Abstract Efficient production of biologically functional recombinant proteins is a cornerstone of modern biotechnological research. Laboratory-scale protein production is most commonly accomplished in simple shaking bioreactors such as shake flasks. However, productivity of these cultures is often severely limited by low biomass yield and non-optimal growth conditions regarding medium composition, pH and oxygen supply. In many cases, poor culture performance can constitute a major research bottleneck. This study aims to improve recombinant protein production in shaking Escherichia coli cultures by use of enzyme-controlled, fed-batch-like glucose feeding in a rich medium, and by investigating the effects of culture aeration on different aspects of protein production. The results show that the enzymatic fed-batch medium can provide higher cell densities, volumetric protein yields and, in some cases, improved product solubility or activity compared to traditionally used media. While these improvements could be obtained in ordinary shaking vessels, the results also demonstrate that cultivation in shake flasks with elevated aeration capacity can further improve cell density and volumetric productivity in the fed-batch medium. However, enhanced aeration may also have an adverse effect on the expression of certain proteins such as Fab antibody fragments. Maximum volumetric Fab yield was achieved under reduced aeration rates, and lower oxygen availability also contributed to substantially increased accumulation of periplasmically produced Fab fragments into extracellular medium. Hence modification of aeration conditions and medium composition can be used to control periplasmic/extracellular product localization as outlined in this study. Moreover, high aeration was detrimental to expression in a glycerol-based lactose autoinduction medium, but this strict dependency on aeration level could be mitigated and robustness of expression improved by an autoinduction medium based on the enzymatic glucose feeding as the supporting carbon source instead of glycerol. The results of this study can be utilized to improve volumetric productivity, protein solubility and control of product localization in small-scale protein production, as well as to facilitate robust and efficient high-throughput protein expression for such applications as structural and functional characterization. / Tiivistelmä Biologisesti aktiivisten vierasproteiinien tehokas tuottaminen on yksi bioteknologisen tutkimuksen kulmakivistä. Laboratoriomittakaavan proteiinituotto toteutetaan yleisimmin yksinkertaisissa ravistelubioreaktoreissa, kuten ravistelupulloissa. Näiden viljelmien tuottavuutta rajoittaa kuitenkin usein biomassan matala saanto sekä epäoptimaaliset olosuhteet kasvualustan koostumuksen, pH:n ja hapen suhteen. Monissa tapauksissa viljelmän heikko tuottavuus muodostaa tutkimukselle merkittävän pullonkaulan. Tämän tutkimuksen tavoite on parantaa vierasproteiinien tuottoa Escherichia coli –ravisteluviljelmissä hyödyntäen entsymaattisesti kontrolloitua, panossyöttökasvatusta jäljittelevää glukoosisyöttöä rikkaassa kasvualustassa, sekä selvittää ilmastuksen vaikutusta proteiinituoton eri osatekijöihin. Tulosten mukaan glukoosisyöttöön perustuva kasvualusta mahdollistaa korkeamman solutiheyden sekä proteiinituoton verrattuna tavallisimmin käytettyihin kasvualustoihin. Joissain tapauksissa myös proteiinin liukoisuus tai aktiivisuus voi parantua. Vaikka nämä edut pystyttiin saavuttamaan myös tavanomaisissa ravistelupulloissa, voidaan panossyöttökasvualustan solutiheyttä ja tuottoa tilavuutta kohti edelleen lisätä käyttämällä korkeamman ilmastustehokkuuden ravistelupulloja. Toisaalta tehostetun ilmastuksen havaittiin olevan mahdollisesti haitallista tiettyjen proteiinien, kuten Fab-vasta-ainefragmenttien, tuotolle. Fab-fragmenttien maksimaalinen tuotto saavutettiin ilmastustehokkuutta laskemalla. Lisäksi matalampi hapen saatavuus edisti periplasmaan ohjattujen Fab-fragmenttien kerääntymistä solunulkoiseen kasvualustaan. Näin ollen ilmastusolosuhteita ja kasvualustan koostumusta muokkaamalla voidaan vaikuttaa tuotteen lopulliseen sijoittumiseen. Korkean ilmastustehokkuuden havaittiin myös olevan haitallista proteiinituotolle glyserolipohjaisessa autoinduktiokasvualustassa. Tätä riippuvuutta ilmastuksen tasosta pystyttiin vähentämään ja autoinduktion luotettavuutta parantamaan käyttämällä kasvualustaa jossa hiililähteenä toimii glyserolin sijaan entsymaattinen glukoosisyöttö. Tutkimuksen tuloksia hyödyntäen voidaan parantaa vierasproteiinien saantoa, liukoisuutta ja periplasmisen/solunulkoisen kerääntymisen säätelyä, sekä mahdollistaa luotettava ja tehokas proteiinituotto viljelmien suurta lukumäärää vaativiin sovelluksiin, kuten proteiinien rakenteen ja toiminnan tutkimukseen.

科学研究費補助金 研究種目:一般研究(C) 課題番号:05650796 研究代表者:山根 恒夫 研究期間:1993-1994年度

[ES] Los dobles haploides son una gran herramienta para la mejora genética de híbridos debido a que se puede alcanzar la homocigosis completa en una sola generación. Entre las técnicas usadas para obtener estas plantas, la inducción de la embriogénesis de microsporas, mediante el cultivo de anteras o de microsporas, es la más eficiente y la más usada. La embriogénesis de microsporas es también un ejemplo de totipotencia de las células vegetales gracias a su habilidad de reprogramar su desarrollo gametofítico hacia una ruta esporofítica, donde las células proliferan de forma organizada para crear un nuevo organismo. Como en muchos otros procesos in vitro, las condiciones de cultivo deben ser optimizadas para incrementar la eficiencia. En la presente Tesis Doctoral, hemos usado dos especies como sistemas experimentales para estudiar y optimizar el cultivo de microsporas. Por un lado, usamos berenjena (Solanum melongena) como un ejemplo de cultivo de importancia económica en el que los protocolos todavía tienen mucho margen de mejora. La optimización de la densidad celular y los reguladores de crecimiento han demostrado ser útiles para modificar la eficiencia del cultivo de microsporas de berenjena. Por otra parte, hemos utilizado el cultivo de microsporas de Brassica napus para estudios básicos puesto que ha sido ampliamente usado como modelo para entender procesos celulares que ocurren durante este cambio en el desarrollo. Se detalla un protocolo estandarizado para el cultivo de microsporas de B. napus, el cual ha sido utilizado en todos los cultivos en esta Tesis para explorar una serie de procesos y estructuras celulares potencialmente implicados en el cambio de desarrollo hacia embriogénesis. Estos procesos incluyen estrés del retículo endoplásmico, muerte celular programada, autofagia y estructura y composición de la pared celular. Estudiamos en paralelo el cultivo de microsporas de dos genotipos de B. napus con diferente respuesta androgénica en condiciones estándar y añadiendo Tricostatina A, un modulador epigenético que ha mostrado ser beneficioso para la respuesta androgénica en algunos casos. En conjunto, esta Tesis representa un avance en la optimización del cultivo de microsporas en estas especies y arroja luz sobre el papel de algunos procesos en el contexto de embriogénesis de microsporas. / [CA] Els dobles haploides són una gran eina en millora vegetal per a la producció d'híbrids, a causa de la seua total homozigosi, que es pot aconseguir en només una generació in vitro. Entre les diverses tècniques que s'utilitzen per tal d'obtenir aquestes plantes, la inducció de l'embriogènesi de microspores, mitjançant cultiu d'anteres o microspores, és la més comuna i eficient. L'embriogènesi de microspores també és un exemple de la totipotència de les cèl·lules vegetals, capaços de reprogramar-se d'una via gametofítica a una via esporofítica, on proliferen de manera organitzada per crear un nou organisme. Com en moltes altres tecniques in vitro, s'han d'optimitzar les condicions del cultiu per tal d'augmentar l'eficiència. En la present Tesi Doctoral, hem utilitzat dues espècies de plantes com a sistemes experimentals per estudiar i optimitzar el cultiu de microspores. Per una banda, hem utilitzat l'albergínia (Solanum melongena) com a exemple de cultiu d'importància econòmica on els protocols encara tenen marge per a l'optimització. La optimització de la densitat de cèl·lules en cultiu i la concentració de reguladors de creixement van demostrar ser útils per modificar l'eficiència de la resposta dels cultius de microspores d'albergínia. D'altra banda, hem utilitzat cultius de microspores de Brassica napus principalment per a estudis bàsics, ja que s'utilitza àmpliament com a model per entendre els processos cel·lulars que es produeixen durant aquest canvi de desenvolupament. Es detalla un protocol estandarditzat per al cultiu de microspores de B. napus, que s'ha utilitzat en tots els cultius inclosos en aquesta Tesi per explorar una sèrie de processos i estructures cel·lulars potencialment implicades en el canvi de desenvolupament cap a l'embriogènesi. Aquests inclouen l'estrès del reticle endoplasmàtic, la mort cel·lular programada, l'autofàgia i l'estructura i composició de la paret cel·lular. Vam estudiar en paral·lel cultius de microspores de dos genotips de B. napus amb diferent resposta androgènica, cultivats en condicions estàndard i afegint-hi Tricostatina A, un modulador epigenètic que s¿ha demostrat beneficiós per a la resposta androgènica en alguns casos. En conjunt, aquesta Tesi representa un avanç en l'optimització dels cultius de microsporas en aquestes espècies i aporta llum sobre el paper d'alguns processos en el context de l'embriogènesi de microspores. / [EN] Doubled haploids are a great tool for hybrid breeding due to their complete homozygosity achievable in only one in vitro generation. Among the several techniques used to obtain these plants, induction of microspore embryogenesis, via anther or microspore culture, is the most common and efficient approach. Microspore embryogenesis is also an example of totipotency of plant cells due to their ability to reprogram themselves from a gametophytic to a sporophytic pathway, where cells proliferate in an organized way to create a new organism. As in many other in vitro procedures, culture conditions must be optimized in order to increase efficiency. In the present Doctoral Thesis, we used two plant species as experimental systems to study and optimize microspore culture. On one hand, we used eggplant (Solanum melongena) as an example of economically important crop where protocols have still room for optimization. Optimization of cell density and growth regulators demonstrated to be useful to modify the efficiency of eggplant microspore cultures. On the other hand, we used B. napus microspore cultures principally for basic studies since it is widely used as a model to understand cellular processes occurring during this developmental switch. A standardized protocol for Brassica napus microspore culture is detailed, which was used in all the cultures included in this Thesis to explore a series of processes and cellular structures potentially involved in the developmental switch towards embryogenesis. These included endoplasmic reticulum stress, programmed cell death, autophagy, and cell wall structure and composition. We studied in parallel microspore cultures from two B. napus genotypes with different androgenic response cultured in standard conditions and adding Trichostatin A, a epigenetic modulator shown to be beneficial for the androgenic response in some cases. Together, this Thesis represents an advance in the optimization of microspore cultures in these species, and sheds light on the role of some processes within the context of microspore embryogenesis. / Thanks are due to the Electron Microscopy Service of Universitat Politècnica de València, Marisol Gascón (IBMCP Microscopy Service). This work was supported by grant AGL2017-88135-R to JMSS from MICINN jointly funded by FEDER and by a Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowship (656579) to PC-M This work was supported by grant AGL2017-88135-R to JMSS from MINECO jointly funded by FEDER. / Camacho Fernández, C. (2021). Microspore embryogenesis: cell wall dynamics and reprogramming of cell fate [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/163698