sobre a conversão in vitro de meristemas apicais radiculares em gemas caulinares de plantas do gênero Catasetum vêm contribuindo para uma melhor compreensão dos processos de competência, indução e determinação celular no processo de desenvolvimento, necessitando, no momento, de aprofundamento em estudos moleculares. Para tanto, a utilização de plantas transgênicas representa uma ferramenta de trabalho importante. Além disso, os métodos de transformação genética acenam como uma alternativa eficaz para o melhoramento de plantas de interesse econômico com ciclos reprodutivos longos, como as orquídeas. Desta forma, o objetivo deste projeto foi estabelecer um protocolo para transformação genética de Catasetum pileatum, utilizando tecidos meristemáticos como explantes alvos. Para tanto, avaliou-se o potencial de alguns promotores na expressão de uidA em tecidos de C. pileatum, dentre os quais destacaram-se o 35S de CaMV, o promotor do gene Pthi1 e o de PTE027, sendo que os dois primeiros foram utilizados para os experimentos de transformação genética permanente. Como explantes alvos para a transformação, foram testadas tanto gemas laterais de caules estiolados (CEs) quanto ápices radiculares (ARs), além de segmentos radiculares subapicais (SRs). Para obtenção de estruturas com maior quantidade de células em divisão celular, foi estabelecido um protocolo de cultura de tecidos a partir de segmentos radiculares subapicais (SRs). Na região proximal destes segmentos, estabeleceu-se uma estrutura globular e intumescida na presença de 0,5mg.L-1 de BA. Cortes histológicos destas intumescências revelaram a presença de grande quantidade de células em intensa divisão celular, levando, em estágios mais avançados, à formação de gemas caulinares superficiais. Estas originavam plantas após um mês em meio propício para este fim. Estes explantes foram submetidos a várias concentrações de higromicina, sendo que as concentrações escolhidas para seleção de tecidos transformados foram de 25mg.L-1 para CEs e ARs e 10mg.L-1 para SRs. CEs e ARs foram bombardeados com micropartículas de tungstênio contendo DNA plasmidial adsorvido (P35S:uidA ou Pthi1:uidA) e transferidos para meio seletivo após uma, duas ou três semanas. No entanto, estes não foram capazes de sobreviver em meio seletivo após dois meses de seleção. SRs foram bombardeados com P35S:uidA ou Pthi1:uidA. Estes foram capazes de expressar uidA entre 48h até quatro semanas, sendo que após três meses de seleção, foi observada uma gema azul transformada com Pthi1. As melhores condições para a transformação foram as seguintes: bombardeamento dos SRs recém-isolados, manutenção por duas semanas em meio não seletivo e, por fim, transferência para meio com higromicina até o término de três meses. Não obstante a necessidade de refinamentos dos procedimentos utilizados e de análises moleculares adicionais, estes resultados constituem os primeiros a indicarem a possibilidade de obtenção de plantas transgênicas de Catasetum pileatum. / Research on in vitro conversion of root apical meristems into buds in Catasetum has contributed to a better understanding of competence, induction and cellular determination processes during plant development. Nowadays It demands advances in molecular studies. To achieve this, the use of transgenic plants is an important working tool. Furthermore, genetic transformation methods seem to be an efficient alternative for improvement of commercial plants with longlife cycles, such as orchids. Therefore, the aim of these studies was to establish a protocol for genetic transformation of Catasetum pileatum, using meristematic tissues as target explants. The potential of some gene promoters to induce the expression of uidA was evaluated in C. pileatum tissues. CaMV 35S, Pthi and the PTE027 showed the best results among all tested. The CaMV 35S and the Pthi1 were used in the permanent genetic transformation experiments. Lateral buds of shoot explants (CEs), root apices (ARs) and root segments (SRs) were tested as target explants for transformation. In order to obtain material containing higher quantity of proliferating cells, a tissue culture protocol was established using root segments (SRs). The formation of a globular structure on the proximal region of the explants was observed in the presence of 0.5mg.L-1 of BA. Histological sections of these structures showed the presence of a huge quantity of cells in intense cellular division. In advanced stages, it was observed superficial bud formation on the structures. These buds have the capacity to produce whole plants within one month, in appropriated culture medium. Explants were exposed to a range of hygromycin concentrations and thereupon concentrations of 25mg.L-1 and 10mg.L-1 were chosen for selecting CEs and ARs, and for selection of SRs, respectively. CEs and ARs were bombarded with tungsten microparticules containing adsorbed plasmidial DNA (P35S:uidA or Pthi1:uidA) and it was transferred to selective medium after one, two or three weeks. Nevertheless, these explants were not capable to survive in selective medium after two months. SRs were also bombarded with P35S:uidA or Pthi1:uidA. These explants expressed uidA between 48 hours and four weeks. After three months of selection, it was possible to see a blue stained bud transformed with Pthi1. The best conditions for genetic transformation of C. pileatum were followed: bombardment of newly isolated SRs, maintenance for two weeks in non-selective medium followed of transference to hygromicin medium up to three months. Although additional experiments will still be necessary to refine transformation methods and conduct molecular analysis, the results from the present study are the first reference about genetic transformation of Catasetum pileatum plants.

Os estudos sobre a conversão in vitro de meristemas apicais radiculares em gemas caulinares de plantas do gênero Catasetum vêm contribuindo para uma melhor compreensão dos processos de competência, indução e determinação celular no processo de desenvolvimento, necessitando, no momento, de aprofundamento em estudos moleculares. Para tanto, a utilização de plantas transgênicas representa uma ferramenta de trabalho importante. Além disso, os métodos de transformação genética acenam como uma alternativa eficaz para o melhoramento de plantas de interesse econômico com ciclos reprodutivos longos, como as orquídeas. Desta forma, o objetivo deste projeto foi estabelecer um protocolo para transformação genética de Catasetum pileatum, utilizando tecidos meristemáticos como explantes alvos. Para tanto, avaliou-se o potencial de alguns promotores na expressão de uidA em tecidos de C. pileatum, dentre os quais destacaram-se o 35S de CaMV, o promotor do gene Pthi1 e o de PTE027, sendo que os dois primeiros foram utilizados para os experimentos de transformação genética permanente. Como explantes alvos para a transformação, foram testadas tanto gemas laterais de caules estiolados (CEs) quanto ápices radiculares (ARs), além de segmentos radiculares subapicais (SRs). Para obtenção de estruturas com maior quantidade de células em divisão celular, foi estabelecido um protocolo de cultura de tecidos a partir de segmentos radiculares subapicais (SRs). Na região proximal destes segmentos, estabeleceu-se uma estrutura globular e intumescida na presença de 0,5mg.L-1 de BA. Cortes histológicos destas intumescências revelaram a presença de grande quantidade de células em intensa divisão celular, levando, em estágios mais avançados, à formação de gemas caulinares superficiais. Estas originavam plantas após um mês em meio propício para este fim. Estes explantes foram submetidos a várias concentrações de higromicina, sendo que as concentrações escolhidas para seleção de tecidos transformados foram de 25mg.L-1 para CEs e ARs e 10mg.L-1 para SRs. CEs e ARs foram bombardeados com micropartículas de tungstênio contendo DNA plasmidial adsorvido (P35S:uidA ou Pthi1:uidA) e transferidos para meio seletivo após uma, duas ou três semanas. No entanto, estes não foram capazes de sobreviver em meio seletivo após dois meses de seleção. SRs foram bombardeados com P35S:uidA ou Pthi1:uidA. Estes foram capazes de expressar uidA entre 48h até quatro semanas, sendo que após três meses de seleção, foi observada uma gema azul transformada com Pthi1. As melhores condições para a transformação foram as seguintes: bombardeamento dos SRs recém-isolados, manutenção por duas semanas em meio não seletivo e, por fim, transferência para meio com higromicina até o término de três meses. Não obstante a necessidade de refinamentos dos procedimentos utilizados e de análises moleculares adicionais, estes resultados constituem os primeiros a indicarem a possibilidade de obtenção de plantas transgênicas de Catasetum pileatum. / Research on in vitro conversion of root apical meristems into buds in Catasetum has contributed to a better understanding of competence, induction and cellular determination processes during plant development. Nowadays It demands advances in molecular studies. To achieve this, the use of transgenic plants is an important working tool. Furthermore, genetic transformation methods seem to be an efficient alternative for improvement of commercial plants with longlife cycles, such as orchids. Therefore, the aim of these studies was to establish a protocol for genetic transformation of Catasetum pileatum, using meristematic tissues as target explants. The potential of some gene promoters to induce the expression of uidA was evaluated in C. pileatum tissues. CaMV 35S, Pthi and the PTE027 showed the best results among all tested. The CaMV 35S and the Pthi1 were used in the permanent genetic transformation experiments. Lateral buds of shoot explants (CEs), root apices (ARs) and root segments (SRs) were tested as target explants for transformation. In order to obtain material containing higher quantity of proliferating cells, a tissue culture protocol was established using root segments (SRs). The formation of a globular structure on the proximal region of the explants was observed in the presence of 0.5mg.L-1 of BA. Histological sections of these structures showed the presence of a huge quantity of cells in intense cellular division. In advanced stages, it was observed superficial bud formation on the structures. These buds have the capacity to produce whole plants within one month, in appropriated culture medium. Explants were exposed to a range of hygromycin concentrations and thereupon concentrations of 25mg.L-1 and 10mg.L-1 were chosen for selecting CEs and ARs, and for selection of SRs, respectively. CEs and ARs were bombarded with tungsten microparticules containing adsorbed plasmidial DNA (P35S:uidA or Pthi1:uidA) and it was transferred to selective medium after one, two or three weeks. Nevertheless, these explants were not capable to survive in selective medium after two months. SRs were also bombarded with P35S:uidA or Pthi1:uidA. These explants expressed uidA between 48 hours and four weeks. After three months of selection, it was possible to see a blue stained bud transformed with Pthi1. The best conditions for genetic transformation of C. pileatum were followed: bombardment of newly isolated SRs, maintenance for two weeks in non-selective medium followed of transference to hygromicin medium up to three months. Although additional experiments will still be necessary to refine transformation methods and conduct molecular analysis, the results from the present study are the first reference about genetic transformation of Catasetum pileatum plants.

A família Orchidaceae é a maior família entre as monocotiledôneas e representa uma das maiores famílias de plantas floríferas com um número estimado de cerca de 30 mil espécies. A complexidade taxonômica de um dos gêneros dentro dessa família, o Catasetum, tem despertado muito interesse por parte dos cultivadores e pesquisadores em Orchidaceae, especialmente devido aos novos táxons que estão sendo descobertos no gênero. Visando aprimorar a classificação de espécies do gênero, uma ferramenta a ser utilizada é a análise dos constituintes químicos do metabolismo dessas plantas, onde fica evidenciada a necessidade de estudos utilizando métodos analíticos mais sensíveis, rápidas e seletivas, como a análise metabolômica. A obtenção da impressão digital metabólica é a obtenção detalhada dos metabólitos do organismo sob determinada condição, produzindo um cromatograma que é característico daquela planta, como uma impressão digital. Através disso, é possível determinar diferenças metabólicas em amostras, por meio de ferramentas estatísticas. Para o refinamento dos dados, é necessário o uso de softwares específicos que extraem as informações úteis para as análises. Foram analisadas 42 espécies distintas do gênero Catasetum e algumas duplicatas, totalizando 51 amostras por GC-MS e UHPLC-MS(ESI-Orbitrap). As \"impressões digitais\" metabólicas foram processadas nos softwares MetAlignTM e MSClust, e as matrizes geradas foram analisadas por análise de componentes principais (PCA), análise de cluster hierárquico (HCA) e análise discriminante ortogonal por mínimos quadrados parciais (OPLS-DA). Os métodos utilizados para as análises tanto por GC-MS quanto por UHPLC-MS resultaram em dados satisfatórios para análise metabolômica, gerando 57 substâncias voláteis identificadas a partir da fragrância das flores, sendo acetato de nerila, sabineno, ?-mirceno, ?-pineno e ?-pineno as mais frequentes. Os resultados das análises metabolômicas apresentaram proximidade com a filogenia, principalmente em níveis mais específicos. Os grupos gerados pelas análises, de modo geral, foram coerentes quanto à semelhança metabólica entre as espécies que os compõem, sugerindo a possibilidade do uso de impressões digitais metabólicas como uma boa ferramenta para análise quimiotaxonômica / The Orchidaceae family is the largest family among monocotyledons and represents one of the largest families of flowering plants with an estimated 30,000 species. The taxonomic complexity of one of the genera within this family, the Catasetum, has aroused much interest from growers and researchers in Orchidaceae, especially due to the new taxa being discovered in the genus. Aiming to improve the classification of species of the genus, a tool to be used is the analysis of the chemical constituents of the metabolism of these plants, where it is evidenced the need for studies using analytical methodologies more sensitive, fast and effective, such as the metabolomics analysis. Obtaining the metabolic fingerprint is the detailed obtaining of the metabolites of the organism under certain condition, producing a chromatogram that is characteristic of that plant, like a fingerprint. Through this, it is possible to determine metabolic differences in samples, through statistical tools. For the refinement of the data, it is necessary to use specific softwares that extract the useful information from analyzes data. The information generated can be used with different applications. A total of 51 samples were analyzed by GC-MS and UHPLC-MS (ESI-Orbitrap), 42 different species of the genus Catasetum and some duplicates. Metabolic \"fingerprints\" were processed in the MetAlignTM and MSClust softwares, and the generated matrices were analyzed by Principal Component Analysis (PCA), hierarchical cluster analysis (HCA) and partial least squares orthogonal discriminant analysis (OPLS-DA). The methods used for analysis by both GC-MS and UHPLC-MS resulted in satisfactory data for metabolomics analysis, generating 57 volatile substances identified from the flower fragrance, being neryl acetate, sabinene, ?-myrcene, ?-pinene and ?-pinene the most frequent. The results of the metabolic analyzes showed proximity to the phylogeny, mainly in more specific levels. The groups generated by the analyzes, in general, were coherent regarding the metabolic similarity between the species that compose them, suggesting the possibility of the use of metabolic fingerprints as a good tool for chemotaxonomic analysis

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:32:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissAWCF.pdf: 14864501 bytes, checksum: 05aaa7e085fc2caf8ba616ae9cc02de5 (MD5) Previous issue date: 2005-03-08 / Financiadora de Estudos e Projetos / Catasetum fimbriatum is an epiphyte plant with a strong sexual dimorphism, witch can have inflorescences with male flowers, female flowers or mixed inflorescences. It can have also hermaphrodite flowers. In this work we studied twelve phenological events of this species, its main herbivores, visitors and the pollinator species. We used orchid populations of five locations at the central region of São Paulo state (Brazil), around São Carlos municipality. For the study of visitors/pollinator bees we used blooming plants and vanillin, eugenol and cineol traps. We trapped and stamped the bees with automotive color brilliant ink. The pollinator of C. fimbriatum is Eufriesea violascens. This orchid is also visited by E. truncata and E. cordata. E. violascens has the most specific interaction with the orchid, since, we met it in the field only when the major number of orchids were bloomed, other wise, Euglossa spp. could be seen for more time. C. fimbriatum has his development affected by the herbivores action, mainly by the larva of Riechia acraeoides (Lepidoptera). We registered 14 host species, the main are: Acrocomia aculeata, Cedrela fissilis, Gochnatia polymorpha e Anadenanthera falcata. A statistics analysis shows linear correlation to the following factors: pseudobulb diameter and male flowers number, pseudobulb diameter and plant larger height, plant larger height and male flowers number, male flowers number and fruits number, female flowers number and fruits number. / Catasetum fimbriatum é uma orquídea epífita que apresenta forte dimorfismo sexual, podendo apresentar inflorescências com flores masculinas, femininas ou mistas. Apresenta ainda com menor freqüência flores hermafroditas. Neste trabalho, estudamos doze fenofases desta espécie, os seus principais herbívoros, visitantes e a espécie polinizadora. Utilizamos para isto populações de orquídeas de cinco locais na região central do Estado de São Paulo, nos arredores do Município de São Carlos. Para o estudo das abelhas visitantes/polinizadora utilizamos plantas floridas e garrafas-armadilha contendo eugenol, vanilina e cineol. Capturamos e marcamos as abelhas com tinta automotiva de brilho metálico. O polinizador de C. fimbriatum é Eufriesea violascens. Além disto esta orquídea é visitada por E. truncata e E. cordata. Para Eufriesea violascens a especificidade da interação é maior do que para Euglossa spp., pois, aquela foi observada no campo apenas quando a maior parte dos indivíduos desta orquídea estavam floridos, enquanto que estas últimas foram observadas quando a primeira já não era mais encontrada no campo. C. fimbriatum tem seu desenvolvimento afetado pela ação de herbívoros, principalmente, pela larva de Riechia acraeoides (Lepidoptera). Foram registradas 14 espécies hospedeiras, sendo as principais: Acrocomia aculeata, Cedrela fissilis, Gochnatia polymorpha e Anadenanthera falcata. Nas análises estatísticas os seguintes fatores apresentaram correlação linear: diâmetro do pseudobulbo e número de flores masculinas, diâmetro do pseudobulbo e tamanho máximo da planta, tamanho máximo da planta e número de flores masculinas, número de flores masculinas e número de frutos formados, número de flores femininas e número de frutos formados.