Le paracétamol est l'antalgique le plus consommé au monde et pourtant son mécanisme d'action n'est toujours pas élucidé. Longtemps reconnu comme un produit proche des anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) son profil est aujourd'hui reconsidéré grâce aux travaux effectués depuis une dizaine d'années. Il est désormais admis que le paracétamol est un antalgique d'action prioritairement cérébrale et l'impact sur les cyclo-oxygénases, cibles traditionnelles des AINS, ne représente plus la base de son mécanisme d'action. Nos travaux de thèse montrent que l'action antalgique du paracétamol est perdue chez des animaux dont le canal Cav3.2 a été invalidé, ceci dans divers contextes expérimentaux. Ainsi ces canaux semblent être indispensables à l'effet antalgique du paracétamol. Nous avons également démontré le site de cette implication. En effet, seuls les canaux Cav3.2 cérébraux sont impliqués dans l'effet du paracétamol, ce qui rejoint les résultats précédents qui présentent le paracétamol comme un antalgique d'action centrale. Au niveau cérébral nous avons aussi démontré que les canaux Cav3.2 agissaient de concert avec deux acteurs primordiaux pour l'effet du paracétamol : l'AM404, son métabolite actif et les récepteurs TRPV1. La finalité de cette relation est l'inhibition des canaux Cav3.2 qui induit l'effet antalgique du paracétamol. Parallèlement, nous avons démontré pour la première fois que l'inhibition des canaux Cav3.2 cérébraux induisait une antalgie. Ceci confirme l'implication tonique de ces canaux supra-spinaux dans la perception douloureuse. Enfin, nous avons également démontré que les canaux Cav3.2 étaient fortement impliqués dans la douleur de type inflammatoire et, de manière plus surprenante et intéressante, dans les processus inflammatoires associés (développement oedémateux et production des médiateurs pro-inflammatoires). En conformité avec ces résultats, nous avons démontré que l'éthosuximide (un bloqueur des canaux Cav3.2) était efficace dans le traitement des douleurs inflammatoires et de l'inflammation ainsi que sur leurs comorbidités associées (anxiété et dépression). En conclusion, la confirmation de l'implication des canaux Cav3.2 dans l'effet du paracétamol et dans la douleur inflammatoire ouvre une voie nouvelle dans la compréhension du mécanisme d'action de cet antalgique et dans la conception et le développement de nouveaux antalgiques, ciblant ces canaux. Cette perspective est renforcée par les démonstrations déjà faites du rôle de ces canaux dans la physiopathologie des douleurs neuropathiques. De plus et de façon intéressante, l'éthosuximide, un antiépileptique utilisé chez l'homme et inhibiteur des canaux Cav3, permet d'envisager la réalisation d'une étude clinique pilote sur l'évaluation de son effet antalgique. Nous proposons le protocole de cette étude, preuve de concept, réalisée dans un premier temps chez des patients atteints de douleurs neuropathiques. / Acetaminophen is the most analgesic consumed worldwide, but its mechanism of action is still not understood. Long recognized as non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), its profile is now reconsidered thanks to the work done over the last ten years. It is now accepted that acetaminophen is an analgesic with a central action and the impact on cyclooxygenase, traditional targets of NSAIDs, is no longer the basis of its mechanism of action. This work show that the analgesic effect of acetaminophen is lost in animals whose Cav3.2 channel has been invalidated, this in various experimental contexts. Thus, these channels appear to be essential for the analgesic effect of acetaminophen. We also demonstrated the nature of that involvement. Indeed, only the brain Cav3.2 channels are involved in the effect of acetaminophen, which joined the previous results showing that acetaminophen is a centrally acting analgesic. In the brain, we also demonstrated that Cav3.2 channels acting in concert with two crucial actors to the effect of acetaminophen: AM404, its active metabolite, and TRPV1 receptors. The purpose of this relationship is the inhibition of Cav3.2 channels that induces analgesic effect of acetaminophen. In parallel, we have demonstrated for the first time that inhibition of brain Cav3.2 channels induced analgesia. This confirms the tonic involvement of these channels in supraspinal pain perception. Finally, we also demonstrated that Cav3.2 channels were heavily involved in the inflammatory pain and, more surprising and interesting, in inflammatory processes associated (edema development and production of pro-inflammatory mediators). Related to these results, we demonstrated that ethosuximide (a Cav3.2 channel blocker) was effective in the treatment of inflammatory pain and inflammation as well as their associated comorbidities (anxiety and depression). In conclusion, the confirmation of the interaction of Cav3.2 channels in the effect of acetaminophen and pain perception opens a new path in understanding the mechanism of action of acetaminophen and in the design and development of new analgesics targeting Cav3.2 channels. This perspective is reinforced by the demonstrations previously done of the role of these channels in the pathophysiology of neuropathic pain. More and interestingly, ethosuximide, an antiepileptic drug used in humans and Cav3 channels inhibitor, allows to consider the realization of a pilot clinical study on the evaluation its antalgic effect. We propose the protocol of this study, proof of concept, performed in a first time in patients of neuropathic pain.

La douleur est un mécanisme essentiel pour la survie, mais les douleurs chroniques sont souvent invalidantes. Les douleurs de longue durée sont une des premières causes de consultation médicale, et affectent 20% de la population. Par contre, les traitements actuels sont souvent inefficaces au long cours, avec un ratio bénéfice/risque faible. Il est ainsi une priorité majeure la recherche des nouveaux agents thérapeutiques. Pour ce faire, la compréhension de réseaux impliqués dans la douleur est essentielle.Plusieurs études ont montré que Cav3.2, un canal calcique à bas seuil, pourrait être une cible analgésique prometteuse. En fait, Cav3.2 est exprimé tout le long de voies douloureuses, au niveau périphérique ainsi qu’au niveau central. Notamment, Cav3.2 est fortement exprimé dans la corne dorsale de la moelle épinière, qui constitue le premier relai d’intégration de l’information douloureuse. De plus, grâce à son activation aux potentiels proche du repos, Cav3.2 est bien placé pour réguler l’excitabilité neuronale et l’intégration synaptique. Au cours de cette thèse nous avons étudié la distribution de ce canal dans les interneurones de la lamina II de la corne dorsale. Nos résultats montrent que le canal est exprimé dans différentes types d’interneurones (~60%), majoritairement excitateurs, mais aussi inhibiteurs. De façon intéressante, tous les neurones PKCγ, impliqués dans l’allodynie mécanique, expriment le canal Cav3.2. Nous avons ensuite utilisé une approche virale pour marquer et étudier les propriétés électrophysiologiques des neurones exprimant Cav3.2, ainsi que pour réprimer de façon spécifiques le canal dans la partie lombaire de la moelle épinière. Nos résultats montrent que Cav3.2 participe dans les rebonds dépolarisants sous-liminaires, dans les propriétés des potentiels d’action et dans les profils d’activité électrique de ces neurones. Ainsi, Cav3.2 pourrait jouer un rôle important dans les états douloureux au niveau spinal, caractérisés par des changements dans l’excitabilité. / Acute pain is essential for survival, but chronic pain is often invalidating. Prolonged pain states are one of the first causes of medical consultation, and they are experienced by as much as 20% of the population. However, our current analgesics are not fully reliable in alleviating chronic pains, with low beneficial/risk ratio. Thus, finding new pharmacological agents are a primordial objective. A better understanding of pain networks is necessary.Several studies have suggested that the T-type calcium channel, Cav3.2, might be a promising target for analgesics. Indeed, Cav3.2 is expressed all along pain pathways, both within the peripheral nociceptive track and within the central nervous system. Interestingly, Cav3.2 is strongly express in the dorsal horn of the spinal cord, which is the first relay for pain processing. Furthermore, thanks to their activation near resting potentials, Cav3.2 channels fit well in regulating neuronal excitability and synaptic integration.In this thesis, we have analyzed Cav3.2 expression in dorsal horn interneurons. Our results show that Cav3.2 is expressed in different types of interneurons (~60%), mostly excitatory, but also inhibitory. Interestingly, all PKCγ neurons, involved in mechanical allodynia, expressed Cav3.2. We then used a viral approach to label and study electrophysiological properties of Cav3.2-expressing neurons, and also to specifically delete this channel in the lumbar spinal cord. Our results show that Cav3.2 is involved in subthreshold depolarizations, in the properties of the action potentials and in the firing patterns of these neurons. Thus, Cav3.2 might play an important role in pain states at the spinal cord level, characterized by neuronal excitability alterations.

Le traitement et la gestion de la douleur sont depuis toujours une priorité pour le corps médical. Malgré leur importance pour la qualité de vie, les analgésiques couramment utilisés possèdent un ratio bénéfice/risque faible. La recherche de nouveaux concepts thérapeutiques pour lutter contre la douleur est donc une priorité. Afin de répondre à ce besoin, il faut d'abord comprendre les mécanismes de la perception de la douleur ainsi que, plus globalement, ceux permettant de percevoir son environnement. Dans ce contexte, de nombreuses études ont mis en évidence l'implication du canal calcique à bas seuil Cav3.2 dans les voies de la transmission de l'information douloureuse. Il représente donc une cible de choix pour le traitement de la douleur mais l'identité des neurones exprimant ces canaux ainsi que la fonction de Cav3.2 dans la physiologie des neurones sensoriels étaient jusqu'à présent inconnues. Au cours de cette thèse nous avons dans un premier temps décrit un nouvel inhibiteur des canaux calciques à bas seuil : le TTA-A2. Nous avons ainsi démontré que le TTA-A2 est un inhibiteur spécifique des canaux Cav3.1, Cav3.2, et Cav3.3. Il permet de diminuer l'excitabilité des neurones sensoriels exprimant Cav3.2, ce qui provoque une analgésie sur des animaux sains et pathologiques. Dans un deuxième temps nous nous sommes servis de ce nouvel outil en parallèle d'un nouveau modèle murin possédant une étiquette fluorescente (Knock in GFP) sur le canal Cav3.2 pour explorer la localisation et la fonction de Cav3.2 dans les neurones sensoriels. Nous avons ainsi découvert que Cav3.2 est exprimé dans des mécanorécepteurs à bas seuil impliqués dans la perception des stimuli mécaniques et thermiques nocifs ou non-nocifs. Le canal en lui-même se trouve aux endroits clés de la genèse et de la propagation du message nerveux périphérique, et module le seuil et la vitesse de conduction des potentiels d'action. Replacé dans le contexte de la bibliographie, l'ensemble de nos résultats montre que Cav3.2 permet de donner la modalité à bas seuil aux neurones l'exprimant. / Pain management and treatment have always been a priority for life quality. Despite this fact, analgesics commonly used present a bad benefice/risk ratio. Discovery of new therapeutic concepts to fight pain is highly required. To complete this task, we first need to better understand pain perception mechanisms, and more globally, mechanisms involved in the perception of our environment. In this context, numerous studies have shown that low threshold calcium channels Cav3.2 are involved in pain information transmission. Thus, it represents a good target for the treatment of pain. However, neuronal identity of Cav3.2-expressing sensory neurons and Cav3.2 functions in neuronal physiology are unknown. During this PhD we first described a new low voltage activated channel antagonist named TTA-A2. We demonstrated that TTA-A2 is a powerful nanomolar specific agonist of Cav3.1, Cav3.2 and Cav3.3. This molecule is able to reduce excitability in sensory neurons expressing Cav3.2, and is able to generate a strong analgesic effect on naive and pathologic animals. In the other part of this PhD, we used this new tool combined to a new transgenic mouse that expressed Cav3.2 tagged with a fluorescent protein (Knock-in GFP). With these new tools we discovered that Cav3.2 is expressed in low threshold mechanoreceptors involved in detection of painful and non painful mechanical and thermal stimuli. Cav3.2 itself is expressed at key localisations that allow action potential generation and propagation, and modulate threshold and speed conduction of action potential. Taken together, these results show that Cav3.2 gives the “low threshold” modality to neurons.

Les canaux de type T Cav3.2 sont des canaux calciques activés pour de faibles dépolarisations membranaires. Ils ont un rôle important dans la régulation de l’excitabilité neuronale, particulièrement dans les neurones des ganglions rachidiens dorsaux (DRG) où ils sont impliqués dans la transmission de la douleur. Il est établi que les canaux Cav3.2, natifs et recombinants, sont inhibés par de faibles concentrations de métaux divalents tels que le zinc et le nickel et qu’ils sont modulés par des agents oxydo-réducteurs. In vitro, la mutation ponctuelle de l’histidine 191 en glutamine (H191Q) diminue fortement la sensibilité du canal Cav3.2 pour ces différents composés et il est proposé que cette régulation joue un rôle physiologique. L’objectif de ce travail de thèse a été d’étudier l’impact physiologique de cette modulation sur l’excitabilité neuronale et dans la perception de la douleur. Pour ce faire, nous avons généré une souris knock-in (KI) portant la mutation H191Q sur Cav3.2. L’étude électrophysiologique a été réalisée sur une population de neurones de DRG particulière : les cellules D-hair qui sont des mécanorécepteurs exprimant de grands courants Cav3.2. Nous avons validé que la sensibilité des canaux Cav3.2 neuronaux des souris KI est diminuée pour le zinc, le nickel et l’ascorbate. Nous montrons que cette régulation modifiée favorise une augmentation de l’excitabilité de ces neurones. Pour étudier l’impact de cette modulation in vivo, nous avons effectué des études comportementales. Les souris KI ne présentent pas de différence dans la perception de la douleur mécanique et thermique, ni dans l’hyperalgésie induite par l’inflammation et la neuropathie. Toutefois, dans le test à la formaline les souris KI montrent une réponse exacerbée dans la phase tardive. En résumé, nous décrivons ici un modèle animal original pour l’étude de la régulation metal/redox du canal Cav3.2 et identifions un rôle de cette modulation dans l’excitabilité des neurones D-Hair. Nos résultats obtenus in vivo indiquent cependant que cette modulation des canaux Cav3.2 aurait un impact limité dans les voies de la douleur. / Cav3.2 T-type channels are low-voltage activated calcium channels. They have an important role in the regulation of neuronal excitability, particularly in neurons of the dorsal root ganglia (DRG) where they are involved in pain transmission. It is established that Cav3.2 channels are inhibited by low concentrations of divalent metals such as zinc and nickel, and are modulated by redox agents. In vitro, the histidine191-to-glutamine mutation (H191Q) greatly reduces the Cav3.2 channel sensitivity to these compounds and it is proposed that this regulation plays a physiological role. The objective of this thesis was to study the physiological impact of this modulation on neuronal excitability and pain perception. To do this, we generated a knock-in (KI) mouse carrying the H191Q mutation on Cav3.2. Electrophysiological study was carried out on a particular population of DRG neurons, the D-hair cells, which are mechanoreceptors that express large Cav3.2 currents. We show that the sensitivity to zinc, nickel and ascorbate of the neuronal Cav3.2 channels is significantly reduced in the KI mouse. We also show that this modified regulation promotes an increase in the excitability of these neurons. To study the impact of this modulation in vivo, we performed behavioral studies. KI mice show no difference in the perception of mechanical and thermal pain, nor in hyperalgesia induced by inflammation and neuropathy. However, KI mice show an exaggerated response in the late phase in the formalin test. In summary, we describe here an original animal model to study the metal/redox regulation of Cav3.2 channel and identify a role of this modulation in the excitability of D-Hair neurons. Our results indicate, however, that this modulation of Cav3.2 channel may have a limited impact in the pain pathways.

Yes / Ion channels represent a large and growing family of target proteins regulated by gasotransmitters such as nitric oxide, carbon monoxide and, as described more recently, hydrogen sulfide. Indeed, many of the biological actions of these gases can be accounted for by their ability to modulate ion channel activity. Here, we report recent evidence that H2S is a modulator of low voltage-activated T-type Ca2+ channels, and discriminates between the different subtypes of T-type Ca2+ channel in that it selectively modulates Cav3.2, whilst Cav3.1 and Cav3.3 are unaffected. At high concentrations, H2S augments Cav3.2 currents, an observation which has led to the suggestion that H2S exerts its pro-nociceptive effects via this channel, since Cav3.2 plays a central role in sensory nerve excitability. However, at more physiological concentrations, H2S is seen to inhibit Cav3.2. This inhibitory action requires the presence of the redox-sensitive, extracellular region of the channel which is responsible for tonic metal ion binding and which particularly distinguishes this channel isoform from Cav3.1 and 3.3. Further studies indicate that H2S may act in a novel manner to alter channel activity by potentiating the zinc sensitivity/affinity of this binding site. This review discusses the different reports of H2S modulation of T-type Ca2+ channels, and how such varying effects may impact on nociception given the role of this channel in sensory activity. This subject remains controversial, and future studies are required before the impact of T-type Ca2+ channel modulation by H2S might be exploited as a novel approach to pain management. / This work was supported by grants from the British Heart Foundation, the Medical Research Council, and the Hebei Medical University

La réaction acrosomique de Mammifère nécessite l'ouverture successive de trois canaux calciques : un canal calcique activé par de faibles dépolarisations (LVA), le récepteur à l'IP3 et un canal activé par la vidange des stocks (SOC) TRPC2. Nos données montrent une intéressante interaction fonctionnelle entre le canal LVA et les protéines dont l'activité est liée au niveau de remplissage du réticulum (vraisemblablement les canaux TRPCs et l'IP3R). Toute la signalisation calcique de la RA est sous le contrôle du canal LVA qui est le premier à s'activer. En utilisant les souris déficientes pour Cav3.1, Cav3.2, nous avons montré que la sous-unité α1H est la sous-unité majoritaire dans les cellules spermatogéniques sauvages. Nos données fournissent de nouvelles hypothèses concernant l'activation de TRPC2 : celle-ci pourrait être due à des modifications de son interaction avec la junctate et l'IP3R, induite par la vidange des stocks.

In mammals, calcium influx is required for oocyte maturation and egg activation, as it supports the persistent calcium oscillations induced by fertilization. These oscillations are required for the initiation of embryo development. The molecular identities of the plasma membrane calcium-permeant channels that underlie calcium influx are not established. Among these channels, Transient Receptor Potential Vanilloid, member 3 (TRPV3) allows divalent cations, namely strontium (Sr2+) and calcium (Ca2+) with high permeability, into cells, and its expression pattern seems to predict an essential role in the initiation of development. Another channel that was identified to be expressed in oocytes/eggs is the low-voltage-activated T-type channel, CaV3.2. However, the ability to accurately probe the expression and function of these channels on Ca2+ homeostasis in mouse eggs is hindered by the lack of specific and known pharmacological agents and antibodies for these channels. Here, we simultaneously knockout out these two Ca2+ influx channels in the mouse to explore the effects on Ca2+ homeostasis. We examined fertility rates, development, and morphological defects that arose from the double null pups. Next, we investigated the consequences on Ca2+ store content in immature and mature oocytes and eggs. We also examined the effects on fertilization-induced Ca2+ oscillations in response to in vitro fertilization and PLCz cRNA microinjection. We found that female mice null for these channels display drastic subfertility compared to the single knockout mice for these channels. Additionally, the Ca2+ store content is significantly diminished in double knockout eggs versus controls, as was the frequency of the fertilization-induced Ca2+ oscillations. These results suggest that these channels play a crucial role in Ca2+ influx during maturation and contribute to maintain Ca2+ oscillations post-fertilization. These null oocytes and eggs will be an important tool to perform electrophysiological studies to accurately measure the native current(s) of a specific channel(s) in eggs, and to identify the channel(s) that mediate Ca2+ during fertilization.