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Phosphoglucosamine mutase (GlmM) is an enzyme of bacterial cell wall biosynthesis. The main aim of this thesis was to find out, whether gene glmM is essential for viability of Streptococcus pneumoniae. Therefore, we prepared merodiploid strain containing two copies of glmM; the genomic gene and ectopic copy under control of zinc inducible promoter. Subsequently, depletion strain was prepared by deletion of genomic copy of glmM. This strain was further used for analysis of viability and phenotype features in the medium containing various concentrations of zinc ions, an inducer of ectopic glmM expression. We found out, that the viability of this strain was strictly dependent on the concentration of inducer and further, that depletion of GlmM resulted in remarkable morphological defects. The rescue of mutant strain was observed after addition of inducer up to the level of the control sample. These results have provided the evidence of glmM essentiality for S. pneumoniae viability. Furthermore, we analyzed, whether phosphorylation of key amino acid residues, S99 and S101, is essential for GlmM functionality. Four different strains were prepared by means of site-directed mutagenesis expressing glmM with substitutions of key serine residues for alanine or glutamic acid. Since deletion of chromosomal locus in...

Even though the structure of the plant cell wall is by and large quite well characterized, its synthesis and regulation remains largely obscure. However, it is accepted that the building blocks of the polysaccharidic part of the plant cell wall are nucleotide sugars. Thus to gain more insight into the cell wall biosynthesis, in the first part of this thesis, plant genes possibly involved in the nucleotide sugar interconversion pathway were identified using a bioinformatics approach and characterized in plants, mainly in Arabidopsis. For the computational identification profile hidden markov models were extracted from the Pfam and TIGR databases. Mainly with these, plant genes were identified facilitating the “hmmer” program. Several gene families were identified and three were further characterized, the UDP-rhamnose synthase (RHM), UDP-glucuronic acid epimerase (GAE) and the myo-inositol oxygenase (MIOX) families. For the three-membered RHM family relative ubiquitous expression was shown using variuos methods. For one of these genes, RHM2, T-DNA lines could be obtained. Moreover, the transcription of the whole family was downregulated facilitating an RNAi approach. In both cases a alteration of cell wall typic polysaccharides and developmental changes could be shown. In the case of the rhm2 mutant these were restricted to the seed or the seed mucilage, whereas the RNAi plants showed profound changes in the whole plant. In the case of the six-membered GAE family, the gene expressed to the highest level (GAE6) was cloned, expressed heterologously and its function was characterized. Thus, it could be shown that GAE6 encodes for an enzyme responsible for the conversion of UDP-glucuronic acid to UDP-galacturonic acid. However, a change in transcript level of variuos GAE family members achieved by T-DNA insertions (gae2, gae5, gae6), overexpression (GAE6) or an RNAi approach, targeting the whole family, did not reveal any robust changes in the cell wall. Contrary to the other two families the MIOX gene family had to be identified using a BLAST based approach due to the lack of enough suitable candidate genes for building a hidden markov model. An initial bioinformatic characterization was performed which will lead to further insights into this pathway. In total it was possible to identify the two gene families which are involved in the synthesis of the two pectin backbone sugars galacturonic acid and rhamnose. Moreover with the identification of the MIOX genes a genefamily, important for the supply of nucleotide sugar precursors was identified. In a second part of this thesis publicly available microarray datasets were analyzed with respect to co-responsive behavior of transcripts on a global basis using nearly 10,000 genes. The data has been made available to the community in form of a database providing additional statistical and visualization tools (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de). Using the framework of the database to identify nucleotide sugar converting genes indicated that co-response might be used for identification of novel genes involved in cell wall synthesis based on already known genes. / Obwohl der Aufbau der pflanzlichen Zellwand im Großen und Ganzen relativ gut charakterisiert ist, ist relativ wenig über ihre Synthese bekannt. Allgemein akzeptiert ist jedoch, dass die Nukleotidzucker die Vorstufe für den polysaccharidären Teil der Zellwand stellen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden neue Kandidatengene für die Zellwandbiosynthese mittels bioinformatorischer Analysen ermittelt und deren Rolle in Pflanzen, hauptsächlich Arabidopsis thaliana untersucht. Zur Identifizierung von Arabidopsis thaliana Kandidatengenen des Nukleotidzucker-Stoffwechselweges wurden „hidden Markov Modelle“ für Gene desselben aus den Datenbanken Pfam und TIGR extrahiert. Unter anderem wurden diese dann unter Zuhilfenahme des Programms hmmer zur Identifikation von pflanzlichen Genen benutzt. Es wurden einige Genfamilien identifiziert und drei von diesen wurden weiter charakterisiert. Hierbei handelte sich um eine UDP-Rhamnose Synthase Familie (RHM), eine UDP-Glucuronsäurepimerase Familie (GAE) und eine myo-Inositol Oxygenase Familie (MIOX). Für die RHM Kandidatengenfamilie, mit drei Mitgliedern, wurde die relativ ubiquitäre Expression aller Gene mittels verschiedener Methoden gezeigt und für eines der Gene, RHM2, konnten T-DNA Linien bezogen werden. Außerdem wurde die Transkription der gesamten Familie mittels eines RNAi Konstruktes herunter geregelt. In beiden Fällen konnte eine Veränderung von zellwandtypischen Polysacchariden sowie schwere Entwicklungsstörungen gezeigt werden. Diese waren bei der rhm2 Funktionsverlustpflanze auf den Samenschleim bzw. den Samen reduziert, bei den RNAi Pflanzen hingegen war die gesamte Pflanze betroffen. Im Falle der zweiten Kandidatengenfamilie, GAE, wurde das höchst-exprimierte Gen (GAE6) kloniert, heterolog exprimiert und die Funktion charakterisiert. So konnte gezeigt werden, dass GAE6 für ein Enzym kodiert, welches UDP-Glukuronsäure in UDP-Galakturonsäure wandelt. Allerdings zeigten Pflanzen mit veränderter Transkriptmenge, erreicht durch T-DNA Insertionen (gae2, gae5, gae6), Überexpression (GAE6) oder RNAi / keine robuste Veränderung der Zellwand. Die letzte betrachtete Kandiatengenfamilie myo-Inositol Oxygenase wurde im Gegensatz zu den beiden anderen Familien, durch eine BLAST Suche gefunden, da zur Zeit der Durchführung noch zu wenig myo-inositol Oxygenasen bekannt waren, um daraus „hidden Markov Modelle“ abzuleiten. Dennoch konnten erste bioinformatorische Analysen zu dieser Genfamilie gemacht werden. Insgesamt gesehen wurden in diesem Teil der Arbeit die beiden Genfamilien identifiziert und charkterisiert, die bei der Synthese der beiden Pektinrückgradzucker Rhamnose und Galakturonsäure die tragende Rolle spielen. Weiterhin wurde mit der Identifizierung der MIOX Genfamilie, eine Genfamilie identifiziert, die wichtige Vorstufen in der Synthese der Nukleotidzucker liefert. In einem zweiten Teil der Arbeit wurden öffentlich zugängliche Mikroarray-Daten durch ihr Gleich -oder Ungleichverhalten charakterisiert. Dieses erfolgte auf globaler Ebene für zunächst fast 10.000 Gene. Die Daten wurden in Form einer allgemein zugänglichen Datenbank der Allgemeinheit zur Verfügung gestellt (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de). Eine Anwendung der Methode auf Gene des Nukleotidzuckerstoffwechsels, deutet darauf hin, dass so neue Kandiatengene, die bei der Zellwandsynthese eine Rolle spielen, von bereits bekannten Genen abgeleitet werden können.

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Die Umsetzung des Park-Nucleotids zu Lipid I in der bakteriellen Zellwandbiosynthese wird durch das Enzym MraY katalysiert. Dieses Enzym ist ein interessantes, bisher ungenutztes Target für neuartige Antibiotika. In der vorliegenden Dissertation wurde das fluoreszenzmarkierte Park-Nucleotid, welches für MraY-Assays geeignet ist, totalsynthetisch dargestellt. Die Synthese konnte ausgehend von kommerziell erhältlichem N-Acetylglucosamin in 14 Stufen mit einer Gesamtausbeute von 4 % erfolgreich durchgeführt werden. Dabei wurden einige Schritte auf Basis einer literaturbekannten Synthese gründlich optimiert und neue Wege zur Darstellung des Peptids und anschließender Kupplung mit einem Kohlenhydrat Baustein gefunden. Im Zuge dieser neuen Syntheseroute wurde die Uridindiphosphat-N-Acetylmuraminsäure, als Substrat für MurC-Assays, synthetisiert. Dies gelang in einer achtstufigen Synthese ausgehend von der geschützten N-Acetylmuraminsäure in einer Gesamtausbeute von 15 %. Die Muraymycine, eine Klasse von natürlichen Nucleosid-Antibiotika, inhibieren das Enzym MraY effizient. In dieser Dissertation wurde der Grundstein für die Synthese möglichst vielfältiger vereinfachter Muraymycin Analoga gelegt, welche potentielle Inhibitoren für MraY darstellen. Die Harnstoffpeptidseitenkette wurde variiert, um den Einfluss dieses Strukturbausteins auf die Inhibitor-Aktivität intensiver untersuchen zu können. Der Ersatz der anspruchsvoll zu synthetisierenden Aminosäure Epicapreomycidin durch die kommerziell erhältlichen Aminosäuren L-Lysin, L-Ornithin, L-Arginin, L-Alanin und L-Methionin konnte die Synthese der Harnstoffpeptidkette stark vereinfachen. Des Weiteren wurde durch eine stereospezifische Synthese die geschützte 2S,3S-Diaminohexansäure dargestellt, um das in den natürlichen Muraymycinen enthaltene L-Hydroxyleucin, welches häufig mit einer Fettsäure verestert ist, zu ersetzten. Dieses sollte durch den Austausch einer Esterbindung durch eine Amidbindung zu einer Stabilisierung der Muraymycin Derivate führen. Unter Verwendung des in dieser Dissertation beschriebenen Lysin-haltigen Harnstoffpeptids wurden vor kurzen vereinfachte Muraymycin-Analoga synthetisiert und IC50 Werte mittels eines fluoreszenzbasierten MraY-Assays bestimmt. Diese stark vereinfachten Verbindungen weisen bereits gute Inhibitor Aktivitäten auf. Durch die Kombination der verschiedenen, in dieser Arbeit synthetisierten Harnstoffpeptide und Aminosäuren mit unterschiedlichen Uridinderivaten kann zukünftig eine große Anzahl diverser potentieller Inhibitoren dargestellt werden.