Aquest treball consta d'una part principal, on hem estudiat les causes o factors que intervenen en la nucleomorfogènesi espermàtica de dues espècies de cefalòpodes: el decàpode Sepia officinalis i l'octòpode Octopus vulgaris. També consta d'una segona part que l'exposem en forma d'annex, on hem fet uns experiments concrets sobre l'anàlisi i estructura del gen la proteïna phi0, una proteïna específica de l'espermatozoide que interacciona i organitza el genoma de l'Equinoderm Holothuria tubulosa. Hem fet una reexaminació exhaustiva del procés de condensació de la cromatina i nucleomorfogènesi espermàtica de Sepia officinalis i Octopus vulgaris (Apts. IV.1.2 i IV.2.2 respectivament).Hem estudiat i caracteritzat amb detall les proteïnes de la gònada de Sepia officinalis (Apt. IV.1.2b.4),i també mitjançant la generació d'anticossos específics contra dues d'aquestes proteïnes gonadals, hem dut a terme un estudi immunològic que ens ha permès saber quina és la composició de proteïnes de les diferents estructures que adopta la cromatina espermiogènica. Aquests estudis ens han ajudat a comprendre millor la transició proteica que experimenta nucli de l'espermàtida durant l'espermiogènesi de Sepia officinalis.Per altra banda, amb l'objectiu principal de conèixer la naturalesa del tipus d'unió que hem observat en Octopus vulgaris entre la MNP (Matriu Nuclear Polar) i la cromatina, hem iniciat uns estudis preliminars per estudiar-ne les seves propietats fisico-químiques. (Apt. IV.2.2d)Finalment, en la discussió d'aquesta primera part, fem un anàlisi de quina ha estat l'evolució del nucli espermàtic en els cefalòpodes: Sepia officinalis -> Octopus vulgaris -> Eledone.També, amb l'objectiu de corroborar si la proteïna phi0 d'Holothuria tubulosa té el seu propi gen o bé és resultat d'una modificació post-traduccional del gen de la histona H1, hem analitzat l'ARNm de phi0 mitjançant la tècnica de RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) (Annex I).

La major part del treball està enfocat en l'estudi de les proteïnes nuclears bàsiques espermàtiques, també anomenades protamines.Les protamines són proteïnes que tenen la funció de compactar el DNA espermàtic nuclear per a mantenir-lo en un volum reduït. L'estudi d'aquestes proteïnes ens dóna un idea sobre quins són els minims requeriments per interaccionar amb el DNA, com s'estructura la cromatina espermàtica, etc. Un dels aspectes més interessants és la extraordinària variabilitat evolutiva que presenten. Les protamines són el grup de proteïnes més heterogeni que cumpleixen una mateixa funció.Els resultats de l'estructura primària d'aquestes molècules i el seu estudi tant dins del seu context taxonòmic com biològic, ens dóna un millor coneixement de l'evolució de les proteïnes.CAPÍTOL III.A. Eledone cirrhosaEl grup dels Cefalòpodes presenta fonamentalment dos grans grups: els decàpodes (sèpies i calamars) i els pops.Eledone cirrhosa és un pop que pertany a la família Octopodidae. En aquest primer capítol hem estudiat el procés de nucleomorfogènesi de l'espermatozoide, així com la protamina que s'encarrega de mantenir la forma tan rígida i espiralitzada del nucli. L'aspecte més interessant és l'estadi on l'espermàtida presenta un nucli allargat, amb una cromatina condensada i secció cilíndrica, nucli doblegat diverses vegades, i envoltat per una sèrie de microtúbuls amb una disposició molt estreta vers al nucli. Aquests microtúbuls entren en contracció i exerceixen unes forces en el nucli de tal manera que el posen recte i al mateix temps l'espiralitzen. Destaca la presència d'una estructura que anomenen "complexe periacrosomal" que podria ser un centre de reorganització d'aquests microtúbuls.S'han purificat nuclis espermàtics i s'ha vist que el DNA està compactat per una sola protamina. Aquesta proteïna s'ha purificat i seqüenciat, i s'ha vist que és una proteïna extraordinàriament rica en cisteïna, aminoàcid que forma ponts disulfurs de manera que estabilitza la forma espiral del nucli i el manté rígid.S'han fet experiments de detecció dels ponts disulfur tant en cues com en nuclis espermàtics, mitjançant el marcatge amb MMNA, i s'ha demostrat que són aquests enllaços covalents els que procuren la rigidesa al nucli.CAPÍTOL III.B. Octopus vulgarisQuan es va estudiar el contingut proteic nuclear d' Eledone cirrhosa, només es coneixien, a més a més, les protamines de les sèpies i calamars. Així doncs, varem decidir estudiar el què passava en un altre pop, Octopus vulgaris, espècie que pertanya a la mateixa família que l'anterior.Tot i la pròxima posició taxonòmica, les protamines d'.O. vulgaris presenten una estructura primària més propera als decàpodes que a E. cirrhosa.A l'igual que ocorre amb els decàpodes, les protamines d' O. vulgaris provenen de molècules precursores, arribant-se a trobar restes de precursors en l'espermatozoide madur. A més a més, les protamines d'aquest pop comparteixen més similarituds amb les protamines de les sèpies i calamars que amb l'altre pop, particularment l'elevada basicitat representada per només l'arginina i la seva organització en clusters. Entre els resultats obtinguts en aquesta part és important resaltar el fet de l'enorme simplicitat que la protamina principal d' O. vulgaris presenta, constituïda per només tres tipus d'aminoàcids diferents, i organitzada en clusters del tipus (GRn)m, proteïna que es troba fosforilada en la gònada i es defosforila en l'epidídim.Comparació entre les protamines dels CefalòpodesHem comparat les protamines dels cefalòpodes conegudes per així millor poder entendre el tipus d'evolució que han seguit. Suggerim tres tipus de canvis de tipus evolutiu per les protamines dels cefalòpodes:- Petits canvis en la molècula (mutacions puntuals, petits indels, etc). Aquests canvis s'expliquen en les protamines dels decàpodes, on es mostra que totes dues protamines són homòlogues, presentant un orígen comú, on el gen ancestral es va duplicar i posteriorment cada còpia es va modificar experimentant petites mutacions a nivell de proteïna.- Canvis importants que continuen respectant el model d'organització de la molècula. Aquest canvis es mostren quan es comparen les protamines dels decàpodes amb les protamines d'O. vulgaris. Encara que no es pot garantir una homologia (origen comú) per totes elles, sí que presenten una organització molt similar.- Canvis repentins que afecten a tota la protamina i per tant canvien al complert el model molecular d'organització. És el que s'ha pogut observar en la divergència de la protamina d'Eledone respecte les protamines d'Octopus i respecte les protamines dels decàpodes. Aquesta divergència està associada amb canvis a diferents nivells, corn la forma nuclear, l'estructura i forma de l'espermatozoide, el tipus de fecundació, etc. La protamina d'E. cirrhosa no és homòloga amb la resta de protamines dels cefalòpodes. És un model nou de protamina que ha aparegut simultàniament amb un nou model d'espermatozoide.CAPÍTOL III.C. Murex brandarisEn aquest treball hem completat l'estudi de caracterització de les protamines del cenogastròpode Murex brandaris , i d'aquesta manera hem pogut fer una comparació més exhaustiva pel que fa referència a les protamines dels arqueogastròpodes, mol.luscs amb fecundació externa (vers la fecundació interna dels cenogastròpodes).CAPÍTOL III.D. Subordre GasterosteoideiEl grup de peixos ossis Gasterosteiformes representa un grup que ha sofert una ràpida evolució. L'espècie ancestral d'aquest grup era marina, i a causa d'una desglaciació soferta a finals del Pleistocè es van formar bona part dels llacs de la Columbia Britànica (Canadà), donant-se una invasió d'algunes formes marines cap aquests nous nitxos ecològics lliures, espècies que van sofrir una ràpida especiació/ adaptació.Hem pogut comparar diferents poblacions que pertanyen a una mateixa espècie, diferents espècies que pertanyen a un mateix gènere, diferents gèneres que pertanyen a una mateixa família, i diferents famílies que pertanyen a un mateix subordre, i això ens ha permés arribar a la conclusió de que l'ancestre de la protamina dels Gasterosteiformes podria tenir un origen comú a la protamina ancestral de l'ordre Perciformes, protamina típica de peixos ossis.CAPÍTOL III.E. Dicentrarchus labraxEn aquest darrer apartat hem fet un estudi preliminar de l'activitat descondensadora present en l'oòcit de l'espècie D. labrax front l'espermatozoide de la mateixa espècie un cop s'ha donat la fecundació.Els resultats mostren que existeix una activitat de desplaçament de la protamina nuclear espermàtica quan es fan incubacions amb extractes d'oòcits, inflant-se la cromatina espermàtica. Aquesta activitat és possiblement atribuïble a diverses proteïnes presents en l'oòcit, i no només a una sola (nucleoplasmina). Aquestes proteïnes, però, s'han de caracteritzar i s'ha de fer un estudi més profund del tema.CAPÍTOL IV. DISCUSSIÓProposem que les proteïnes espermàtiques bàsiques (protamines) s'han de considerar almenys, dintre de tres nivells d'organització diferents, on la selecció natural actuaria sobre cadascun d'ells, impedint, afavorint o provocant diferents tipus de canvis. Aquests tres nivells d'organització serien:- Nivell molecular: interacció DNA-SNBP. Aquest és el nivell més simple on sempre s'han estudiat les protamines a nivell evolutiu. Petits canvis es donen per millorar la interacció de la protamina amb el DNA, canvis que poden ser neutres. Quan es comparen les estructures primàries que han sofert una divergència evolutiva, es pot establir una relació d'homologia.- Nucli espermàtic considerat com a una identitat. De vegades ocorre que entre dues espècies properes es dóna un canvi en la forma del nucli espermàtic. En aquest cas és el nucli el que rep la pressió de la selección natural, pressió que afecta indirectament a la protamina present en e1 nucli. La protamina canvia per tal de permetre la nova forma nuclear.- L'espermatozoide senser com a una unitat irreductible. El cas d'E. cirrhosa ens dóna un exemple d'aquest nivell. L'aparició, disposició, activitat i destrucció dels microtúbuls que actuen al llarg de l'espermiogènesi d'aqueste espècie, juntament amb d'altres processos, ha de seguir un control coordinat juntament amb la síntesi d'una protamina, la seva entrada al nucli, interacció amb el DNA i el control final de la formación dels enllaços disulfur. Cadascun de tots aquests aconteixements porta a l'aparició d'un tipus nou d'espermatozoide, processos que només tenen sentit si es donen en el seu context biològic. La selecció natural ha actuat sobre l'espermatozoide sencer, sobre tota la cèl.lula sensera com si fos un únic nivell d'organització.Analitzem també cinc mecanismes principals que permeten els canvis en la evolució de les protamines, i finalment discutim alguns casos particulars de protamines riques en cisteïna i protamines que provenen de molècules precursores. / The main objective of our work has been to examine some protamines which are special cases to study for the better understanding of the chemist and the ways which protamines have evolved.The study of the spermiogenesis and the protamine of the octopus "Eledone cirhosa" has allowed us to understand some of the cellular processes that module the final shape of the sperm nucleus, and the need of a disteine rich protamine. The protamines of another octopus have also been studied ("Octopus vulgaris"), in order to establish the main characteristics of the evolved changes in the protamine model of the cephalopod molluscs.The final primary structure of the protamines of "Murex brandaris" cenogastropod has been established. "M. brandaris" protamines apparently are not homologous to their ancestral protamines (those of Archaeogastropods), and may have arisen from the multiplication of an ancestral minigen. The protamines are synthesized as precursors, which suffer a large number of small N-terminus deletions that take place at the same time as the chromatin condensation process.On the other hand, we have studied a group of bony fishes that has had a very fast evolution: "Gasterosteoidei" suborder. We have chosen this group of fish as well as the geographical region (British Columbia, Canada) for the following reasons: The ancestral species of "Gasterosteus" were exclusively sea forms and remained invariable for 5-6 millions years.However, at the end of the Pliocene an invasion took place into the recently formed lakes. When sea forms invaded the lakes, they found a high variety of free ecological niches that caused the species "G. aculeatus" to evolve quickly. Subsequently, in a short period of time, a hundred new species appeared. Due to the fact that we are in front of a group of quick evolution and because of the knowledge of bony fish protamines, we decided to study the primary structure of 4 protamines belonging to different populations.To finish, we have also studied the removing activity of the sperm chromatin by "Dicentrarchus labrax" oocytes, being a preliminary study of the descondensating activity of the sperm chromatin present inside the oocytes of a species not studied at present.