Aquest treball consta d'una part principal, on hem estudiat les causes o factors que intervenen en la nucleomorfogènesi espermàtica de dues espècies de cefalòpodes: el decàpode Sepia officinalis i l'octòpode Octopus vulgaris. També consta d'una segona part que l'exposem en forma d'annex, on hem fet uns experiments concrets sobre l'anàlisi i estructura del gen la proteïna phi0, una proteïna específica de l'espermatozoide que interacciona i organitza el genoma de l'Equinoderm Holothuria tubulosa. Hem fet una reexaminació exhaustiva del procés de condensació de la cromatina i nucleomorfogènesi espermàtica de Sepia officinalis i Octopus vulgaris (Apts. IV.1.2 i IV.2.2 respectivament).Hem estudiat i caracteritzat amb detall les proteïnes de la gònada de Sepia officinalis (Apt. IV.1.2b.4),i també mitjançant la generació d'anticossos específics contra dues d'aquestes proteïnes gonadals, hem dut a terme un estudi immunològic que ens ha permès saber quina és la composició de proteïnes de les diferents estructures que adopta la cromatina espermiogènica. Aquests estudis ens han ajudat a comprendre millor la transició proteica que experimenta nucli de l'espermàtida durant l'espermiogènesi de Sepia officinalis.Per altra banda, amb l'objectiu principal de conèixer la naturalesa del tipus d'unió que hem observat en Octopus vulgaris entre la MNP (Matriu Nuclear Polar) i la cromatina, hem iniciat uns estudis preliminars per estudiar-ne les seves propietats fisico-químiques. (Apt. IV.2.2d)Finalment, en la discussió d'aquesta primera part, fem un anàlisi de quina ha estat l'evolució del nucli espermàtic en els cefalòpodes: Sepia officinalis -> Octopus vulgaris -> Eledone.També, amb l'objectiu de corroborar si la proteïna phi0 d'Holothuria tubulosa té el seu propi gen o bé és resultat d'una modificació post-traduccional del gen de la histona H1, hem analitzat l'ARNm de phi0 mitjançant la tècnica de RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) (Annex I).

The study of chromatin structure in several simple sperm models of increasing complexity was performed. Species demonstrating different types of sperm nuclear protein transitions and structural changes in spermatic chromatin during spermiogenesis were selected as models for comparison: "H" (non-histone proteins are removed), "H->P" (protamine displaces histones), and "H->Pp->P" (precursor protamine displaces histones, and subsequently is converted into the mature protamine). This study has an evolutionary focus, in which a primitive sperm model is identified, from which more complex models may have risen during evolution. The final sperm characteristics achieved are considered to be caused by the changes the immature sperm cell undergoes during the process of spermiogenesis, and are correlated to an adaptation to the fertilization biology of each species. A broader understanding of the variety of sperm shapes, their chemical variability, and the spermatic chromatin condensation patterns pertaining to species of these simple spermiogenic models has been achieved. In this study, the diversity in sperm characteristics is extrapolated to the function the sperm cell has to pass on its genetic material to achieve fertilization of the egg of its own species.For three different models using four marine species, protein transitions, chromatin condensation, and acetylation patterns were described during spermiogeneis. Specifically, changes in chromatin architecture and its protein complement was extensively studied using mainly transmission electron microscopy, inmunocytochemistry using anti-histone, anti-precursor protamine, and anti-acetyl group antibodies, as well as high resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and western blotting. A model of specialized sperm chromatin (crustacean type) has been included in this study, since for decades this type of chromatin has remained poorly understood. Crustacean type sperm, once believed to have nuclei void of basic DNA-associated proteins, was found to contain histones, and is considered a derivation of the "H" model. Three species of brachyuran crabs from two different families were used to compositionally and ultrastructurally study this unusually decondensed mature sperm chromatin. Characterization of the histones from these sperm using HPLC and amino acid analysis confirm that the basic proteins extracted from sperm of these crabs are indeed typical and canonical histones, though some appear modified by post-translational modifications such as acetylation, which has never before been described in mature sperm. Additionally, in Maja brachydactyla, histones H3 and H2B appear in stoichiometric amounts different to what would be found in somatic chromatin. By performing micrococcal nuclease digestions, the presence of nucleosomes (or nucleosome-like particles) in the sperm of these species was confirmed, and demonstrated that histones are found interacting with the sperm DNA. Further, the histone/DNA ratio was evaluated in two Cancer species, and it was determined that these sperm only contain slightly over half the amount of basic protein per DNA unit compared to other sperm types. These results concerning the composition of the crustacean-type sperm chromatin help to explain its decondensed nature.

La finalitat d'aquesta tesi ha estat la d'estudiar les funcions alternatives de la proteïna transportadora d'esteroids sexuals (SHBG/ABP) a l'espermatogènesi i al càncer de pròstata. 1) A l'espermatogènesi s'ha treballat amb dos models diferents, un és el ratolí transgènic que sobreexpressa la SHBG/ABP de rata i l'altre el ratolí transgènic que sobreexpressa la SHBG/ABP humana.a) Ratolí transgènic per la SHBG/ABP de rata. La sobreexpressió del transgen de rata a nivell del testicle provoca un bloqueig parcial de la primera divisió meiòtica i un augment de la mort cel.lular programada o apoptosi de les cèl.lules germinals, especificament d'espermatocits primaris i cèl.lules en meiosi. Aquestes cèl.lules apoptòtiques sobreexpressen el mRNA i la proteïna del receptor d'estrògens beta. La proteïna, a més a més, s'acumula a nivell del citoplasma d'aquestes cèl.lules apoptòtiques.b) Ratolí transgènic per la SHBG/ABP humana. El trànscrit que s'expressa a nivell del testicle de la linia shbg11 prové del promotor alternatiu i conté l'exó alternatiu. A més a més, aquest trànscrit l'expressen les cèl.lules germinals . La proteïna SHBG/ABP humana es troba a nivell de l'acrosoma de les cèl.lules germinals durant tota la fase d'elongació de l'espermatogènesi, i a nivell de l'acrosoma dels espermatozous epididimaris.2) Al càncer de pròstata s'ha treballat amb diferents linies cel.lulars de pròstata i amb mostres de pacients amb càncer de pròstata.a) Linies cel.lulars de càncer de pròstata. S'ha treballat amb dues linies cel.lulars tumorals com són les PC3 i les LNCaP i dues linies cel.lulars normals com són les CAHVP10 i les PZHVP7. Les linies PC3 i LNCaP sobreexpressen 3 trànscrits que codifiquen per a la SHBG/ABP humana. El trànscrit majoritari dona lloc a la proteïna secretada, mentres que els dos trànscrits que falten els exons 6 i 6-7 respectivament, donen lloc a una proteïna intracel.lular. La diferència entre la linia PC3 (androgen-independent) i la linia LNCaP (androgen-depenent) és que la linia PC3 expressa la isoforma cx del receptor de estrògens beta.b) Pacients afectats de càncer de pròstata. En 4 dels 6 pacients analitzats s'expressa la SHBG/ABP humana, en 3 d'ells s'expressa el receptor d'estrògens i en tots es sobreexpressa la P450 aromatasa. La proteïna SHBG/ABP s'acumula a l'interior de les cèl.lules epitelials de les glandules tumorals en les seccions prostàtiques dels pacients analitzats. / The aim of this thesis is to study the alternative funcions of the sex hormone-binding globulin / androgen-binding protein (SHBG/ABP) during the espermatogenesis and prostate cancer.1) In the study of the espermatogenesis we have used two different models: the transgenic mice overexpressing the rat SHBG/ABP, and the transgenic mice overexpressing the human SHBG/ABP. a) Transgenic mice overexpressing rat SHBG/ABP. The overexpression of rat SHBG/ABP in the testis induces a parcial arrest of the first meiotic division and an increase of germ cell apoptosis, involving specifically primary spermatocytes and cells at metaphase. The apoptotic cells are overexpressing the mRNA and the protein for the estrogen receptor beta, and the protein acumalates in the citoplasm of this apoptotic cells. b) Transgenic mice overexpressing human SHBG/ABP. The shbg11 mouse line overexpress the mRNA for the human SHBG/ABP in the testis, and this mRNA contains the alternative exon 1 (exon A). The human mRNA is expressed by germ cells, and the protein is located in the acrosome during all the elongation sattges of spermatogenesis. 2) In the sutdy of the prostate cancer we have used prostatic tumor cell lines (PC3 and LNCaP) and prostatic normal cell lines (CAHVP10 and PZHVP7) and samples from patients with prostate cancer.a) Prostate cell lines. The tomurogenic cell lines PC3 and LNCaP overexpress three human SHBG/ABP transcripts, most abundant transcript produce secreted human SHBG/ABP protein. The other two transcripts lacking exon 6 and exon 6-7, produce intracelular human SHBG/ABP protein. The main difference between the PC3 cell line (androgen-independent) and the LNCaP cell line (androgen-dependent) is that PC3 cells are express the cx isoform of the estrogen receptor beta. b) Patients with prostate cancer. Four of the six patients analized express human SHBG/ABP mRNA. Three of them co-express the estrogen receptor beta and all of them express the P450 aromatase.The human SHBG/ABP protein is located in the epitelial cells from the tumoral glands in all the prostate sections analized from the patients with prostate cancer.

Per a que el desenvolupament i la maduració testicular tinguin lloc d'una manera correcta, es fa necessari que existeixi un equilibri entre els fenomens de proliferació, diferenciació i mort cel.lular. Tot i que desde fa uns anys es coneix la importància de l'apoptosi en l'eliminació de les cèl.lules germinals anòmales durant l'espermatogènesi dels mamifers, incloent l'home, els mecanismes i gens que la regulen han estat poc estudiats. El desenvolupament d'animals transgènics ha permès conèixer la participació d'alguns gens en la meiosi com són Bax, PMS2, CREM, Mhl1, ATM i HSP70-2. El fenotip comú que presenten aquests animals consisteix en aturada espermatogènica durant la primera divisió meiòtica, inducció d'apoptosi en cèl.lules pre-meiòtiques o meiòtiques i aparició de cèl.lules germinals multinucleades, donant lloc a una disminució de la fertilitat. Amb la finalitat d'identificar gens reguladors de l'apoptosi durant l'espermatogènesi en la rata així com l'estudi de la relevància del mecanisme d'apoptosi i de l'expressió dels gens que la regulen en els problemes de fertilitat en els humans, es van posar a punt dos models d'inducció d'apoptosi en les cèl.lules germinals que la actuen mitjançant mecanismes diferents. Un model de deprivació hormonal, mitjançant l'administració de sulfonat d'etil dimetà (EDS), un tòxic de les cèl.lules de Leydig, que provoca la mort d'aquestes cèl.lules, la qual cosa condueix a la desaparició dels andrògens en el testicle, donant lloc a la mort per apoptosi de les cèl.lules germinals. Un model de toxicitat, mitjançant l'administració d'àcid metoxiacètic (MAA), un tòxic dels espermatocits primaris en fase de paquitè, que provoca la seva mort per apoptosi. Dels resultats obtinguts en el present estudi es desprén que, els membres de la familia de Bcl-2 (Bax i Bcl-2) i la Caspasa-3 participen activament en l'apoptosi induïda en els dos models, co-existint en el mateix estadi tubular i presentant un curs temporal similar. El tractament amb MAA indueix canvis en l'expressió del mRNA i les proteïnes AR, ABP i ERb, que es manifesten en forma de diferències en la distribució en funció de l'estadi del cicle cel.lular en el cas de les dues primeres, i en un notable augment d'expressió a nivell de les cèl.lules germinals en el cas de la tercera. Finalment, s'han aïllat dos nous gens que participen en l'apoptosi induïda a les cèl.lules germinals, Rdes i HARP. Rdes és un homòleg d'un grup de desaturases involucrades en processos meiòtics durant l'espermatogènesi, i HARP és un nou membre de la familia de factors de creixement HDGF, alguns dels quals han estat igualment involucrats en processos meiòtics durant l'espermatogènesi. / To reach a correct testicular development and maduration, it is necessary a balance between proliferation, differentiation and cell death. Since severals years ago it is known, that apoptosis is important to eliminate damaged cells during mammal spermatogenesis, including humans. However, the mechanisms and genes that regulate apoptosis during spermatogenesis are poor understood. Transgenic animals have proven to be useful tool for studying meiotic regulation in mammals. Among genes whose targeted disruption causes meiotic arrest in transgenic animals are Bax, PMS2, CREM, Mhl1, ATM and HSP70-2. Most of these animals show a common phenotype that includes, meiotic arrest, apoptotic induction in pre-meiotic or meiotic cells and multinucleated cells. In order to identify genes regulating apoptosis during spermatogenesis in the rat, as well as study of the apoptotic mechanisms involved, we used two different models of induction of apoptosis in rat germ cells, each model acting by different ways. One model of hormonal deprivation, using ethane dimethane sulphonate (EDS) as a toxicant, which induces death of Leydig cells and androgen withdrawal, that leads to apoptotic germ cell. One model of toxicity, using methoxyacetic acid (MAA) as a toxicant, which induces death of pachytene spermatocytes by apoptosis. The results obtained in this study confirm the active participation of the Bcl-2 family members (Bax and Bcl-2) and Caspasse-3 in the apoptosis induced in both models, co-existing in the same stage of the seminiferous tubule and presenting a similar time course. MAA treatment induces changes in the expression of AR and ABP mRNAs and proteins, showed by the differences in the seminiferous tubule stage distribution. MAA treatment also induces an elevation in the mRNA and protein levels of ERb in germ cells. Finally, we have isolated two new genes which participate in the germ cell induced apoptosis, Rdes and HARP. Rdes is a homologous of a desaturases group involved in meiotic processes during spermatogenesis, and HARP is a new member of the HDGF family, some of those have been involved in meiotic processes during spermatogenesis.

Para investigar los cambios de composición y estructura de la cromativa en las distintas fases de la espermatogénesis, se han puesto a punto para el testículo de gallo las técnicas de obtención de suspensiones celulares por disociación tríptica del tejido y separación de las células a gravedad unidad. Los resultados obtenidos indican que a medida que progresa la espermiogénesis se detectan cantidades crecientes de protamina y decrecientes de histonas. Coincidiendo con esta transición nucleohistona-nucleoprotamina, las histonas resultan hieracetiladas y se da un incremento en la biosíntesis y niveles de poliaminas. Experimentos "in vitro" indican que la protamina galina es capaz de desensamblar totalmente a las histonas de nucleosomas a una relación arg./ nucleótido dentro del rango fisiológico. A través de clonar y secuencias parte del gen de la protamina galina, se ha determinado la secuencia de la región 3' del gen y parte de la secuencia de la región C-terminal codificante. Existen 2 poblaciones de ARN mensajero codificante para la galina (460 y 480 bases aproximadamente) siendo la población de 460 bases mayoritaria en las espermátidas alargadas.

El present treball analitza al microscopi òptic i al microscopi electrònic de transmissió el testicle de Sus domesticus (raça Landrace - varietat anglesa) a partir de mascles reproductors porcins adults i sans. L'objectiu principal de tots els centres d'Inseminació Artificial Porcina i de les Explotacions de Selecció i Multiplicació Porcina és garantir una excel·lent qualitat espermàtica al llarg de la vida reproductiva útil d'un mascle reproductor porcí. Així doncs, un millor coneixement dels patrons estructural i ultraestructural normals del testicle permetrà diagnosticar amb facilitat quina ha estat l'estructura o funció testicular afectada quan s'observa una disminució de la qualitat del semen. Les anàlisis seminals i hormonals són certament crucials en la valoració d'aquests mascles, però, no són totalment informatives de les alteracions testiculars, ja que és necessari conèixer l'organització microscòpica.Diversos estudis sobre testicle han demostrat que els marcadors més sensibles per a l'avaluació de la funció testicular són els següents: (1) la grandària testicular, (2) el gruix i l'organització de la càpsula testicular, (3) el percentatge de túbuls seminífers i de teixit intersticial en el parènquima testicular, (4) el diàmetre dels túbuls seminífers, (5) l'alçada i la composició de cèl·lules germinals de l'epiteli seminífer, (6) el gruix i l'organització de la làmina pròpia i, (7) la morfologia i la grandària de les cèl·lules de Leydig. El primer objectiu concret del present estudi ha estat, per tant, caracteritzar tots aquests paràmetres testiculars en mascles porcins sans i adults. L'organització estructural del testicle i les mesures quantitatives utilitzades com a marcadors no mostren diferències significatives ni entres els mascles porcins (P > 0,01), ni entre el testicle dret i l'esquerre (P > 0,01). Els testicles, de 330,80  16,99 g de pes, estan envoltats per una càpsula, de 2.375,13  246,68 m de gruix, la qual es divideix en tres capes: la túnica vaginalis constitueix l'1,82  0,78 % de la càpsula i està composta per una capa mesotelial externa i una capa interna de teixit conjuntiu dens; la túnica albuginea representa el 37,31  3,27 % i és de teixit conjuntiu dens i, la túnica vasculosa constitueix el 64,24 4,40 % i és de teixit conjuntiu lax. En el parènquima testicular els túbuls seminífers i el teixit intersticial representen el 72,44  2,12 % i el 27,46  2,12 %, respectivament. Els túbuls seminífers, de 226,23  18,08 m de diàmetre, es troben fortament recargolats i empaquetats, i estan compostos per la làmina pròpia i l'epiteli seminífer. La làmina pròpia, de 4-4,5 m de gruix, està formada per la làmina basal i dues capes de cèl·lules peritubulars. L'epiteli seminífer, amb una alçada mitjana de 66,11  10,62 m, és columnar i estratificat amb cèl·lules de Sertoli i diferents generacions d'espermatogònies, espermatòcits i espermàtides. El teixit intersticial és un teixit conjuntiu lax amb abundants cèl·lules de Leydig polièdriques fortament empaquetades (ca. 15 x 12 m).El segon objectiu concret d'aquest estudi ha estat estudiar des del punt de vista morfològic i morfomètric (alçada, longitud, freqüència relativa d'aparició i durada) els estadis del cicle de l'epiteli seminífer en els mascles porcins de la raça Landrace (varietat anglesa), classificats d'acord amb el mètode de la morfologia tubular. Els estadis premeiòtics ( I, II i III) ocupen el 31,9 % del cicle espermatogènic i es caracteritzen, principalment, per la presència de cèl·lules en les fase inicials de la meiosi I. Les primeres etapes de la meiosi I no afecten els paràmetres morfomètrics de l'epiteli seminífer ja que els valors obtinguts per l'alçada de l'epiteli seminífer, la freqüència relativa, la longitud i la durada d'aquests estadis són molt variables. Els estadis meiòtics (IV i V) representen el 16,4 % del cicle espermatogènic i estan constituïts, principlament, per cèl·lules en un estat avançat de la meiosi I i /o cèl·lules en meiosi II. Les últimes fases de la meiosi I i també de la meiosi II tenen lloc ràpidament, la qual cosa resulta en una baixa freqüència relativa d'aparició i, per tant, en una baixa durada dels estadis meiòtics. Els estadis postmeiòtics (VI, VII i VIII) ocupen el 50,6 % del cicle espermatogènic. L'esdeveniment més important que té lloc en aquests estadis és la fase de maduració de l'espermiogènesi. En la fase de maduració, les espermàtides experimenten diverses modificacions morfològiques i estructurals que donen lloc, finalment, als espermatozoides. La complexitat d'aquests processos fa que els estadis postmeiòtics presentin valors més grans de freqüència relativa, longitud i durada.El tercer objectiu concret d'aquest treball ha estat descriure a nivell ultraestructural el procés d'espermiogènesi, i relacionar les transformacions que experimenten les espermàtides en fase d'elongació amb els canvis ultraestructurals que tenen lloc en les diferents cèl·lules que constitueixen el testicle (cèl·lules germinals, de Sertoli i de Leydig, principalment). L'espermiogènesi del mascle porcí de la raça Landrace (varietat anglesa) s'ha dividit en 9 passos que vénen definits per 9 tipus diferents d'espermàtides. Al llarg de l'espermiogènesi no s'observen diferències ultraestructurals significatives (P > 0,01) ni entre els mascles porcins ni entre el testicle esquerre i dret en les cèl·lules que constitueixen el testicle. / The present study describes the structure and ultrastructure of the Sus domesticus testis (Landrace breed -british variety) from healthy adults boars. The main goal of the whole of Porcine Artifitial Insemination Centres and of the Porcine Livestocks is to guarantee an excellent spermatic quality along the boar reproductive life. Therefore, a better knowlegment of the normal structural and ultrastructural patterns of the testis will improve the prognosis of subfertility when a low spermatic quality is observed. Both seminal and hormonal analysis are certainly crucial in the assessment of these males, but it is also necessary to know the microscopic organization.Several studies have demonstrated that the most sensitive markers of impaired function are: (1) the testicular size, (2) the thickness and organization of the testicular capsule, (3) the percentage of seminiferous tubules and interstitial tissue in the testicular parenchyma, (4) the diameter of seminiferous tubules, (5) the height and germ cell composition of the seminiferous epithelium, (6) the thickness and organization of the lamina propria, and (7) the Leydig cell size and morphology. The first aim of this study has been to characterize all these testicular parameters in healthy adults boars. The structural organization of the testis and quantitative measures used as markers did not differ significantly either among boars (P > 0.01), or between left and right testes (P > 0.01). Testes, of 330.80  16.99 g weight, were surrounded by a capsule, of 2,375.13  246.68 m thick, divided into three layers: the tunica vaginalis constituted 1.82  0.78% of the capsule and was composed by an outer mesothelial layer and an inner dense connective tissue layer; the tunica albuginea represented 37.31  3.27% and was of dense connective tissue and the tunica vasculosa constituted 64.26  4.40% and was of loose connective tissue. In the testicular parenchyma, the seminiferous tubules and the interstitial tissue comprised 72.44  2.12% and 27.46  2.12%, respectively. Seminiferous tubules were highly convoluted ducts of 226.23  18.08 m in diameter composed by a lamina propria and the seminiferous epithelium. The lamina propria, of 4-4.5 m thick, was formed by basal lamina and two layers of peritubular cells. The seminiferous epithelium, of 66.11  10.62 m high, was stratified columnar with Sertoli cells and different generations of spermatogonia, spermatocytes and spermatids. The interstitial tissue was loose connective tissue with abundant and closely-packed polyhedral Leydig cells (av. 15 x 12 m).The second aim of this study has been to describe the morphological features of the eight stages of the seminiferous epithelium in Landrace boars (british variety) according to the tubular morphology method, as well as their relative frequency, length, height and duration. Premeiotic stages (I, II and III) occupied the 31.9 % of the spermatogenic cycle and were mainly characterized by the presence of cells in the initial phases of meiosis I. Early meiosis I did not affect the morphometric parameters of the seminiferous epithelium as indicated by the variable values obtained in the seminiferous epithelium height, as well as in the relative frequency, length, and duration of premeiotic stages. Meiotic stages (IV and V) represented the 16.4 % of the spermatogenic cycle and were constituted, mainly, by cells in advanced meiosis I and/or cells in meiosis II. Last phases of meiosis I and also meiosis II occurred rapidly, resulting in low relative frequency and, therefore, in low duration of meiotic stages. Postmeiotic stages (VI, VII and VIII) occupied the 50.6 % of the spermatogenic cycle. The most important event of these stages was the maturation phase of spermiogenesis. The maturation phase included several morphological and ultrastructural modifications in spermatids, resulting in the formation of spermatozoa. The complexity of these processes correlated with the high relative frequency, length, and duration of postmeiotic stages.The third aim of this study has been to describe the spermiogenesis process at ultrastructural level and, to relate the spermatid transformations along the spermiogernesis with the ultraestructural changes undergoing in testicular cells (mainly germinal, Sertoli and Leydig cells).The spermiogenesis of Landrace boars (british variety) was divided into 9 steps, each one characterized by the presence of an specific spermatid type. Significant differences were found neither among the three healthy boars (P > 0.01), nor the left and right testes (P > 0.01) in the ultrastructure of the testiculars cells along spermiogenesis.