La microscopie de phase quantitative, en particulier la microscopie holographique numérique (MHN), est une approche d’imagerie cellulaire très prometteuse, notamment dans le domaine émergent des cellules souches pluripotentes induites humaines, en raison de sa complémentarité avec l’imagerie de fluorescence, sa grande sensibilité, son caractère non invasif et la richesse du signal quantitatif de phase mesuré. Ce signal quantitatif, très riche, est également compliqué à interpréter. Notamment, il dépend de l’indice de réfraction de la solution physiologique dans laquelle baignent les cellules étudiées. Pour être en mesure d’interpréter correctement le signal quantitatif de phase produit par les cellules, cet indice de réfraction extracellulaire (IRE) doit donc être précisément mesuré. Ce mémoire présente la conception, le développement et la caractérisation d’une méthode de réfractométrie de l’IRE directement dans la chambre d’imagerie, à partir du signal quantitatif de phase mesurée avec un MHN. La capacité du MHN à mesurer précisément un indice de réfraction est d’abord démontrée. Ensuite, son utilisation pour la réfractométrie des liquides dans une chambre d’imagerie est analysée, en remplaçant une des lamelles fermant cette chambre par une lamelle rainurée dont les rainures sont très bien caractérisées. Une précision moyenne de 0.0003 sur l’indice de réfraction est démontrée, ce qui correspond à la précision d’un réfractomètre des liquides commercial typique. Enfin, une preuve de concept faite en utilisant ces lamelles dans un contexte d’imagerie cellulaire sous le MHN. Les données obtenues sont discutées et caractérisées en détail, et la pertinence de ces lamelles dans ce contexte est démontrée. / Quantitative phase microscopy, in particular digital holographic microscopy, is a promising imaging technique for the study of living cells, notably the emerging field of human induced pluripotent stem cells, because of its great sensitivity and resolution, its strict non-invasiveness and its complementarity with fluorescence imaging. This technique allows for the retrieval of the quantitative phase signal (QPS) produced by cells, which is very rich but also complicated to interpret. In particular, the QPS depends on the refractive index (RI) of the medium surrounding the cells in an imaging chamber; therefore, this RI needs to be well monitored in order to correctly and precisely analyse the QPS. In this master’s thesis, the design, development and characterization of a method to measure this extracellular RI directly inside the imaging chamber using the QPS measured by a DHM are described. First, the DHM capability to measure precisely and accurately a RI is demonstrated. Then, its use for liquid refractometry in an imaging chamber is analysed, using a grooved coverslip with well characterized grooves in place of one of the coverslip closing the imaging chamber. An average accuracy on RI measurement of 0.0003 is demonstrated, which is similar to the one of a typical commercial liquid refractometer. Finally, a proof of concept using these grooved coverslips in a biological experiment involving cell imaging under the DHM is completed. The results are thoroughly analysed and discussed, and the relevance of these grooved coverslip for liquid refractometry in a biological context is demonstrated.

Le design d’un dispositif optique sans lentille et portatif est basé sur la microscopie holographique numérique pour des applications de terrain ou de point-of-care. L’appareil développé repose sur cette technique de microscopie car elle permet de reconstruire le front d’onde diffracté (phase et intensité) par un échantillon biologique observé. Le dimensionnement de cet appareil dépend de l’illumination utilisée ainsi que des contraintes physiques associées à la détection. Afin de maximiser l’information pertinente et enregistrable d’échantillons faiblement diffusants, des simulations FDTD sont utilisées. La propagation des champs diffractés à l’aide d’outils fidèles permet de générer des hologrammes échantillonnés à la façon d’un détecteur et de reconstruire les spécimens avec un grossissement. Par exemple, la reconstruction numérique de l’hologramme associé à la diffraction d’une bille de diamètre de 5 mm simulée via la méthode FDTD, et grossie selon un grandissement Gy = 20, est de 107.22 mm pour la méthode de propagation du spectre angulaire DFFT. La procédure proposée ouvre donc la voie à l’étude du champ diffracté utilisable dans un contexte d’holographie numérique, et ce pour des échantillons numériques pouvant modéliser des spécimens biologiques. D’ailleurs, le dispositif sans lentille mis sur pied à partir d’un coupleur de fibre optique offre une visibilité atteignant V = 0:8435 pour une configuration hors axe et cette dernière est limitée par le bruit cohérent de la source laser utilisée. L’étude du grossissement et de la résolution du dispositif montrent que le microscope holographique portatif est limité par l’échantillonnage du capteur utilisé, et ce, bien que la méthode d’indexation de zéros permette d’interpoler et de résoudre des détails plus fins que la taille d’un pixel pour la propagation DFFT. Finalement, l’appareil conçu est capable d’effectuer de l’imagerie de phase quantitative. L’épaisseur reconstruite d’une cible de verre (n = 1:52) est de 149±23 nm et concorde avec la valeur attendue de 150 nm. / ompact off-axis holographic lensless microscope capable of non-invasively imaging weakly scattering biological samples for on the field applications is designed. The technique allows to reconstruct both the phase and intensity of a sample-diffracted wavefront. The dimensioning of the proposed device depends on both the illumination shining the sample and the physical constraint associated with acquisition device. Hence, FDTD simulations are used in order to ascertain the smallest usable scattered field. Using proper propagation methods, the diffracted field is used to generate a numerical hologram emulating the sensor’s sampling rate. Such hologram is then numerically reconstructed in order to retrieve the object and compare it with the former. For instance, a 5 mm diameter bead diffraction field is obtained via FDTD simulation. As it is magnified by a factor Gy = 20, its reconstruction retrieves a magnified bead of 107.22 mm in diameter. The proposed pipeline thus paves the way for the study of modelled biological sample usable scattered field for holographic applications. Moreover, the proposed compact lensless device using an optical fiber coupler attains an off-axis visibility of V = 0:8435 as this last is limited by coherent noise. The study of the microscope attainable magnification and resolution shows that it is limited by the sampling rate of the used acquistion device, and that is, albeit zero-padding interpolation could provide smaller than a pixel size detail resolution for DFFT propagation. Lastly, the designed device is capable of quantitative phase imaging. The reconstructed thickness of a glass phase target (n = 1:52) is of d = 149±23 nm which is in good agreement with the expected value of 150 nm.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / L'objectif principal de ce projet de doctorat est de développer et de caractériser un agent de contraste pour la détection in vivo, en imagerie par résonance magnétique (IRM) pondérée en T₁; d'un groupe de cellules préalablement marquées in vitro. Le but de ce marquage est de visualiser et de suivre le développement de cellules après leur implantation dans un modèle préclinique et ce, en contraste "positif". Pour ce faire, la stratégie choisie pour cette thèse est de synthétiser des nanoparticules ultrafines (< 3 nm) d'oxyde de gadolinium recouvertes d'un ligand biocompatible. La première étape de ce projet consistait, après optimisation d'une synthèse de nanoparticules de Gd₂O₃ recouvertes de diéthylène glycol, à mener une expérience d'ingestion cellulaire avec des cellules de glioblastome multiforme de souris (GL-261). Le rehaussement du signal des cellules en IRM a été démontré après l'ingestion, tout comme la possibilité de les détecter après une implantation sur la membrane chorioallantoïque d'un oeuf de poulet fertilisé. Des études MET ont révélé que les particules s'accumulent et s'agrègent dans les endosomes cellulaires pendant l'ingestion. La seconde étape de la thèse a donc consisté à analyser in vitro, en milieu aqueux, l'impact de cette agrégation sur les propriétés relaxométriques des particules. Pour ce faire, des analyses MET, DLS et avec des relaxomètres à champs magnétiques variables ont été menées. Ces études ont démontré que l'agrégation influence les propriétés relaxométriques des suspensions de Gd₂O₃, surtout à champs magnétiques élevés (> 7 T, ou 300 MHz). Finalement, une synthèse alternative en une étape, recouvrant les nanoparticules de polyethylene glycol (PEG), a été développée afin de limiter l'agrégation. Les propriétés physicochimiques des particules de PEG-Gd₂O₃ (1,3 nm) ont été étudiées par MET, DLS, DRX, EDS, FTIR et ATG. Les relaxivités longitudinale et transverse mesurées à 1.41 T (60 MHz, 37°C, pH 5) ont été de 14,2 et 17,2 mM⁻¹s⁻¹. La performance de ce produit de contraste a été testée en injectant in vivo des cellules de glioblastome multiforme (F98) préalablement marquées. Les cellules implantées ont été visualisées en IRM et ont toutes développé des tumeurs cérébrales malignes en quelques jours. En conclusion, les nanoparticules développées auront permis de détecter efficacement des cellules implantées in vivo.

La détection et la caractérisation automatisée des cellules constituent un enjeu important dans de nombreux domaines de recherche tels que la cicatrisation, le développement de l'embryon et des cellules souches, l’immunologie, l’oncologie, l'ingénierie tissulaire et la découverte de nouveaux médicaments. Étudier le comportement cellulaire in vitro par imagerie des cellules vivantes et par le criblage à haut débit implique des milliers d'images et de vastes quantités de données. Des outils d'analyse automatisés reposant sur la vision numérique et les méthodes non-intrusives telles que la microscopie à contraste de phase (PCM) sont nécessaires. Comme les images PCM sont difficiles à analyser en raison du halo lumineux entourant les cellules et de la difficulté à distinguer les cellules individuelles, le but de ce projet était de développer des algorithmes de traitement d'image PCM dans Matlab® afin d’en tirer de l’information reliée à la morphologie cellulaire de manière automatisée. Pour développer ces algorithmes, des séries d’images de myoblastes acquises en PCM ont été générées, en faisant croître les cellules dans un milieu avec sérum bovin (SSM) ou dans un milieu sans sérum (SFM) sur plusieurs passages. La surface recouverte par les cellules a été estimée en utilisant un filtre de plage de valeurs, un seuil et une taille minimale de coupe afin d'examiner la cinétique de croissance cellulaire. Les résultats ont montré que les cellules avaient des taux de croissance similaires pour les deux milieux de culture, mais que celui-ci diminue de façon linéaire avec le nombre de passages. La méthode de transformée par ondelette continue combinée à l’analyse d'image multivariée (UWT-MIA) a été élaborée afin d’estimer la distribution de caractéristiques morphologiques des cellules (axe majeur, axe mineur, orientation et rondeur). Une analyse multivariée réalisée sur l’ensemble de la base de données (environ 1 million d’images PCM) a montré d'une manière quantitative que les myoblastes cultivés dans le milieu SFM étaient plus allongés et plus petits que ceux cultivés dans le milieu SSM. Les algorithmes développés grâce à ce projet pourraient être utilisés sur d'autres phénotypes cellulaires pour des applications de criblage à haut débit et de contrôle de cultures cellulaires. / Automated cell detection and characterization is important in many research fields such as wound healing, embryo development, immune system studies, cancer research, parasite spreading, tissue engineering, stem cell research and drug research and testing. Studying in vitro cellular behavior via live-cell imaging and high-throughput screening involves thousands of images and vast amounts of data, and automated analysis tools relying on machine vision methods and non-intrusive methods such as phase contrast microscopy (PCM) are a necessity. However, there are still some challenges to overcome, since PCM images are difficult to analyze because of the bright halo surrounding the cells and blurry cell-cell boundaries when they are touching. The goal of this project was to develop image processing algorithms to analyze PCM images in an automated fashion, capable of processing large datasets of images to extract information related to cellular viability and morphology. To develop these algorithms, a large dataset of myoblasts images acquired in live-cell imaging (in PCM) was created, growing the cells in either a serum-supplemented (SSM) or a serum-free (SFM) medium over several passages. As a result, algorithms capable of computing the cell-covered surface and cellular morphological features were programmed in Matlab®. The cell-covered surface was estimated using a range filter, a threshold and a minimum cut size in order to look at the cellular growth kinetics. Results showed that the cells were growing at similar paces for both media, but their growth rate was decreasing linearly with passage number. The undecimated wavelet transform multivariate image analysis (UWT-MIA) method was developed, and was used to estimate cellular morphological features distributions (major axis, minor axis, orientation and roundness distributions) on a very large PCM image dataset using the Gabor continuous wavelet transform. Multivariate data analysis performed on the whole database (around 1 million PCM images) showed in a quantitative manner that myoblasts grown in SFM were more elongated and smaller than cells grown in SSM. The algorithms developed through this project could be used in the future on other cellular phenotypes for high-throughput screening and cell culture control applications.

L’imagerie par résonance magnétique (IRM) est couramment utilisée en médecine pour obtenir des images anatomiques de haute résolution. L’IRM permet également de suivre la migration de cellules injectées in vivo. Dans ce contexte, un agent de contraste est nécessaire afin de clairement visualiser les cellules. Actuellement, les produits de contraste les plus utilisés en IRM clinique sont les chélates de gadolinium puisqu’ils permettent de rehausser le signal des tissus fortement vascularisés. Cependant, la majorité de ces composés ne sont que faiblement internalisés et retenus à l’intérieur des cellules. Afin de permettre un marquage cellulaire plus efficace, des nanoparticules d’oxyde de gadolinium (Gd2O3) ont récemment été développées. La première partie de ce projet de maîtrise consistait donc en l’utilisation de ces particules, revêtues de diéthylène glycol (Gd2O3-DEG), comme marqueur cellulaire. Une fois marquées avec ce produit, les cellules peuvent être visualisées en IRM, in vitro et in vivo (œuf de poulet fertilisé). Or, les particules de Gd2O3-DEG s’agglomèrent en solution aqueuse saline (milieu de culture) et à haute concentration, elles peuvent affecter la prolifération des cellules. De ce fait, la seconde partie de ce projet consistait à remplacer le DEG par du polyéthylène glycol (PEG) afin de conférer aux nanocristaux une meilleure stabilité et de diminuer leur cytotoxicité. Dans le cadre de cette maîtrise, le greffage de PEG a été réalisé à l’aide de trois polymères différents, soit le PEG-phosphate, le PEG-silane et le PEG diacide. Dans le but de déterminer le meilleur groupement chimique pouvant réagir avec le Gd2O3, ces polymères ont été greffés à la fois sur les particules et sur des films minces de Gd2O3. Différentes stratégies de greffage ont été élaborées avec les deux systèmes afin d’identifier les conditions de réaction optimales. Suite à ces expériences, les caractéristiques physico-chimiques des particules et des surfaces recouvertes de PEG ont été mesurées à l’aide de différentes techniques d’analyse. En somme, cette étude a permis de démontrer que le PEG-phosphate interagit plus fortement avec les nanomatériaux à base de Gd2O3 que les deux autres PEG. De plus, les particules de Gd2O3-PEG-phosphate possèdent des propriétés physico-chimiques et relaxométriques supérieures à tous les autres systèmes étudiés dans le cadre de ce projet (nanoparticules revêtues de DEG, de PEG-silane et de PEG diacide). Ces particules pourraient donc être considérées, dans le futur, comme agent de contraste pour l’IRM cellulaire et pourraient remplacer les produits employés à ce jour (principalement des nanoparticules d’oxyde de fer). / Magnetic resonance imaging (MRI) is widely used in medicine to achieve high resolution, in-depth anatomical images. MRI can also be used to detect cells injected in vivo and to track their migration. For this purpose, the cells cannot be clearly visualized in MRI without the use of contrast agents. Gadolinium (III) complexes are by far the most widely used contrast agents in clinical medicine because they provide a drastic enhancement of MRI signal in vascularized tissues. However, the vast majority of these chelates is poorly uptaken and retained into cells. In order to efficiently label cells, gadolinium oxide nanoparticles (Gd2O3) have been recently developed. Therefore, these particles, covered with diethylene glycol (DEG-Gd2O3), were used in the first part of this project to label cells. DEG-Gd2O3-labeled cells can be visualized in MRI, in vitro and in vivo (using the chicken embryo model). However, DEG-Gd2O3 particles aggregate in aqueous saline solution (cell culture medium) and at high concentration, they can impact on the cell proliferation. Molecules such as polyethylene glycol (PEG) can be used to remove DEG so as to improve the stability of the particles and to limit their cytotoxicity. In the course of this project, DEG-Gd2O3 particles were treated with three different polymers: PEG-phosphate, PEG-silane and PEG diacid. In order to determine the functional group that can react strongly with the rare-earth oxide, these polymers were grafted on both Gd2O3 particles and thin films. Different grafting methodologies were developed to identify the optimal reaction conditions. The physicochemical properties of the PEG-Gd2O3 particles and the PEG-treated surfaces were measured with different surface characterization techniques. In conclusion, this study shows that PEG-phosphate reacts more strongly with Gd2O3 nanomaterials compared to the other PEG derivatives. Moreover, PEG-phosphate-Gd2O3 particles have better physicochemical and relaxometric properties than all the other systems studied in this research project (particles covered with DEG, PEG-silane and PEG diacid). These particles might be considered in the future as a potential contrast agent for cellular MRI and could replace the products used currently (mainly iron oxides nanoparticles).

Afin de permettre l’application chez l’homme de nouvelles technologies médicales comme la thérapie cellulaire régénératrice, il est primordial d’être en mesure de localiser in vivo les cellules transplantées à l’intérieur d'un tissu. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) est une technique de choix en raison de son excellente résolution anatomique. Par contre, l’utilisation d’un agent de contraste est nécessaire afin de marquer et de suivre à la trace des cellules implantées puisque leur contraste intrinsèque les rend difficiles à distinguer des tissus environnants. Les agents à effet de contraste négatif tel que les oxydes de fer sont les plus souvent envisagés pour effectuer un suivi cellulaire in vivo. Un problème se pose lorsqu’il est question de quantification ou de localisation précise d’une implantation cellulaire. En effet, la présence d’un artéfact négatif excédant le volume qu’occupent les cellules nuit à la précision de la technique. Pour ces raisons, ce projet porte sur l’élaboration d’une méthodologie de marquage de cellules cancéreuses employant un agent de contraste d’IRM générant un contraste positif. Ce projet de recherche avait pour but d’évaluer le potentiel des nanoparticules d’oxyde de manganèse (MnO) et d’oxyde de gadolinium (Gd2O3) comme agents de contraste pour le marquage cellulaire. Des nanoparticules synthétisées par des collègues ont été utilisées dans le cadre de ce projet. Le projet de maîtrise décrit ici est constitué de trois volets : 1) le développement d’un protocole d’analyse élémentaire des éléments chimiques Mn et Gd dans des cellules marquées d’agent de contraste; 2) l’élaboration d’une procédure de quantification du signal généré par des cellules marquées par un agent de contraste paramagnétique; et 3) la démonstration de la possibilité de suivre in vivo par IRM, des cellules marquées. Ce projet a été ponctué de mesures de viabilité cellulaire ainsi que d’études de microscopie à transmission (MET) cellulaire, permettant de démontrer l’internalisation des agents de contraste dans les cellules. Les cellules marquées ont été visualisées en IRM sous forme de culots de cellules de différentes tailles, puis implantées par stéréotaxie chez des souris afin de réaliser un suivi de la prolifération des cellules in vivo. Ces études ont permis de mesurer le signal d’IRM généré par des cellules cancéreuses marquées de nanoparticules de MnO et de Gd2O3, en utilisant des séquences dites « pondérées en T1». Ces études montrent que les nanoparticules paramagnétiques permettent de détecter plusieurs dizaines de milliers de cellules implantées localement ( 20 000). Cette limite intrinsèque devrait être prise en compte dans les procédures d’implantation utilisant des marqueurs paramagnétiques à base de Gd et de Mn. / To allow the application of new medical technologies such as regenerative cell therapy to humans, it is essential to be able to localize the tissue-implanted cells in vivo. Magnetic resonance imaging (MRI) is a technique of choice because of its excellent anatomical resolution. On the other hand, use of a contrast agent is required to label and keep track of the implanted cells as their intrinsic contrasts make them difficult to distinguish from surrounding tissue. Negative contrast agents like iron oxides are the most often considered tracking cells in vivo. A problem appears when quantification or determination of the exact location of a cell implantation is needed. Indeed, the presence of a negative artifact far exceeding the volume occupied by the cells compromises the accuracy of the technique. For these reasons, this project focuses on developing a methodology to label cancer cells using a positive contrast agent for MRI. This research project aims at evaluating the potential of manganese oxide (MnO) and gadolinium oxide (Gd2O3) nanoparticles as contrast agents for cell labeling. Nanoparticles synthesized by co-workers were used in this project. The master's project described here consists of three (3) components: 1) development of a valid protocol of elemental analysis of Mn and Gd quantification in labeled cells, 2) development of a procedure for quantification of the MRI signal generated by cells labeled with paramagnetic contrast agent, and 3) demonstrating of the in vivo track ability by MRI, cells labeled with a paramagnetic agent. This project was punctuated by measures of cell viability and cell visualisation by transmission electron microscopy (TEM), to demonstrate the internalization of contrast agents into cells. The labeled cells were visualized by MRI in the form of cell pellets of various sizes, and implanted in mice by stereotactic methods to achieve a monitoring of cell proliferation in vivo. These studies measure the MRI signal generated by cancer cells labeled by MnO and Gd2O3 nanoparticles, using "T1 weighted" sequences. These studies show that paramagnetic nanoparticles can detect tens of thousands of locally implanted cells ( 20 000). This inherent limit should be taken into account in the settlement procedures using Gd and Mn based labels.