En endodontie, les peptides antimicrobiens (AMP) pourraient résoudre les limitations potentielles liées à l'utilisation d'antibiotiques. L’objectif de cette étude était d’évaluer l’effet du KSL-W sur l’adhésion, la prolifération et la migration des cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC). Méthodes : Les DPSC ont été cultivées en présence et en l'absence de KSL-W à différentes concentrations ou d’une combinaison de deux (ciprofloxacine et métronidazole ; DAP) ou trois (ciprofloxacine, métronidazole et minocycline ; TAP) antibiotiques. L'adhésion cellulaire a été évaluée à l’aide de coloration au cristal violet et d’observations microscopiques. La viabilité/l’activité métabolique (V/AM) des DPSC a été étudiée par un test MTT. L'effet de KSL-W sur la migration cellulaire / la guérison des blessures a été évaluée à l'aide du test de blessure de la culture dite ″scratch test″. Les données collectées ont été analysées par ANOVA. Une différence significative a été considérée à P ≤ 0.05. Résultats : Le KSL-W n’a pas d’effet inhibiteur sur l’adhésion des DPSC, comparativement au DAP et au TAP. Ces observations sont confirmées par nos analyses de viabilité/activité métaboliques (V/AM) des cellules. En effet, les résultats du MTT ont montré une V/AM plus adéquate en présence de KSL-W. À titre d’exemple, les cellules en présence de KSL-W à 10 et 50 µg/ml, montrent une V/AM comparable au contrôle (cellules non traitées). Il est important de noter que le KSL- W a favorisé la migration cellulaire après une blessure. Les DPSC ont pu migrer et recouvrir la blessure plus rapidement avec KSL- W qu’avec les antibiotiques. Conclusion : Comparativement aux antibiotiques, le KSL-W n’a pas d’effets négatifs sur l'adhésion et la V/AM. Ce peptide semble favoriser la migration cellulaire. Ces travaux suggèrent l’utilisation du KSL-W comme un agent antimicrobien pouvant être utilisé en endodontie.

Objectif: Crumbs3 (CRB3) est essentielle pour la polarité épithéliale et la formation des jonctions serrées. Deux isoformes de CRB3 ont été identifiés, soit CRB3A et CRB3B. Les fonctions et la localisation de ces protéines demeurent méconnues. Notre objectif était d'étudier la localisation de ces protéines dans différentes lignées épithéliales et leur fonction par identification de partenaires d'interaction. Méthodes: Nous avons produit un gène de fusion HIS-CRB3A qui a été exprimé dans des cellules d'insectes, puis le produit de ce gène a été purifié à l'aide de billes magnétiques. La protéine HIS-CRB3 isolée a servie d'appât pour isoler des partenaires d'interaction par spectrométrie de masse à partir d'un homogénat de cellules épithéliales humaines (Caco-2). Résultats : L'analyse en spectrométrie de masse a révélé que plusieurs importines et exportines interagissent avec CRB3, suggérant que CRB3 puisse se localiser au niveau du noyau. En accord avec cette hypothèse, l'analyse de la séquence de CRB3 montre un NLS et un NES potentiels. De plus, par immunofluorescence et fractionnement cellulaire, nous avons montré que CRB3B se situe au niveau du noyau. Par contre, la localisation de CRB3A est restreinte à la membrane plasmique. Conclusion : Nous avons identifié des partenaires d'interaction de CRB3 qui laisse présager des fonctions insoupçonnées pour cette protéine.

Cette étude a eu pour but d'élucider le rôle physiologique de l'enzyme ß-lactamase. Nous avons postulé que la ß-lactamase n'est pas exclusivement de nature bactérienne, qu'elle est reliée à une fonction physiologique importante et que cette fonction peut se retrouver chez les mammifères. Nous avons d'abord entrepris de vérifier le concept d'universalité des ß-lactamases. Des méthodes sensibles de détection ont été appliquées afin de mesurer la capacité de souches bactériennes, dites ß-lactamases-négatives, de synthétiser cette enzyme. La présence de ß-lactamase a semblé être une caractéristique commune aux bactéries grain-négatives. Une souche de Mycoplasma pneumoniae n'a montré aucune activité de ce type. Chez les micro-organismes à Gram positif, les actinomycètes Bifidobacterium et Propionibacterium ont montré une faible activité ß-lactamase. Deux Peptococcus anaerobius et un Peptostreptococcus productus n'ont pas révélé d'activité ß-lactamase décelable. Ces deux espèces sont des bactéries anaérobies strictes. Cette observation suggère que la ß-lactamase peut jouer un rôle dans le métabolisme aérobie des cellules productrices. Nous avons ensuite réalisé des expériences métaboliques avec des souches d'entérobactéries afin de vérifier si la synthèse de ß-lactamase est accrue en aérobiose. Nous avons mesuré l'effet de l'oxygène sur la synthèse de ß-lactamases inductibles et constitutives, en présence ou non de cyanure de potassium. De plus, l'influence de la pénicilline, de la source d'énergie et de la composition du milieu de culture sur le taux de synthèse de ß-lactamase fut évaluée en présence et en absence d'oxygène. L'aérobiose ainsi que le milieu minimal ont augmenté les niveaux des ß-lactamases d'Enterobacter et de Citrobacter. Le cyanure de potassium a freiné l'effet inducteur de 1'oxygène en aérobiose. Ce résultat semble suggérer que la synthèse de g-lactamase dépend davantage du fonctionnement normal de la chaîne des transporteurs d'électrons que de l'influence directe de l'oxygène à d'autres niveaux métaboliques. Nous avons justifié la nécessité de réaliser ce type d'expériences avec des souches microbiennes génétiquement définies. A la suite de ces observations, nous avons dirigé nos efforts vers la mise en évidence et la caractérisation d'une activité g-lactamase dans des cellules de mammifères. Les méthodes d'études ont été basées sur 1 'interaction des protéines de rat avec une gamme d'antibiotiques appartenant aux principaux groupes de ß-lactamines. Les résultats ont indiqué que le surnageant 100,000 g d'un homogénat de foie de rat peut dégrader les ß-lactamines. L'activité a été jugée complexe. L'inactivation de deux céphalosporines chromogéniques, le PADAC (pyridinium-2-azo-p-diméthy 1-ani 1ine chromophore) et la nitro- céfine, a semblé reposer sur deux mécanismes différents. Les caractéristiques spectrophotométriques de ces deux substrats et de leurs produits de dégradation ont rappelé une activité de type g-lactamase. Nous avons déterminé l'absence de relation avec d'autres protéines capables de réagir sur les g-lactamines comme la peptidase rénale, l'albumine et l'acylase. La présence d'une ß-lactamase dans les cellules de foie de rat pourrait contribuer à élucider son rôle physiologique essentiel. Dans cette perspective, nous avons entrepris de purifier l'activité ß-lactamase des cellules de foie de rat. Les tentatives entreprises afin d'isoler la protéine responsable de l'hydrolyse du PADAC ont échoué. Chaque étape de purification a été caractérisée par une faible récupération de l'activité enzymatique et, par conséquent, une perte d'activité spécifique. Nous avons d'abord attribué ce résultat à une grande instabilité de l'enzyme. La recherche des conditions optimales pour stabiliser cette protéine a permis de déterminer qu'elle nécessite la présence d'un cofacteur, le NADPH. Elle possède un poids moléculaire voisin de 25,000 et un point isoélectrique d'environ 7.7. Elle a réagi aussi avec quelques pénames et céphèmes. La protéine qui a dégradé la nitrocéfine possède un poids moléculaire inférieur à celle qui a hydro lysé le PADAC et un point isoélectrique près de 5.4. Elle a réagi avec un pénème et un monobactame. Ces propriétés n'écartent pas la possibilité qu'il s'agit de g-lactamases. Cependant, l'appartenance définitive de ces protéines à la famille des ß-lactamases devra attendre leur purification complète. / Montréal Trigonix inc. 2018

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / Le foie reçoit un afflux substantiel de lipides de la circulation sanguine, qui doivent être triés efficacement vers diverses organites en fonction des besoins cellulaires et systémiques. En effet, le foie distingue les lipides destinés à la sécrétion extracellulaire, emballés dans les lipoprotéines de très basse densité (VLDL), de ceux destinés au catabolisme intracellulaire, qui implique les mitochondries et les peroxysomes. Ces voies systémiques et intracellulaires reposent sur un pool commun de lipides, établissant ainsi une interdépendance complexe entre elles. Il n'est cependant pas clair si et comment l'hépatocyte compartimentalise le flux de lipides et assure un partage approprié de ces processus. Les études présentées dans cette thèse visent à identifier la structure cellulaire responsable de la compartimentalisation des lipides et de la régulation de leur flux dans l'hépatocyte. Par le biais de la microscopie électronique, nous avons découvert que le foie de la souris est peuplé d'un type courbé de réticulum endoplasmique rugueux qui enveloppe la plupart des mitochondries et des peroxysomes dans les hépatocytes, que nous avons baptisé "wrappER". De plus, le wrappER organise la moitié de la population mitochondriale et peroxysomale en un complexe à trois organites. Ce contact tripartite est dynamique et régulé métaboliquement, car il réagit à la transition du jeûne à l'alimentation chez l'animal et augmente en fréquence dans des conditions associées à une plus grande charge en acides gras dans l'hépatocyte. Nous avons constaté que la préservation de l'architecture du contact est cruciale pour la régulation appropriée de l'homéostasie hépatique des lipides, car la diminution de l'expression de Synj2bp, qui contrôle spécifiquement l'ampleur du contact wrappER-mitochondries, entraîne une dyslipidémie, une accumulation de gouttelettes lipidiques et une altération de la sécrétion de VLDL. Au cours de mes travaux doctoraux, j'ai développé un protocole ad hoc pour l'isolement de fractions enrichies en complexes peroxysome-wrappER-mitochondrie intacts à partir du foie de la souris. Les analyses multi-omiques effectuées sur ces fractions ont mis en évidence le wrappER comme un site de biogenèse des VLDL, une voie qui est compromise par la perte de la structure de contact wrappER-mitochondrie. De plus, la protéomique quantitative de ce complexe isolé à partir de foies Mttp[exposant -/-], une condition dans laquelle la synthèse des VLDL est arrêtée, a révélé une augmentation globale de la β-oxydation des acides gras. Chez ces souris, nous avons également observé une fréquence accrue de cette association à trois organites, intégrant ainsi sa dynamique dans les réponses du flux hépatique des acides gras. Ainsi, dans le foie, le complexe peroxysome-wrappER-mitochondries intègre les voies extracellulaires et intracellulaires hépatiques, acheminant les lipides vers la biosynthèse des VLDL pour la sécrétion ou vers la β-oxydation pour leur catabolisme, régulant ainsi l'homéostasie lipidique hépatique et systémique. / The liver receives substantial influx of lipids from the circulation, which must efficiently sort to various organelles based on cellular and systemic needs. Indeed, the liver distinguishes between lipids destined for extracellular secretion, packed in Very-Low-Density Lipoproteins (VLDLs), and those intended for intracellular catabolism, which involves mitochondria and peroxisomes. These systemic and intracellular pathways rely on a shared pool of lipids, thus establishing an intricate interdependence between them. It is however unclear whether and how the hepatocyte compartmentalizes the flux of lipids and ensures proper partitioning of these processes. The studies presented in this thesis aim to identify the cellular structure responsible for the compartmentalization of lipids and the regulation of their flux in the hepatocyte. By means of electron microscopy, we discovered that the mouse liver is populated by a curved type of rough-Endoplasmic Reticulum that wraps most of the mitochondria and peroxisomes in hepatocytes and which we christened wrappER. Furthermore, the wrappER organizes half of the mitochondrial and peroxisomal population into a three-organelle complex. This three-way contact is dynamic and metabolically regulated, as it responds to the animal's fasting-to-feeding transition and increases in frequency under conditions associated with higher fatty acids loading in the hepatocyte. We found that the preservation of the contact architecture is critical for the proper regulation of hepatic lipid homeostasis, as the down regulation of Synj2bp, which we showed controls specifically the extent of wrappER-mitochondria contact, causes dyslipidemia, accumulation of lipid droplets, and altered VLDL secretion. During my doctoral work, I developed an ad hoc protocol for the isolation of fractions enriched in intact peroxisome-wrappER-mitochondria complexes from the mouse liver. Multi-omics analyses performed in these fractions pointed to the wrappER as a site of VLDLs biogenesis, a pathway that is compromised with the loss of the wrappER-mitochondria contact structure. Moreover, quantitative proteomic of these complexes isolated from Mttp[superscript -/-] livers, a condition in which VLDLs synthesis is arrested, unveiled upregulated global fatty acid β-oxidation. In these mice, we also observed an increased frequency of this three-organelle association, there by integrating its dynamics into hepatic fatty acid flux responses. Therefore, in the liver, the peroxisome wrappER-mitochondria complex integrates hepatic extracellular and intracellular pathways together, shunting lipids to VLDL biosynthesis for secretion or to β-oxidation for their catabolism, ultimately regulating liver and systemic lipid homeostasis.

Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer le plus commun chez les hommes de plus de 50 ans, représentant20% de l’incidence de tous les cancers en 2021. Après l’approche initiale par chirurgie, environ 30% des patients ont une récurrence et suivent une thérapie de déprivation androgénique, qui mène éventuellement à l'atteinte d'un état de résistance à la castration pour lequel aucun traitement curatif n’existe. De récentes études ont montré un intérêt pour l’activation de la AMP-activated kinase (AMPK) comme traitement pour les CaP résistants à la castration. Cette stratégie repose sur la capacité de la AMPK à inactiver la mechanistic target of rapamycin (mTOR), une protéine impliquée dans une voie de signalisation associée à la prolifération des cellules cancéreuses. Contrairement au dogme établi, nos résultats indiquent que la AMPK n’inhibe pas mTOR dans différents modèles cellulaires de CaP, suggérant que ses fonctions y seraient différentes. En effet, l'activation de la AMPK par le A-769662 a démontré que son activité est nécessaire pour le maintien des fonctions mitochondriales en réponse aux androgènes. Pour étudier plus en profondeur les fonctions de la AMPK, nous avons développé un modèle n’exprimant pas les sous-unités catalytiques de la AMPK, à partir de cellules de CaP 22Rv1. Ce modèle a confirmé que l’activité de la AMPK est essentielle pour maintenir la production d’ATP maximale via la respiration mitochondriale dans les cellules de CaP. En fait, des essais de flux extracellulaire sont montré que le knockout de l’activité de la AMPK nuit à la respiration mitochondriale, à l’intégrité des mitochondries, à la flexibilité métabolique ainsi qu’à la prolifération cellulaire. Ces découvertes mettent de l'avant des fonctions oncogéniques associées à la AMPK et indiquent que l’inhibition des fonctions de la AMPK serait requise, plutôt que son activation, pour le traitement du CaP.

Titre de l'écran-titre (visionné le 26 octobre 2023) / Afin de pallier la demande énergétique mondiale en pleine expansion, de nouvelles technologies de production d'énergies renouvelables doivent être mises de l'avant. L'exploitation de l'énergie solaire de manière plus efficace permettrait de résoudre cette demande en augmentation. Afin de collecter l'énergie solaire, des cellules solaires sont utilisées. Traditionnellement, elles sont composées de silicium. Un autre type de cellules solaires, les cellules solaires organiques (CSO), permettent d'être mieux mises en œuvre grâce à leur capacité d'être imprimées sur des substrats flexibles. Cela permet alors de les intégrer facilement dans des systèmes portatifs. Les matériaux organiques dans les CSO permettant la génération d'un courant sont des semi-conducteurs, de type p et de type n. Entre 2000 et 2015, les matériaux de type p sont majoritairement des polymères π-conjugués et ceux de type n sont principalement des dérivés du fullerène. Cependant, depuis 2015, un fort intérêt est apparu pour les accepteurs d'électrons sans fullerène (NFA) qui, en CSO, présentent de meilleures performances que les CSO faites à partir du fullerène. Ces performances accrues sont le fruit d'une augmentation du courant généré par la CSO grâce à la contribution significative du NFA dans l'absorption de la lumière. Afin de maximiser les performances des CSO, une nouvelle gamme de NFA absorbant à de plus grandes longueurs d'onde (faible largeur de bande interdite) fait l'objet d'intenses recherches. Ce projet de maîtrise se concentre sur la conception de deux nouveaux NFA à faible largeur de bande interdite. Des calculs théoriques ont d'abord permis de déterminer les structures de molécules qui présentent un bon potentiel en CSO. Afin de garder une structure de NFA ayant de bonnes propriétés électroniques, les deux nouveaux NFA étudiés comportent un cœur semblable aux NFA déjà connus et de nouveaux groupements terminaux. La majeure partie du travail effectué se concentre sur leur synthèse. / The world energy demand is on full expansion and new technologies to produce renewable energy must be promoted. The efficient exploitation of solar energy might resolve this increase of consumption. To collect energy from the Sun, solar cells can be used. Traditionally, they are constituted of silicon. However, organic solar cells (OSCs) are another type of solar cells that can be more easily implemented by their possibility to be printed by traditional techniques. Also, they can be printed on flexible substrates which make them useable in portative equipment. Materials used in OSCs to generate electricity are p-type and n-type semiconductors. Between the years 2000 and 2015, p-type materials are principally π-conjugated polymers and n-type materials are mainly fullerene derivatives. However, since 2015, a huge interest in non fullerene acceptors (NFA) has been shown because better performances are achievable using NFAs. This new technology allows the better generation of current by the significative participation of the n-type material in the absorption of light. To improve more the efficiency of OSCs, a new family of NFAs which absorbs in higher wavelengths (low bandgap) is the object of intense studies. This master's project focuses on the conception of two new NFAs which absorb in the near infrared. Theoretical calculations were made to determine molecules that shows a good potential in OSCs. To keep good electronical properties in the two new NFAs, the have an identical core of already published high performant NFAs and new end-groups. The work done in this master's degree focuses on the synthesis of these two new end-groups.

La parodontite est une maladie inflammatoire chronique d'origine bactérienne qui se caractérise par une destruction irréversible des tissus de soutien de la dent. Il est bien reconnu que la salive de sujets atteints de la maladie contient généralement des niveaux plus élevés de médiateurs pro-inflammatoires, de métalloprotéinases matricielles (MMPs) et de sous-produits bactériens toxiques par rapport à celle provenant de sujets sains. Cette étude avait pour objectif de comparer les effets de la salive provenant de sujets sains et atteints de parodontite sévère sur la fonction barrière et la réponse inflammatoire dans des modèles in vitro de l'épithélium buccal. Des échantillons de salive non stimulée provenant de deux groupes de sujets présentant un état de santé gingivale (n = 12) ou une parodontite sévère généralisée (n = 11) ont été stérilisés par filtration. Tous les échantillons salivaires ont été analysés par immunodosage multiplex afin de quantifier et comparer les niveaux d'une variété de cytokines et MMPs considérées comme pertinentes à la parodontite. D'une part, l'effet des échantillons de salive sur l'intégrité de la barrière épithéliale a été évalué en mesurant la résistance électrique transépithéliale (TER) dans un modèle d'épithélium buccal utilisant la lignée cellulaire de kératinocytes B11. D'autre part, des cellules épithéliales de la lignée cellulaire GMSM-K ont été exposées aux échantillons salivaires de chacun des deux groupes de sujets afin de comparer leur capacité à induire la sécrétion d'interleukine-6 (IL-6) et d'interleukine-8 (IL-8) à l'aide d'un dosage immunoenzymatique (ELISA). En comparaison avec les sujets sains, les échantillons de salive provenant des sujets atteints de parodontite présentaient des niveaux significativement plus élevés en métalloprotéinase matricielle-8 (MMP-8), métalloprotéinase matricielle-9 (MMP-9), IL-8 et chimiokine (motif C-X-C) ligand 1 (CXCL1). Les échantillons salivaires provenant des sujets sains ou atteints d'une parodontite ont affecté la TER ainsi que la sécrétion de cytokines de manière comparable. En général, les échantillons salivaires ont induit une augmentation de la TER et favorisé la sécrétion d'IL-6 et IL-8 dans les modèles utilisés. Indépendamment de la présence ou de l'absence de parodontite, la salive peut augmenter la TER et la sécrétion d'IL-6 et IL-8 dans des modèles in vitro de l'épithélium buccal. / Periodontitis is a chronic inflammatory disease of bacterial origin characterized by irreversible destruction of the tooth-supporting tissues. It is well known that saliva from subjects suffering from the disease generally contains higher levels of pro-inflammatory mediators, matrix metalloproteinases (MMPs) and bacteria-derived toxic products. In this study, we investigated and compared the effects of saliva from healthy and periodontitis subjects on the barrier function and inflammatory response in in vitro models of oral epithelium. Unstimulated saliva samples from two groups of subjects with clinical gingival health (n = 12) and severe generalized periodontitis (n = 11) were filter-sterilized. All saliva samples were analyzed by immunological multiplex to determine the levels of various cytokines and MMPs relevant to periodontitis. On the one hand, the impact of saliva on epithelial barrier integrity was assessed by monitoring the transepithelial electrical resistance (TER) in an oral epithelium model using the keratinocyte cell line B11. On the other hand, oral epithelial cells of the cell line GMSM-K were treated with saliva samples of both groups to determine their ability to induce the secretion of interleukin-6 (IL-6) and interleukin-8 (IL-8), as determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Saliva from subjects with periodontitis showed significantly higher levels of matrix metalloproteinase-8 (MMP-8), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), IL-8 and chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (CXCL1) compared to saliva collected from periodontally healthy subjects. Saliva samples from healthy and periodontitis subjects affected the TER and cytokine secretion in a similar manner. Saliva from both groups of subjects increased TER and induced IL-6 and IL-8 secretion in the in vitro models used. Independently of the presence or absence of periodontitis, saliva can increase the relative TER as well as the secretion of IL-6 and IL-8 in in vitro models of oral epithelium.

Insulin-like 3 (INSL3), une hormone spécifique aux cellules de Leydig (LC), est essentielle à la descente testiculaire pendant la vie foetale tandis que chez l'adulte elle agit comme un facteur de survie des cellules germinales. Malgré ses rôles essentiels pour le développement et la fonction du système reproducteur mâle, peu est connu sur la régulation de l'expression de INSL3 dans les LC. L'objectif principal de ce mémoire est donc d'identifier des facteurs de transcription (TFs) régulant l'expression de INSL3 dans les LC. Afin d'identifier ces TFs, j'ai isolé et procédé à une analyse détaillée d'un fragment de 1.1 kb du promoteur humain INSL3 à l'aide de deletions séquentielles en 5', de mutagenèse dirigée et de transfections, ce qui m'a permis de localiser un élément de 10 pb responsable de 70% de l'activité du promoteur INSL3 dans les LC. Cet élément contient un site consensus de liaison (CACCC) pour les membres de la famille de TFs Kruppel-like factor (KLF). Par la suite, j'ai utilisé une stratégie de PCR dégénérée, RT-PCR et d'immunobuvardage pour évaluer l'expression de KLF dans les LC. Des essais de retardement sur gel (EMSA) ont été effectués pour étudier la liaison des KLF au promoteur hINSL3. Avec la PCR dégénérée, j'ai constaté que les cellules de Leydig MA-10 expriment au moins KLF2, 3, 5, 6 et 13. En utilisant des d'amorces KLF6-spécifiques, nous avons observé que ce dernier est exprimé tout au long du développement testiculaire chez la souris (e14 à l'adulte). L'immunobuvardage a aussi confirmé la présence de la protéine KLF6 dans diverses lignées cellulaires de Leydig. Les essais de retardement sur gel ont montré que KLF6 pouvait se lier à l'élément de 10 pb. Enfin, j'ai constaté que KLF6 active significativement le promoteur humain INSL3 et que cette transactivation nécessite l'élément KLF intact dans le promoteur. En résumé, mes résultats suggèrent un rôle pour KLF6 dans la régulation de l'expression de INSL3 et conséquemment dans le développement et la fonction du système reproducteur mâle.

L'endothélium cornéen joue un rôle important dans le maintien de la transparence cornéenne, notamment en assurant le rôle de barrière entre la chambre antérieure et la cornée, et en créant des gradients ioniques nécessaires à la déturgescence stromale. Dans le cas de dysfonctions de l'endothélium, une perte progressive de la vision est engendrée. Parmi les causes de dysfonctions, la dystrophie endothéliale cornéenne de Fuchs (DECF) est la plus importante. Présentement, le seul traitement disponible pour les endothéliopathies cornéennes est la greffe de cornée. Comme la demande en tissus oculaires est grandissante, des alternatives incluant l'expansion in vitro des cellules endothéliales cornéennes (CECs) ont été proposées, soit l'endothélium reconstruit et l'injection de CECs intracamérale. L'enjeu principal lors de la culture des CECs est la transition endothélio-mésenchymateuse (TEM), phénomène où les CECs perdent leur phénotype fonctionnel pour acquérir un phénotype fibroblastique non fonctionnel. Plusieurs étapes de la culture des CECs, comme l'isolement ou le milieu utilisé, peuvent être optimisées afin de conserver la fonctionnalité des CECs. Dans cet ordre d'idée, notre laboratoire a récemment démontré que l'ajout de TGF-β1 permettait de maintenir le phénotype fonctionnel lorsqu'il était ajouté à des CECs confluentes. L'objectif général du projet est d'optimiser les paramètres d'isolement et de culture afin de générer des CECs fonctionnelles pouvant être utilisées en alternative à la greffe de cornées cadavériques. Plus spécifiquement, les objectifs de cette thèse sont 1) d'identifier les paramètres d'isolement permettant de générer des CECs de haute densité et de phénotype endothélial, 2) de comparer l'efficacité des trois isoformes du TGF-β sur le maintien du phénotype endothélial en phase de maturation, de déterminer quels sont les mécanismes impliqués dans la maturation en présence de TGF-β ainsi que de confirmer la fonctionnalité tissulaire dans un modèle de chambres antérieures artificielles et 3) d'étudier l'effet du TGF-β2 sur les CECs provenant de spécimens pathologiques (DECF), notamment l'effet sur la mort cellulaire, sur l'expression des récepteurs du TGF-β et sur la TEM. Afin de répondre à l'objectif 1, deux méthodes d'isolement des CECs ont été comparées (EDTA et collagénase). Les résultats ont montré qu'une plus grande quantité de CECs viables étaient extraites des spécimens post-mortem avec la collagénase et que ces CECs avaient une morphologie plus circulaire. En ce qui a trait à l'objectif 2, les trois isoformes du TGF-β ont été ajoutées aux CECs en phase de maturation et ont permis de générer des cultures de CECs ayant un phénotype fonctionnel in vitro. Le transcriptôme et les voies de signalisation activées par le TGF-β ont été étudiés par la suite. Les résultats de profilage génique ont révélé une augmentation de l'expression de gènes liés à l'adhésion matricielle. Le profilage des voies de signalisation a, pour sa part, permis d'identifier 8 kinases significativement plus actives, dont la kinase AKT. Pour le dernier volet de cet objectif, la fonctionnalité tissulaire a été évaluée en utilisant un modèle d'injection de CECs sur cornées dévitalisées contenues dans des bioréacteurs. Une meilleure adhésion des CECs ayant préalablement été exposées au TGF-β2 ainsi qu'un rétablissement plus rapide des jonctions a été observé dès 2 jours de culture dynamique. Pour répondre à l'objectif 3, des CECs provenant de spécimens DECF ont été exposées au TGF-β2 avant que la mort cellulaire, l'expression des récepteurs du TGF-β et l'expression des jonctions intercellulaires soient mesurées. Aucune différence quant à la mort cellulaire n'a été observée. Seul le récepteur I du TGF-β est augmenté suite à l'exposition au TGF-β2. Les CECs pathologiques exprimaient plus fortement les protéines reliées aux jonctions intercellulaires et localisées à la membrane. Les travaux présentés dans cette thèse proposent une méthode de culture qui génère des CECs fonctionnelles. Ils démontrent également que le TGF-β2 aurait un rôle protecteur sur l'intégrité de la barrière endothéliale lorsque les CECs sont confluentes.

L'anémie de Fanconi (AF) est une pathologie génétique rare (1/350 000 naissances), transmise selon le mode récessif. Son tableau clinique regroupe de nombreuses malformations congénitales, une aplasie médullaire, une pancytopénie et une prédisposition accrue aux cancers. Au plan cellulaire, une mutation sur l'un des treize gènes Fanconi suffit à induire une instabilité chromosomique et une hypersensibilité aux agents pontant l'ADN. La perte de fonction des protéines Fanconi est probablement responsable du défaut d'autorenouvellement des cellules souches hématopoïétiques (CSH) et de l'état pro-apoptotique des progéniteurs médullaires. Les principaux traitements ont une très faible efficacité et induisent de dangereuses complications (toxicité, leucémies). La thérapie génique qui consiste à introduire ex vivo dans les CSH, une copie fonctionnelle du gène Fanconi altéré, apparaît ici comme le traitement alternatif le plus prometteur. Les premiers travaux effectués dans le laboratoire et confirmés pas d'autres, ont montré que la correction génique ex vivo est néfaste pour les CSH Fanconi. Une nouvelle approche thérapeutique a été mise en place, consistant à introduire la copie fonctionnelle du gène altéré directement in vivo, par injection intra-fémorale (IIF). Cette technique novatrice permet de délivrer le gène dans le milieu natif des CSH, leur évitant le stress induit par la culture. Après l'IIF de virions porteurs du gène EGFP (enhanced green fluorescent protein), des analyses sanguines mensuelles montrent une augmentation régulière de la fluorescence, confirmant l'efficacité technique du transfert génique in vivo. L'étape suivante consistait en l'injection du gène correcteur FancC, en fusion avec le marqueur EGFP (FancC-EGFP), dans des souris FancC-/-, FancA-/- et sauvages. L'expression sanguine de la protéine FANCC-EGFP confirme la transduction de cellules médullaires. L'efficacité de correction est évaluée lors de tests de survie des souris aux injections intra-péritonéales d'un agent pontant l'ADN : la mitomycine-C (MMC), sur une période de quinze semaines. Ce traitement vise à évaluer l'effet correcteur de la transduction et la fonctionnalité de la protéine transgénique, seules les cellules corrigées seront en mesure de restaurer l'intégrité de leur ADN et de proliférer. La nature des cellules corrigées a été analysée au cours de transplantations successives. Les résultats démontrent que les CSH FancC-/- recouvrent, après correction in vivo, par le transgène FancC-EGFP, une fonctionnalité semblable à celle des sauvages. Les résultats préliminaires obtenus dans le modèle murin aplasique confirment l'efficacité de la correction génique et sont particulièrement encourageants puisqu'ils permettent d'envisager l'IIF comme une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement de l'AF.