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<p>During the breeding season Zebra finch, Taeniopygia guttata, females develops a brood patch on the ventral surface which facilitates heat exchange between the incubating bird and the egg. The brood patch has to be sensitive to changes in temperature, so that the eggs can be kept at an optimal temperature for embryo development. If the egg temperature drops it has to be re-warmed. Mild cooling of the brood patch has been shown to cause cold induced vasodilation, but the responsible mechanism for this is not known. In this study we investigated if known thermoreceptors, TRPV3 and TRPV4, could be involved in the alteration of blood flow. To activate TRPV3 and TRPV4 two agonists, carvacrol and 4α-PDD respectively, were applied on the brood patch. Changes in skin temperature and vascularity were then examined. The results obtained did not reveal any changes in the vascularity. Temperature changes in the skin that could be caused by an alteration in blood flow did not significantly change either. Still, a role of these channels in the brood patch cannot be excluded.</p>

During the breeding season Zebra finch, Taeniopygia guttata, females develops a brood patch on the ventral surface which facilitates heat exchange between the incubating bird and the egg. The brood patch has to be sensitive to changes in temperature, so that the eggs can be kept at an optimal temperature for embryo development. If the egg temperature drops it has to be re-warmed. Mild cooling of the brood patch has been shown to cause cold induced vasodilation, but the responsible mechanism for this is not known. In this study we investigated if known thermoreceptors, TRPV3 and TRPV4, could be involved in the alteration of blood flow. To activate TRPV3 and TRPV4 two agonists, carvacrol and 4α-PDD respectively, were applied on the brood patch. Changes in skin temperature and vascularity were then examined. The results obtained did not reveal any changes in the vascularity. Temperature changes in the skin that could be caused by an alteration in blood flow did not significantly change either. Still, a role of these channels in the brood patch cannot be excluded.

Orientadora: Profa. Dra.Maria Camila Almeida / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Neurociência e Cognição, 2014. / Diante da influência da temperatura sobre processos fisiológicos, fisiopatológicos e psicológicos (comportamentais), o presente estudo visou estudar como a temperatura ambiente (Ta) influencia o comportamento termorregulatório e social de ratos, bem como estudar o envolvimento dos canais sensíveis ao calor, TRPV3, nestes processos. O presente estudo teve como objetivo testar os efeitos da exposição à diferentes temperaturas ambientes (Tas) na interação social e comportamento termorregulatório (grooming e escolha entre duas Tas) em ratos, bem como a influência dos canais termo-TRP sobre estas respostas. Os animais foram expostos a 18, 22, 26, 29 e 32°C, de Ta e foram observados a interação social e o grooming (utilizada como um índice de comportamento de termorregulação). A 32°C, os animais apresentaram um aumento significativo no tempo gasto em grooming, sem diferença nas interações sociais. O tratamento tópico com cânfora, um agonista TRPV3 (receptor calor), a uma Ta de 26ºC levou a um aumento no tempo gasto em grooming e diminuição do tempo gasto em interação social. Nas Tas mais frias (18 e 22°C), a estimulação química do TRPV3 com cânfora produziu respostas semelhantes ao observado a 26ºC de Ta. O grooming induzido pelo calor e pela cânfora foram bloqueados pelo antagonista não seletivo de canais TRPV, vermelho de rutênio (RR). Para excluir a participação de TRPV4 (outro receptor calor) nestas respostas, os animais foram tratados com antagonista seletivo do TRPV4, RN1734, que por sua vez, não afetou os efeitos do calor no grooming e na interação social. A temperatura corporal (Tc) não foi significativamente alterada pela cânfora, mas os animais apresentaram comportamente termorregulatório de preferência por Tas mais frias após tratamento com cânfora. Não houve diferença significativa na temperatura da pele (Tp) entre os diferentes estímulos térmicos (exposição ao calor) e químico (tratamento com cânfora) indicando que o calor e a cânfora induzem comportamento de grooming termorregulatório e procura por frio independentemente de mudanças de temperatura da pele e Tc, mas possivelmente dependente da percepção do estímulo seja ele térmico (calor) ou químico (cânfora). O canal TRPV3 é o principal candidato envolvido na percepção destes estímulos.

Die Ionenkanäle TRPV2, TRPV3 und TRPV4 sind an diversen physiologischen und pathologischen Vorgängen beteiligt, wodurch sie zu einer potentiellen pharmakologischen Zielstruktur werden. Zur Identifikation von Modulatoren mit einer erwünschten Wirkung an diesen Zielstrukturen, hat sich das Screening von Substanzbibliotheken bewährt, sodass auch wir auf diese Methode zurückgriffen. Die Substanzbibliothek Spectrum Collection umfasst neben 800 Naturstoffen und 160 Toxinen auch 1040 zugelassene oder klinisch geprüfte Medikamente, welche den Vorteil bieten, dass bereits Daten zur Pharmakokinetik und -dynamik vorhanden sind. Für die Untersuchungen entstanden mittels Transfektion murine TRPV2-, TRPV3- und TRPV4-über¬exprimierende humane embryonale Nierenzelllinien (HEK293-Zellen). In die Parentalzelllinie wurden Vektoren eingebracht, welche neben einer für das jeweilige Kanalprotein codierenden Sequenz u.a. auch einen CFP oder YFP Tag aufwiesen. Diese Markierung ermöglichte eine Kontrolle der Expression und der subzellulären Lokalisation. Das Screening der Spectrum Collection lieferte 61 (TRPV2), 68 (TRPV3) und 28 (TRPV4) Substanzen mit aktivierendem bzw. inhibitorischem Effekt. Im Anschluss an das Primärscreening war die Durchführung eines Sekundärscreenings notwendig. Am Ende dieses Selektionsprozesses standen Alverincitrat, Valdecoxib und Maprotilin. Es folgten weitere Untersuchungen zur Selektivität innerhalb der TRPV-Subfamilie. Alverincitrat ist ein nichtatropinerges Relaxans der glatten Muskulatur, welches in Großbritannien als Spasmolytikum u.a. zur Behandlung des Reizdarmsyndroms sowie der Dysmenorrhoe zugelassen ist. Alverincitrat zeigte einen blockierenden Effekt auf TRPV2 und TRPV4. Valdecoxib, welches als COX-2-Hemmer verbreitet als Analgetikum und Antiphlogistikum eingesetzt wird, fiel durch eine Blockierung des TRPV2-vermittelten intrazellulären Calciumionenanstiegs auf. Für Valdecoxib wurde eine halbmaximale inhibitorische Konzentration von 43,5 µM bestimmt. An TRPV3-Ionenkanälen hingegen zeigte sich eine Potenzierung des aktivatorinduzierten [Ca2+]i -Signals durch Valdecoxib. Aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit prüften wir, ob dieser konzentrationsabhängige Effekt auch durch andere COX-2-Hemmer, konkret Deracoxib und Rofecoxib, hervorgerufen werden kann. Für Rofecoxib wurde kein Einfluss auf TRPV3-Ionenkanäle detektiert. Deracoxib führte zu einer im Vergleich zu Valdecoxib sogar noch stärkeren Potenzierung des 2-APB-getriggerten, TRPV3-vermittelten Anstiegs der [Ca2+]i. Als nichtselektiver Monamin-Wiederaufnahme-Hemmer ist das tetrazyklische Anti-depressivum Maprotilin seit ca. 30 Jahren zur Behandlung depressiver Erkrankungen zugelassen. Wir beobachteten eine Inhibierung der GSK1016790A-induzierten TRPV4-Aktivierung durch Maprotilin. Die Ionenkanäle TRPV2, TRPV3 und TRPV4 sind von physiologischer bzw. pathophysiologischer Relevanz für den menschlichen Organismus und stellen somit eine geeignete pharmakologische Zielstruktur dar. Es sind zwar einige teils spezifische Aktivatoren und Blocker für TRPV2, TRPV3 und TRPV4 bekannt, diese sind jedoch bisher nicht zugelassen und damit nicht therapeutisch einsetzbar Neben dem therapeutischen Einsatz könnten die identifizierten Modulatoren auch zum Erstellen von Struktur-Wirkungsbeziehungen genutzt werden, durch die chemische Substrukturen ermittelt werden, welche für gewünschte sowie unerwünschte Wirkungen essentiell sind. Des Weiteren ist ein Einsatz der Modulatoren als zellbiologische Werkzeuge denkbar, wodurch neue Erkenntnisse über die physiologische und pathophysiologische Relevanz von TRPV2, TRPV3 und TRPV4 sowohl auf zellulärer als auch auf systemischer Ebene gewonnen werden könnten.:Inhaltsverzeichnis 1 Abkürzungsverzeichnis 3 1 Einführung 5 1.1 Die Familie der TRP-Ionenkanäle 5 1.2 Die TRPV-Subfamilie 8 1.3 TRPV2 8 1.4 TRPV3 12 1.5 TRPV4 15 2 Aufgabenstellung 20 3 Material und Methoden 21 2.1 Zellkultur 21 2.2 Laser-Scanning-Mikroskopie 22 2.3 Ca2+ -Assays 22 2.4 Spectrum Collection 26 4 Ergebnisse 28 3.1 Subzelluläre Lokalisation von TRPV2, TRPV3 und TRPV4 28 3.2 Funktionelle Expression 29 3.3 Screening der Spectrum Collection 31 3.4 Alverincitrat 36 3.5 Valdecoxib 39 3.6 Maprotilin 44 5 Diskussion 48 4.1 TRPV4 48 4.2 TRPV2 53 4.3 TRPV3 55 4.4 Ausblick 59 6 Zusammenfassung der Arbeit 61 7 Literaturverzeichnis 66 8 Curriculum vitae Fehler! Textmarke nicht definiert. 9 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 79 10 Danksagung 80

Der TRPV3 (transient receptor potential vanilloid 3)-Kanal ist ein nicht-selektiver, Kalzium-permeabler Kationenkanal, der hauptsächlich in epidermalen Keratinozyten exprimiert wird (Peier et al., 2002). Eine genaue Regulierung der Kalzium-Dynamik in der Epidermis der Haut spielt bei der Bildung der Hautbarriere eine entscheidende Rolle, wodurch viele Aspekte der Epidermisfunktion, einschließlich der Proliferation, Differenzierung und Migration der Keratinozyten, kontrolliert werden (Bikle & Mauro, 2014; S. E. Lee & Lee, 2018). Bei näherer Betrachtung des Einflusses des TRPV3-Kanals auf die Hauthomöostase deuten aktuelle Studien darauf hin, dass der TRPV3-vermittelte Einstrom von Kalziumionen in Keratinozyten die Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen und Wachstumsfaktoren induziert (Cheng et al., 2010; Xu et al., 2006). Daher kann jedes Ungleichgewicht in der TRPV3-Aktivität drastische Auswirkungen auf die gesunde Funktion der Haut haben, wobei eine Kanalüberaktivität mit Hyperkeratose und Entzündungen der Haut in Verbindung gebracht werden kann. Diese Störungen der Haut sind unter anderem für Hauterkrankungen wie der atopischen Dermatitis und dem schwerwiegenden Olmsted-Syndrom, das durch gain-of-function-Mutationen des TRPV3-Kanals verursacht wird, charakteristisch (Lin et al., 2012; Yamamoto-Kasai et al., 2013). Darüber hinaus kann eine Kanalunterfunktion mit einer beeinträchtigten Hautregeneration und Wundheilung korreliert werden (Aijima et al., 2015; Miyamoto et al., 2011). Diesbezüglich wurde gezeigt, dass der TRPV3-Kanal mit dem Rezeptor für den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF-Rezeptor) einen Signalkomplex bildet, um die Bildung der Hautbarriere zu regulieren, wobei die Aktivität von TRPV3 wahrscheinlich durch die Aktivierung des EGF-Rezeptors verstärkt wird (Cheng et al., 2010). Der TRPV3-Kanal wird ebenso durch verschiedene natürliche Verbindungen, wie Carvacrol und Thymol, oder durch synthetische Substanzen, wie 2-Aminoethoxy-diphenylborat (2-APB) aktiviert, wobei 2-APB häufig zur Untersuchung der Funktion von TRPV3 in vitro angewendet wird, da es sich hierbei um einen kostengünstigen und relativ potenten TRPV3-Aktivator handelt. 2-APB wirkt jedoch auch auf eine Vielzahl anderer TRP-Kanäle, sodass es schwierig ist, die Effekte, die durch 2-APB in nativen Geweben ausgelöst werden, auf eine Aktivierung des TRPV3-Kanals zurückzuführen (Hinman, Chuang, Bautista, & Julius, 2006; Hu et al., 2004; M. Li, Jiang, & Yue, 2006; Togashi, Inada, & Tominaga, 2008; Vogt-Eisele et al., 2007; Chokshi, Fruasaha, & Kozak, 2012; Lievremont, Bird, & Putney, 2005). Bei der früheren Durchführung eines Wirkstoffscreenings einer ChemBioNet Substanzbibliothek wurde der TRPV3-selektive Inhibitor 26E01 identifiziert (Bischof et al., 2020). Um weitere potente und spezifische TRPV3-Modulatoren zu identifizieren, wurde eine hausinterne Substanzbibliothek bestehend aus 50 chemischen Verbindungen, die im Labor von Thomas Magauer synthetisiert wurden, und die SelleckChem-Substanzbibliothek L1700 bestehend aus 4718 Verbindungen gescreent. In dieser Arbeit ist die Identifizierung, Validierung und erste Anwendung des neuen, potenten, TRPV3-selektiven Aktivators KS0365 beschrieben. Durch die Anwendung dieses neuartigen TRPV3-Aktivators konnte im Rahmen dieser Studie gezeigt werden, dass TRPV3-Aktivatoren den Reepithalisierungsprozess nach einer Verletzung der Haut fördern könnten. Diese Schlussfolgerung ist auf die in dieser Studie festgestellte Beobachtung zurückzuführen, dass infolge der Aktivierung des TRPV3-Kanals mit KS0365 in den Leading-Edges von Keratinozyten und in migrierenden Keratinozyten, die im Rahmen von Migrationsassays am Rande der erzeugten Lücke lokalisiert waren, die stärksten Anstiege der intrazellulären Kalziumionenkonzentration ausgelöst wurden und KS0365 wahrscheinlich aufgrund dieser Effekte eine Beschleunigung der Keratinozytenmigration bewirkte.:Inhaltsverzeichnis 1. Abkürzungsverzeichnis 1 2. Einleitung 5 2.1 Die Funktion von Kalzium in der Haut 5 2.2 Ionenkanäle in Keratinozyten 8 2.3 Der TRPV3-Kanal 10 3. Zielstellung und Methodenwahl 17 4. Materialien und Methoden 21 4.1 Kultivierung immortalisierter Zelllinien 21 4.2 Isolierung primärer Keratinozyten 22 4.3 Erzeugung einer stabilen m308kTRPV3-YFP-Zelllinie 23 4.4 Interne Totalreflexionsfluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie 24 4.5 Small-interfering RNA (siRNA)-vermittelter Knockdown 24 4.7 Wirkstoffscreening 26 4.8 Hit-Validierung durch Erstellung von Konzentrations-Wirkungsbeziehungen 27 4.9 Selektivitätstestung 27 5.0 Analyse von synergistischen Wirkungen von TRPV3-Aktivatoren 27 5.1 Ratiometrisches Kalzium-Imaging 28 5.2 Elektrophysiologische Untersuchungen 29 5.3 Bestimmung der metabolischen Zellaktivität 29 5.4 Zellmigrations-Assays 30 5.5 Kalzium- Imaging mittels interner Totalreflexionsfluoreszenz-Mikroskopie 30 5.6 Daten-Analyse 31 6. Ergebnisse 33 6.1 Wirkstoffscreening und Bestimmung von Konzentrations-Wirkungsbezie- hungen 33 6.2 Selektivitätstestung des neuen TRPV3-Aktivators KS0365 38 6.3 Validierung des siRNA-vermittelten TPRV3-Knockdowns 42 6.4 Kalzium-Imaging in primären Keratinozyten 44 6.5 Elektrophysiologische Untersuchungen 45 6.6. Analyse von synergistischen Wirkungen von TRPV3-Aktivatoren 49 6.7 Evaluierung der Langzeit-Tolerabilität von TRPV3-Modulatoren 50 6.8 Zellmigrations-Assays 53 6.9 Kalzium-Imaging in migrierenden Keratinozyten 58 7.0 Analyse von Kalzium-Signalen in der Leading-Edge von Keratinozyten mittels TIRF-Mikroskopie 60 8. Diskussion und Ausblick 63 9. Zusammenfassung der Arbeit 75 10. Referenzen 79 11. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 95 12. Lebenslauf 96 13. Publikationen 96 14. Wissenschaftliche Poster und Vorträge 96 15. Danksagung 97

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KS0365 activated recombinant and native mouse TRPV3 more potently and with a higher efficacy compared with 2-APB and did not activate TRPV2 or TRPV4 channels. The activation of TRPV3 by KS0365 super-additively accelerated the EGF-induced keratinocyte migration, which was inhibited by the TRP channel blocker ruthenium red or by siRNA-mediated TRPV3 knockdown. Moreover, KS0365 induced strong Ca2+ responses in migrating front cells and in leading edges of keratinocytes.

In mammals, calcium influx is required for oocyte maturation and egg activation, as it supports the persistent calcium oscillations induced by fertilization. These oscillations are required for the initiation of embryo development. The molecular identities of the plasma membrane calcium-permeant channels that underlie calcium influx are not established. Among these channels, Transient Receptor Potential Vanilloid, member 3 (TRPV3) allows divalent cations, namely strontium (Sr2+) and calcium (Ca2+) with high permeability, into cells, and its expression pattern seems to predict an essential role in the initiation of development. Another channel that was identified to be expressed in oocytes/eggs is the low-voltage-activated T-type channel, CaV3.2. However, the ability to accurately probe the expression and function of these channels on Ca2+ homeostasis in mouse eggs is hindered by the lack of specific and known pharmacological agents and antibodies for these channels. Here, we simultaneously knockout out these two Ca2+ influx channels in the mouse to explore the effects on Ca2+ homeostasis. We examined fertility rates, development, and morphological defects that arose from the double null pups. Next, we investigated the consequences on Ca2+ store content in immature and mature oocytes and eggs. We also examined the effects on fertilization-induced Ca2+ oscillations in response to in vitro fertilization and PLCz cRNA microinjection. We found that female mice null for these channels display drastic subfertility compared to the single knockout mice for these channels. Additionally, the Ca2+ store content is significantly diminished in double knockout eggs versus controls, as was the frequency of the fertilization-induced Ca2+ oscillations. These results suggest that these channels play a crucial role in Ca2+ influx during maturation and contribute to maintain Ca2+ oscillations post-fertilization. These null oocytes and eggs will be an important tool to perform electrophysiological studies to accurately measure the native current(s) of a specific channel(s) in eggs, and to identify the channel(s) that mediate Ca2+ during fertilization.

Štěpána Boukalová Mechanisms of activation and modulation of vanilloid TRP channels TRPV1 and TRPV3 are thermosensitive ion channels from the vanilloid subfamily of TRP receptors. TRPV1, which is primarily expressed in nociceptive sensory neurons, is an important transducer of painful stimuli and is also involved in the detection of noxious heat. TRPV3 is expressed mainly in the skin where it regulates proliferation and differentiation of keratinocytes. Similarly to voltage-dependent potassium (Kv) channels, TRP receptors are comprised of four subunits, each with six transmembrane segments (S1-S6). Using mutational approach, we tried to elucidate the role of S1 in TRPV1 functioning. Our results indicate that the extracellular portion of S1 plays a crucial role in TRPV1 gating. TRPV1 channels with a conservative mutation of positively charged residue in this region (R455K substitution) were overactive. However, they were neither activated nor potentiated by low pH; on the contrary, protons stabilized the closed conformation of this mutant channel. Very similar phenotypic properties were found in other TRPV1 mutants with substitution in S4/S5-S5 region and in the pore helix. In Kv channels, extracelular portion of S1 forms a small contact surface with the pore helix, which allows efficient transmission of...