Unsere Bemühungen die Natur individueller Unterschiede der Emotionsregulation zu verstehen, involviert das Verständnis der Gene. In dieser Arbeit werden Gene (Kandidatengene), die für Proteine als Rezeptoren, Transporter oder Enzyme im Neurotransmitterstoffwechsel Serotonin und Dopamin kodieren, untersucht. Serotonin und Dopamin sind mit Angststörungen in verschiedener Weise assoziiert. Sie sind wichtige Neurotransmitter in Teilen des Gehirns, die mit Angstkonditionierung im Zusammenhang stehen. Polymorphismen in diesen Genen verändern die Struktur und Funktion der Genprodukte und nehmen damit Einfluss auf die Funktion von Hirnstrukturen und -systemen. Phobien sind äußerst intensive und persistente Furchtreaktionen, welche durch spezifische Situationen oder Objekte ausgelöst werden und von dem zwingenden Wunsch begleitet sind, diese Situationen oder Objekte zu vermeiden. Die Intensität der Furchtreaktion erscheint einem Außenstehenden, entsprechend der realen Gefahr dieser Situation, unangemessen und eigentümlich. Zumeist hat der Phobiker selbst auch Einsicht in diese Irrationalität seiner Furchtreaktion, vermag sie aber nicht willentlich unter Kontrolle zu halten. In dieser Arbeit wurden als Beispiel einer assoziierten Angst die Zahnbehandlungsphobie und als Beispiel einer nicht-assoziierten Angst die Spinnenphobie untersucht. Es wurden 53 Zahnbehandlungsängstliche, 52 Spinnenphobiker und 37 Kontrollpersonen mittels Fragebogen (SPF,FAS,STAI trait, DCQ, DFS, ASI, PANAS, R-IDCI) getestet. Die Probanden wurden durch PCR-Analyse von Mundschleimhautabstriche je einem Polymorphismus der untersuchten Kandidatengene zugeordnet. Es handelte sich dabei um die Gene für den Serotonintransporter 5HTT, den Serotoninrezepor 5HT1A, den Dopaminrezeptor DRD4, den Dopamintransporter DAT, BDNF und das in den Katecholaminabbau involvierte COMT-Enzym. Die untersuchten Polymorphismen weisen in der Literatur einen Einfluss auf die Angstausprägungen auf. In der statistischen Auswertung wurde auf signifikante Zusammenhänge zwischen einem Polymorphismus und der Ausprägung einer Phobie geachtet. Desweiteren wurden die verschiedenen Polymorphismen mit den Ergebnissen der Fragebogentests in Zusammenschau gebracht. Ein direkter Einfluss eines der untersuchten Gene auf die Ausprägung einer Phobie konnte nicht nachgewiesen werden. In der Gruppe der Dentalphobiker zeigten sich Hinweise auf einen Einfluss des BDNF G-Allels und des COMT G-Allels auf erhöhte Ängstlichkeit. / Understanding of individual differences in emotions is related to the understanding of genes. This paper analyses genes (candidate genes) that code for proteins as receptors, transporters or enzymes in the metabolism of neurotransmitter serotonin and dopamine. Serotonin and dopamine are in different ways associated with anxiety disorders. They are important neurotransmitter in parts of the brain that are associated with anxiety conditioning. Polymorphisms in these genes change the structure and function of gene products and have effect on the function of brain structures. In literature the analysed polymorphisms show influence on characteristics of anxiety. Phobias are very intense and persistent fearreactions, which are triggered by specific situations or objects. They are accompanied by the desire to avoid these specific objects/situations. The intensity of this fearreactions seems inadequate according to real danger. The phobic person himself realises the irrationality of the reaction, but cannot control it. In this paper dental phobia, as an example for associated anxiety, and spider phobia, as an example for non-associated anxiety, are analysed. 53 dentalphobic, 52 spiderphobic and 37 control persons are tested by questionnaires (SPF,FAS,STAI trait, DCQ, DFS, ASI, PANAS, R-IDCI). The test persons were related to each one polymorphism of a candidate gene by PCR-analysing of mouth mucosa samples. Analysed candidate genes are serotonin-transporter 5HTT, serotonin-receptor 5HT1A, COMT, dopamine-receptor DRD4, dopamine-transporter and neutrophin BDNF. The relationship between a polymorphism and the characteristics of a phobia was examined statistically. Further the questionnaire results and polymorphisms were analysed for relations. No direct influence could be shown for candidate genes on phobia characteristics. In the group of dental phobia, hints for influence of the BFNF G-allele and COMT G-allele on anxiety could be made.

Der brustgewebsspezifische Metabolismus des weiblichen Sexualhormons 17β-Estradiol (E2) spielt eine wichtige Rolle bei der Brustkrebsentstehung. In der Brust wird E2 durch die humanen Cytochrom P450-abhängigen Monooxygenasen (CYP) Isoenzyme 1A1 (hCYP1A1) und 1B1 (hCYP1B1) zu 2-Hydroxy (2-OH) und 4-HO-E2 oxidiert und vorrangig durch die Catechol-O-Methyltransferase (COMT) entgiftet. Bei unzureichender O-Methylierung können diese Catecholestrogene zu elektrophilen Chinonen oxidiert werden, welche mit der DNA reagieren und somit Mutationen induzieren können. Eine niedrige COMT-Aktivität, durch Polymorphismen und/oder durch Nahrungsbestandteile, die mit dem Enzym selbst oder seiner Genexpression wechselwirken, könnte daher die Mutagenität von E2 und dessen Catecholestrogenen beeinflussen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Hemmung der COMT-Aktivität auf die Mutagenität von E2 und dessen Catecholestrogenen untersucht. Zu diesem Zweck wurden der Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HPRT)-Test und der Mikrokern-Test eingesetzt. Die Untersuchungen erfolgten in kultivierten Lungenfibroblasten des Chinesischen Hamsters (V79-Zellen) und in V79-Zellen, die mit hCYP1A1 transfiziert wurden. Begleitend zu den Mutagenitätsuntersuchungen wurde das Metabolitenprofil der Testsubstanzen anhand von Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie bestimmt. Nach Inkubation mit 0,08 µM 2 HO-E2 wurde dieses vollständig zu dessen Methylcatecholen umgesetzt, ab 2,5 µM hingegen war zusätzlich 2 HO-E2 im Medium nachweisbar. Demnach war die Hemmung der COMT-Aktivität bei der Inkubation mit 0,08 µM 2 HO-E2 vollständig und ab 2,5 µM partiell. Mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität war 2 Methoxyestradiol der Hauptmetabolit. 2-HO-E2 induzierte im Konzentrationsbereich 0,08 µM - 5 µM, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität, keine Erhöhung der Mutantenfrequenz im hprt-Lokus von V79-Zellen. Im Gegensatz hierzu induzierte 2 HO-E2 ab 2,5 µM, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität, mindestens eine Verdreifachung der Mikrokernrate im Vergleich zur Kontrollpopulation, wobei dieser Effekt ohne Inhibierung der COMT-Aktivität stärker ausgeprägt war. Über den gesamten getesteten Konzentrationsbereich (5 - 40 µM) wurde 4 HO-E2 zu dessen beiden Methylcatecholen umgesetzt, wobei 4-Methoxyestradiol den größten Anteil der detektierten Verbindungen (≥ 86%) ausmachte. Nach der Behandlung mit 3,5-Dinitrocatechol waren keine Methylierungsprodukte mehr nachweisbar, weswegen von einer vollständigen Hemmung der COMT-Aktivität im gesamten getesteten Konzentrationsbereich auszugehen war. 4-HO-E2 induzierte über den gesamten getesteten Konzentrationsbereich keine Genmutationen im hprt-Lokus. Erst nach Hemmung der COMT-Aktivität und Behandlung mit 20 µM 4 HO-E2 wurde eine Verdreifachung der Mutantenfrequenz im Vergleich zur Kontrollpopulation beobachtet. Mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität induzierte 4 HO E2 ab 20 µM eine Verdopplung der Mikrokernrate im Vergleich zur Kontrollpopulation. Im Kulturmedium der V79 hCYP1A1-Zellen, die mit 0,1 und 1 µM E2 für bis zu drei Wochen behandelt wurden, machten über die gesamte Versuchsdauer E2 (> 86%) und Estron (> 10%, bezogen auf die Summe aller Peakflächen) den größten Anteil der detektierten Verbindungen aus. Wie erwartet, waren nach Hemmung der COMT-Aktivität keine Methylierungsprodukte mehr nachweisbar. Die durchgehende, zwei- und dreiwöchige Behandlung mit jeweils 0,1 und 1 µM E2 bewirkte keine Induktion von Genmutationen im hprt-Lokus. Demgegenüber erhöhte sich die Mutantenfrequenz nach Hemmung der COMT-Aktivität und dreiwöchiger Behandlung mit 0,1 µM E2 um Faktor 4 im Vergleich zur Kontrollpopulation. Was die Mikrokerninduktion betrifft, so wurde nach 24-stündiger Inkubation mit 0,1 und 1 µM E2, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität, keine Erhöhung der Mikrokernrate im Vergleich zur Kontrollpopulation beobachtet. Über die gesamte Dauer der Mutagenitätstests von E2 und dessen Catecholestrogenen unterschieden sich die Zellzyklusverteilung, die Wachstumskurven und die Koloniebildungsfähigkeit zum Zeitpunkt der Selektion, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität, nicht statistisch signifikant von denjenigen der Kontrollpopulationen. Demnach war von einer sicheren Detektion von Mutationen im HPRT-Test und im Mikrokerntest auszugehen. Zusammenfassend bestätigen die durchgeführten Untersuchungen, dass die zelluläre COMT-Aktivität eine essentielle Rolle zur Entgiftung mutagener Catecholestrogene spielt. Eine hundertprozentige Inhibierung der Aktivität dieses Enzyms führt zur Induktion von Genmutationen durch 4 HO-E2 in V79-Zellen ohne CYP-Aktivität und durch E2 in V79-Zellen, die hCYP1A1 exprimieren. Demnach könnte eine Reduktion der COMT-Aktivität durch Polymorphismen und/oder durch Nahrungsbestandteile, die mit dem Enzym selbst oder seiner Genexpression wechselwirken, die Induktion von Genmutationen durch E2 und dessen Catecholestrogenen begünstigen. / Oxidative metabolism of the female sex hormone 17β-estradiol (E2) is considered to play a major role in the initiation of hormone-induced carcinogenesis. In extrahepatic tissues, E2 undergoes metabolic activation by human cytochrome P450-dependent monooxygenase (CYP) isozymes 1A1 (hCYP1A1) and 1B1 (hCYP1B1) to 2-hydroxy (HO)- and 4-HO-E2. If not conjugated these catecholestrogens can further oxidize to electrophilic quinones, which may react with DNA and induce thereby mutations. Conjugation of these catechols in extrahepatic tissues is mainly catalyzed by catechol-O-methyltransferase (COMT). A low COMT activity, caused for example by polymorphisms and certain food components, which influence the enzyme activity or its gene expression, may therefore enhance quinone formation and thereby the induction of mutations. The aim of the present work was to determine the effect of inhibition of COMT on the mutagenic potential of a) the catechols 2- and 4-HO-E2 in V79 wild type cells without CYP activity and b) E2 in V79 cells expressing hCYP1A1. 3,5-dinitrocatechol (20 μM) served as COMT inhibitor. Gene and chromosomal mutations were assessed using the hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase (HPRT) and the micronuclei assay. In addition, the metabolite profile of E2 and its catechols in the culture medium was analyzed via gas chromatography/mass spectrometry. After incubation of V79 cells with 2-HO-E2, 2-methoxyestradiol was the major metabolite, whereas in the presence of the COMT inhibitor, disappearance (0.08 μM) and a decreased amount (2.5 μM or more) of methylated inactivation products was observed. Treatment of V79 cells with 0.08 μM – 5 μM 2-HO-E2, neither with nor without inhibition of COMT activity induced a significant increase in mutant frequency at the hprt locus. In contrast, at concentrations above or equal to 2.5 μM 2-HO-E2, at least a 3-fold increase of the micronuclei rate compared to control cells was observed with and without inhibition of COMT activity. Over the entire concentration range (5-40 μM) 4-HO-E2 was mainly converted to its methylation products, 4-methoxyestradiol being the major metabolite (≥ 86%) of the detected compounds. After treatment with 3,5-dinitrocatechol no methylation products were detected, thus indicating a complete inhibition of COMT over the entire concentration range. 4-HO-E2 did not induce gene mutations at the hprt locus in V79 cells with active COMT. Yet, after inhibition of COMT and treatment with 20 μM 4-HO-E2, a 3-fold increase in the mutant frequency was observed in comparison to control cells. Like 2-HO-E2, induction of micronuclei by 20 µM 4-hydroxyestradiol and more, was not affected by inhibition of COMT. In the culture medium of V79 cells expressing hCYP1A1, which were incubated with 0.1 and 1 μM E2 for up to three weeks, over the entire assay duration, E2 and estrone (86% and 10% of the sum of all peak areas, respectively) were the major metabolites. As expected, no methylation products were detected after inhibition of COMT. Treatment of V79 cells expressing hCYP1A1, for two and three weeks with 0.1 and 1 μM E2 did not induce gene mutations at the hprt locus. In contrast, a 4-fold increase in mutant frequency was observed in comparison to control cells after inhibition of COMT and treatment with 0.1 μM E2 for three weeks. With and without inhibition of COMT, no increase in micronuclei rate compared to control cells was observed after incubation with 0.1 and 1 μM E2 for 24 hours. Over the entire duration of the mutagenicity assays of E2 and its catechols, cell cycle distribution, cell growth and plating efficiency at the time of mutant selection, with and without inhibition of COMT, did not differ statistically significant from control cells; therefore a reliable detection of mutations in the micronuclei and the HPRT assay can be assumed. The present work confirms that cellular COMT is essential for the inactivation of mutagenic catechols. Complete inhibition of its enzyme activity results in the induction of gene mutations by 4-HO-E2 in V79 wildtype cells without CYP activity and also by E2 in cells expressing hCYP1A1. Polymorphisms and food components lowering COMT activity could therefore mediate the potential of E2 and its metabolites to induce gene mutations.

Theories of attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) aetiology have placed a focus on impaired behavioural inhibition presumably leading to executive function (EF) deficits. Neuroimaging studies report neurophysiological findings consistent with these hypothesised impairments, and investigations of functional brain activation from a network perspective report hypoactivation in the frontoparietal network as well as hyperactivation in the dorsal attention network. Studies investigating the acute effects of stimulant medication on EF show an improvement on behavioural EF measures including working memory. In addition, methylphenidate (MPH) was shown to up-regulate the task-positive/ frontoparietal network in children and adolescents with ADHD. So far, there are only few studies investigating the impact of ADHD on behavioural and neurophysiological EF measures as well as the effect of several weeks of stimulant medication in adult patients. The importance of the catechol-O-methyltransferase (COMT) enzyme for subcortical and cortical dopaminergic and noradrenergic functioning furthermore led to studies investigating a potential interactive impact of COMT genotype and ADHD on neuropsychological functioning, with a particular focus on working memory. The results of these studies were very heterogeneous. In addition, as none of the studies compared the results of ADHD patients to those of a healthy control group, possible differential effects of COMT in patients and healthy controls could not be examined. The aim of this dissertation was to investigate selective attention properties of the central executive component during a working memory task and to transfer this task to fMRI. A third study then aimed to investigate the effects of adult ADHD (aADHD), MPH, and COMT genotype on working memory with a particular focus on activation of the task-positive network during the analysis of the fMRI data. The first study (EEG) could replicate and extend the results from previous research. This study could furthermore connect the overall activation in frontal areas to suppression efficiency in posterior visual areas as well as establish the impact of hyperactive/ impulsive ADHD symptoms on task performance. The second study (fMRI) allowed the successful transfer of the paradigm to fMRI, and the further replication and extension of previous findings. In addition, this study showed the sensitivity of the task to the effects of the COMT genotype. The third study (fMRI) was one of the first studies that exploratorily investigated the effects COMT in a sample of aADHD patients and a comparable healthy control group. This study showed an interactive effect of these two factors on neuropsychological measures as well as on fMRI activation during a classic n-back working memory task. In addition, this task led to more activation in the task-positive network of the aADHD group compared to a healthy control group in the absence of performance differences, pointing towards compensatory activation in the aADHD group. Furthermore, activation in the frontal cortex was increased in patients taking MPH compared to a placebo. The fMRI data from the selective attention task moreover showed decreased activation in the right DLPFC of the patient group, which was associated with reduced suppression efficiency across all participants. The clinical effect of MPH in the third study was visible but did not reach significance, which is probably attributable to a lack of experimental power. The studies in this dissertation could successfully replicate and extend previous findings. A goal for future studies should be the further investigation of the interactive effects of COMT genotype and aADHD on neuropsychological test results and fMRI activation, but also on medication response and adverse effects. In this context, the adaptation of a network perspective during the analysis of fMRI data seems to be the best way to detect existing between-group differences. / Theorien zur Ätiologie der Aufmerksamkeitsdefizit-/ Hyperaktivitätsstö-rung (ADHS) konzentrieren sich oft auf defizitäre Prozesse der Verhaltensinhibition, die wiederum zu Defiziten der Exekutivfunktionen (EF) führen. Übereinstimmend mit diesen Beeinträchtigungen berichteten Neuroimaging-Studien von Hypoaktivierung im frontoparietalen Netzwerk sowie Hyperaktivierung im dorsalen Aufmerksamkeitsnetzwerk. Studien zur Wirkung von Stimulanzien zeigten eine Verbesserung von EF-Maßen einschließlich des Arbeitsgedächtnisses sowie eine Hochregulierung des aufgabenpositiven/ frontoparietalen Netzwerks durch Methylphenidat (MPH). Bis jetzt untersuchten nur wenige Studien die Auswirkungen von ADHS auf neurophysiologische und Verhaltensmaße der EF sowie den Effekt von länger andauernder Stimulanziengabe bei erwachsenen Patienten. Die Wichtigkeit des Enzyms Catechol-O-Methyltransferase (COMT) für subkortikale und kortikale dopaminerge und noradrenerge Funktionen führte darüber hinaus zu Studien, die eine potentielle Interaktion in der Wirkung des COMT Genotyps und ADHS auf neuropsychologische Funktionen und insbesondere auf das Arbeitsgedächtnis untersuchten. Die Ergebnisse dieser Studien waren recht heterogen. Da zudem keine der Studien die Ergebnisse der ADHS-Patienten mit denen einer gesunden Kontrollgruppe verglich, konnten möglicherweise vorhandene unterschiedliche Einflüsse von COMT bei Patienten und gesunden Kontrollprobanden nicht angemessen ermittelt werden. Das Ziel dieser Dissertation waren zunächst die Untersuchung von selektiven Aufmerksamkeitsprozessen, die durch die Zentrale Exekutive vermittelt werden, sowie die Übertragung der dazu verwendeten Arbeitsgedächtnisaufgabe ins fMRT. Eine dritte Studie strebte die Untersuchung der Auswirkungen von ADHS bei Erwachsenen (aADHS), MPH und COMT Genotyp auf das Arbeitsgedächtnis an. Ein besonderer Fokus bei der Analyse der fMRT-Daten lag hierbei auf der Aktivierung des aufgabenpositiven Netzwerks. Die erste Studie (EEG) konnte bisherige Forschungsergebnisse replizieren und erweitern. Zudem konnte diese Studie die Gesamtaktivierung in frontalen Bereichen mit der Unterdrückungseffizienz in posterioren visuellen Bereichen in Verbindung bringen sowie einen Einfluss von hyperaktiv/ impulsiver ADHS-Symptomatik auf die Verhaltensleistung feststellen. Die zweite Studie (fMRT) zeigte eine erfolgreiche Übertragung des Paradigmas auf das fMRT und eine weitergehende Replizierung und Erweiterung vorheriger Forschungsergebnisse. Es konnte außerdem die Sensitivität der Aufgabe für die Effekte des COMT Genotyps gezeigt werden. Die dritte Studie (fMRT) war eine der ersten Studien, die exploratorisch die Effekte von COMT in einer Stichprobe von aADHS-Patienten und einer vergleichbaren gesunden Kontrollgruppe untersuchte. Hier zeigte sich eine Interaktion von COMT Genotyp und aADHS auf die erhobenen neuropsychologischen Maße sowie auf die fMRT-Aktivierung während einer n-back Arbeitsgedächtnisaufgabe. Die Aufgabe führte zu mehr Aktivierung im aufgabenpositiven Netzwerk der aADHS-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Da keine Leistungsunterschiede zwischen den Gruppen zu erkennen waren, weist diese Hyperaktivierung auf eine kompensatorische Aktivierung in der aADHS-Gruppe hin. Zudem zeigte sich eine erhöhte Aktivierung im Frontalkortex bei Patienten, die MPH statt einem Placebo einnahmen. Die fMRT-Daten der Aufgabe zur selektiven Aufmerksamkeit zeigten außerdem eine reduzierte Aktivierung im rechten DLPFC der Patientengruppe, die über alle Probanden hinweg mit einer reduzierten Unterdrückungseffizienz assoziiert war. Der klinische Effekt von MPH in der Patientenstichprobe war sichtbar, erreichte aber keine Signifikanz, was vermutlich auf eine zu geringe experimentelle Power zurückzuführen ist. Die Studien in dieser Dissertation konnten vorherige Befunde erfolgreich replizieren und erweitern. Ein Ziel für zukünftige Studien sollte die weitergehende Untersuchung dieser Fragestellungen sein. Vor allem in Bezug auf eine Interaktion von COMT Genotyp und aADHS auf neuropsychologische Testergebnisse und fMRT-Aktivierung, aber auch auf Medikamenten-Response und Nebenwirkungen ist dies von großer Bedeutung. Die Übernahme einer Netzwerkperspektive bei der Analyse von fMRT-Daten scheint zudem der beste Weg, existierende Unterschiede zwischen den Gruppen zu finden.

La pollution des eaux par les métaux est devenue un problème majeur. Il est donc nécessaire de contrôler régulièrement la qualité des eaux de consommation et de rejet, selon les fréquences et les paramètres d'analyses définis par le décret européen -2001-1220 de Décembre 2001. Face à de nouvelles normes de plus en plus exigeantes, la sensibilité et la limite de détection des appareillages (ICP-AES par exemple) deviennent problématiques pour la quantification des métaux. Une étape de préconcentration préliminaire à l'analyse serait une alternative. Parmi les différentes méthodes de préconcentration, l'extraction en phase solide chélatante est particulièrement adaptée à l'extraction d'espèces métalliques en milieu aqueux. Elle fait intervenir des interactions entre une phase liquide et un support solide poreux modifié par un ligand, générant un mécanisme de rétention spécifique vis-à-vis de l'analyte (Chélation). Différents types de supports solides peuvent être employés en SPE. Les polymères organiques de synthèse et plus particulièrement les copolymères à base de styrène et de divinylbenzène (EVBDVB) offrent les performances attendues pour une telle application : stabilité sur une large gamme de pH, bonnes propriétés chimiques, physiques et thermiques. Afin d'améliorer les propriétés complexantes des copolymères EVB-DVB vis-à-vis des métaux, l'introduction d'un ligand est nécessaire pour obtenir un support poreux chélatant. Dans le cadre de ces travaux, le 1,2- benzènediol (catéchol) a été sélectionné pour sa capacité à retenir les espèces métalliques et parce qu'il permet d'envisager deux voies d'incorporation : 1. Greffage du catéchol sur un copolymère EVB-DVB commercial (Amberlite® XAD4 de Rohm et Haas) via des ponts imines réduits et diazonium ; 2. Copolymérisation en suspension d'un monomère styrénique comportant le catéchol avec du divinylbenzène. Les supports solides fonctionnalisés issus des deux modes de préparation sont caractérisés par ATG-DSC, Py-GC/MS et spectroscopie IRTF afin de valider l'incorporation du catéchol. Les propriétés complexantes pour le Cd(II), Cu(II), Ni(II) et Pb(II) ont été déterminées par ICP-AES et sont reliées aux taux de fonctionnalisation (évalués par dosage acido-basique en retour des fonctions hydroxyles du catéchol) et aux propriétés texturales (surface spécifique, volume poreux, diamètres de pores déterminés par adsorption/désorption de gaz). Par rapport au greffage, la copolymérisation en suspension permet de faire varier la quantité de ligand introduit, de conserver la sphéricité des supports et de contrôler la taille des particules, en réduisant à la fois le coût et les contraintes de mise en oeuvre. Ce procédé de préparation a permis d'aboutir à des matériaux originaux (peu colorés) ouvrant des perspectives notamment en terme d'application : détection directe des métaux retenus par spectroscopie de réflexion diffuse.

In this study, the aim was identification and classification of the enzyme having phenol oxidase activity produced by a thermophilic fungus, Scytalidium thermophilum. For this purpose, enzyme production, purification, biochemical characterization and structural analysis by X-ray crystallography studies have been performed. At the beginning of the research, this enzyme was considered as a phenol oxidase and analyzed accordingly. However, during purification, amino acid sequencing and structural studies, the enzyme was shown to be a catalase, with an additional catechol oxidase activity. This novel bifunctional catalase-catechol oxidase (CCO) was purified 10 fold with 45 % yield by anion exchange and gel filtration chromatographies. CCO was determined as a tetrameric protein having total and subunit molecular weights of 320 and 80 kDa, respectively. Isoelectric point of CCO was verified as 5.0. CCO catalase and catechol oxidase activities were characterized in terms of their kinetic behavior at different pH and temperatures. Depending on the substrate specificity and inhibitor studies of CCO, the phenol oxidase activity was determined as catechol oxidase but not tyrosinase or laccase. The best crystallization condition for CCO was determined and X-ray diffraction data was collected at the Daresbury Synchrotron Radiation Source (United Kingdom) at 2.7 &Aring / resolution. The preliminary structure was solved by molecular replacement method using Penicilium vitale catalase structure. CCO was verified to have a tetrameric structure with two homodimers and a metal center in each polypeptide chain.

In dieser Arbeit wurden PCR-Primer für den Nachweis von Genen des bakteriellen Chloraromaten-Abbaus entwickelt. Als Zielgene wurden hierfür die Gene der Chlorcatechol-1,2-Dioxygenasen und Chlormuconat-Cycloisomerasen des modifizierten ortho-Weges ausgesucht. Die entwickelten Primer wurden an verschiedenen Chloraromaten abbauenden Bakterien getestet. Es gelang dabei erstmals, Fragmente von Chlormuconat-Cycloisomerase-Genen aus alpha-Proteobakterien zu erhalten. Mit den neu entwickelten Primern zum Nachweis der Chlorcatechol-1,2-Dioxygenase-Gene wurden aus den Stämmen Burkholderia sp. 3CB-1 und Rhodococcus opacus 1CP auch Fragmente amplifiziert, die nur relativ geringe Ähnlichkeiten zu bereits bekannten Genen aufwiesen. Um die Sequenzdatenbasis für das Primerdesign zu erweitern, wurden außerdem Chlorcatechol-Gencluster aus zwei Vertretern der alpha-Proteobakterien kloniert und sequenziert. Aus dem Stamm Sphingomonas sp. TFD44 konnten dabei zwei verschiedene Gencluster charakterisiert werden, von denen nur eines einen kompletten Satz der Chlorcatechol-Gene enthielt. Die beiden Gencluster aus dem anderen Stamm, Sphingomonas sp. EML146, wiesen Homologien zu diesem Gencluster auf. Die Konstruktion einer Knockout-Mutante und Proteinanreicherungen ergaben Hinweise auf weitere Chlorcatechol-Abbaugene in Sphingomonas sp. TFD44.

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 2001. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 326-347). Also available on the Internet.

The goal of this study is to utilize polymers as macromolecular ligands for the construction of catalysts by formation of coordination complexes with transition metals with the main focus on complexes of Cu(II) and Fe(III) and further determine (a) their catalytic efficiency (b) mechanism of action (c) similarities to enzymatic systems and synthetic metal complexes. The reactions of interest are (1) hydrolytic cleavage of a series of phosphoesters(2) oxidation of catechol type of substrates (3) hydroxylation of phenolic substrates and chlorinated phenols (4) activation of molecular oxygen and/ or hydrogen peroxide (5)oxidative cleavage of DNA plasmid. The major premise of the study is that by mimicking the macromolecular nature and some structural features of enzymes, polymers can in principle, catalyze chemical transformations with similar efficiencies and specificities and can offer alternatives to peptide based catalysts or simple metal complexes with the advantage of a wider range of building blocks, increased stability and the potential of reusability. The crosslinked resins used contained the functional groups iminodiacetate (chelex resin), diethylenetriamine and tris(2-aminomethylamine) and were based on styrene-divinylbenzene backbone. The catalytic proficiencies of the Fe(III) and the Cu(II) complexes of chelex resin and diethylenetriamine approached 100 and 1000 respectively towards the model phosphodiester BNPP at pH 8.0 and 25°C. Moreover, the Fe(III) complexes of linear copolymers with repeating unit of three vinylpyridines to one acrylamide (P1) showed selectivity towards phosphodiester hydrolysis over monoesters and phosphonate esters and exhibited catalytic proficiencies approaching 50,000 towards BNPP hydrolysis. Further exploration of the catalytic capabilities of copolymer P1 revealed that Cu(II) complexes of this macromolecular ligand are potentially capable of assembling to active dicopper intermediates found in the catalytic pathways of copper oxygenases like tyrosinase and catechol oxidase and thus were able to accelerate catechol oxidation to ortho-quinones with rate accelerations approaching 10,000 and hydroxylate phenols with rate accelerations close to one million. The results suggest that these Cu(II)-polymer systems can potentially be used as model systems to further understand metal centered reactive oxygen species (ROS) generated in vivo and can be very promising remediation agents for the dechlorination of persistant chlorine containing pollutants.

Tendons, essential tissues that connect muscles to bones, are susceptible to rupture/degeneration due to their continuous use for enabling movement. Often surgical intervention is required to repair the tendon; relieving the pain and fixing the limited mobility that occurs from the damage. Unfortunately, post-surgery immobilization techniques required to restore tendon properties frequently lead to scar formation and reduced tendon range of motion. Our ultimate goal is to create an optimal tendon prosthetic that can stabilize the damaged muscle-bone connection and then be remodeled by resident cells from the surrounding tissues over time to ensure long-term function. To achieve this, we must first understand how cells respond to and interact with candidate replacement materials. The most abundant extracellular matrix (ECM) protein found in the body, collagen, is chosen as the replacement material because it makes up the majority of tendon dry mass and it can be remodeled by cell-based homeostatic processes. Previous studies found that Di-catechol nordihydroguaiaretic acid (NDGA) cross-linked fibers have greater mechanical strength than native tendons; and for this reason this biomaterial could be used for tendon replacement. This work focuses on investigating the behavior of fibroblasts on NDGA cross-linked and uncross-linked collagen samples to determine if cross-linking disrupts the cell binding sites affecting cell spreading, attachment, and migration. The in-vitro platform was designed by plasma treating 25 mm diameter cover slips that were exposed to 3-aminopropyl-trimetoxysilane/toluene and glutaraldehyde/ethanol solutions. The collagen solution was then dispensed onto the glutaraldehyde-coated cover slip and incubated for fibrillar collagen matrix formation. The collagen matrices were submerged in NDGA cross-linking solution for 24 hours to ensure the surface was completely cross-linked. Collagen films were made by allowing the uncross-linked gels to dry overnight before and after NDGA treatment, resulting in a more compacted structure. A spinning disk device was employed to quantify the ability of cells to remain attached to the collagen samples when exposed to hydrodynamic forces. To avoid any cell-cell interaction and focus on cell-surface interactions, 50-100 cells/mm2 were seeded carefully on each sample. Temporal studies demonstrated that cell adhesion strength and spreading area reached steady-state by 4 hr. Adhesion and spreading studies along with migration experiments demonstrated that NDGA treatment affects cellular behavior on films, partially reducing adhesion strength, migration, and spreading area. However, on the cross-linked gels which are less dense, the only change in cell behavior observed was in migration speed. We hypothesize that these differences are due to the collapsing of the collagen films. This compaction suggests a less open organization and could be allowing the collagen fibers to form more inter-chain bonds as well as bonds with the small NDGA cross-linker; while NDGA treatment of the fully hydrated gels may rely more on NDGA polymerization to span the greater distance between collagen fibrils. From these results, we can determine that the chemical/physical masking of the adhesion sites by NDGA on collagen films affects cellular behavior more than the masking that occurs in the cross-linked gels. Although this study shows an effect in cell behavior on the cross-linked films, it also demonstrates that cells can adhere and migrate to this NDGA biomaterial supporting the idea that this biomaterial can be utilized for tendon replacement.

In this study, the aim was to find an economical plant source for polyphenol oxidase (PPO) production as an alternative to mushroom and possible application areas by characterization and immobilization of the PPOs. For this purpose, tissues of various plants of no commercial value were screened for their PPO activities. Mulberry leaf tissues showed the highest PPO activity against 4-methyl catechol which was comparable to that of mushroom. Average Km and Vmax values of free mulberry leaf PPOs were found as 7 mM and 218 U/ml, respectively. Mulberry leaf PPOs were immobilized in a polypyrole matrix and the Km and Vmax values of immobilized PPOs were calculated as 35 mM and 3 U/ml, respectively. Mulberry leaf PPO was the most active at 45&deg / C and pH 7. By using electrophoretic analysis, laccase and catechol oxidase type activities of PPOs and in addition, peroxidase activity were detected. Molecular weights of laccase, peroxidase and catechol oxidase were found to be about 62, 64 and 62-64 kDa, with pI values of 8.0-8.5, 4.5 and 10, sequentially.