La migration des cellules endothéliales est une des étapes nécessaires à l'angiogenèse physiologique et tumorale. Le facteur pro-angiogénique VEGF (vascular endothelial growth factor) induit la réorganisation du cytosquelette d'actine en fibres de tension et la migration cellulaire en activant la kinase de stress SAPK2/p38 via le récepteur à activité tyrosine kinase VEGFR-2. Nous avons étudié les événements moléculaires suivant l'activation du récepteur du VEGF et menant à l'activation de la voie SAPK2/p38 dans les cellules endothéliales. La tyrosine 1214 en C-terminal du VEGFR-2 est un site majeur d'autophosphorylation nécessaire à l'activation de SAPK2/p38 par le VEGF dans les cellules endothéliales. Le résidu phospho-tyrosine 1214 permet le recrutement de la protéine adaptatrice Nck via son domaine SH2. De plus, l'activation de Fyn, une kinase de la famille Src, mais non c-Src même, dépend de la phosphorylation de la tyrosine 1214. L'utilisation d'un dominant négatif de Fyn empêche l'activation de SAPK2/p38, inhibe la formation de fibres de tension et abolit la migration endothéliale. Nck et Fyn s'associent en réponse au VEGF et l'activité de Fyn est nécessaire à la phosphorylation sur tyrosine de Nck et de la kinase PAK-2. La formation de fibres de tension nécessite aussi l'activation de la petite GTPase Cdc42, ce qui permet d'acheminer le signal du VEGF vers SAPK2/p38, sa cible physiologique MAPKAP K2, puis vers l'actine. Ces résultats suggèrent une séquence d'étapes moléculaires précoces suivant l'activation du VEGFR-2 et régulant la dynamique d'actine nécessaire à la migration endothéliale. 11 s'agit de la première description d'une séquence d'événements couplant l'activation d'un récepteur à activité tyrosine kinase à celle d'une kinase de stress. Par ailleurs, l'identification du rôle du site tyrosine 1214 du VEGFR-2 en fait une cible précise pour le développement d'une drogue anti-angiogénique. / Endothelial cell migration is one major step of physiological and pathological angiogenesis. The vascular endothelial growth factor (VEGF) is a potent regulator of angiogenesis and induces actin reorganization into stess fibers and cell migration via activation of SAPK2/p38 downstream of the tyrosine kinase receptor VEGFR-2. We studied the molecular events following the activation of the VEGF-receptor that lead to the activation of the SAPK2/p38 pathway in endothelial cells. The tyrosine 1214 residue in C-terminal of the VEGFR-2 is a major autophosphorylation site that is required for the activation of SAPK2/p38 by VEGF in endothelial cells. The adaptor protein Nck is recruited to the phospho-tyrosine 1214 residue via its SH2 domain. Moreover, the activation of the Src-family kinase Fyn, but not c-Src itself, depends on phospho-tyrosine 1214. A dominant negative form of Fyn inhibits SAPK2/p38 activation, stress fibers formation and endothelial cell migration. Nck and Fyn associate in response to VEGF and Fyn activity is required for the tyrosine-phosphorylation of Nck and PAK-2. The activation of the small Rho GTPase Cdc42 downstream of tyrosine 1214 is also required for the activation of SAPK2/p38, its physiological target MAPKAP K2, and stress fiber formation. Altogether, these results suggest a sequence of early molecular steps following VEGFR-2 activation by VEGF that regulate the actin dynamics required for endothelial cell migration. This is the first description of a sequence of events that couple the activation of a tyrosine kinase receptor to that of a stress-activated kinase. The identification of the role of the tyrosine 1214 residue on VEGFR-2 makes it an appealing target for the development of an anti-angiogenic therapy.

Titre de l'écran-titre (visionné le 16 janvier 2024)

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / La migration des cellules endothéliales est une étape nécessaire à l'angiogenèse. Le facteur pro-angiogénique VEGF {vascular endothelial growth factor) induit la réorganisation du cytosquelette d'actine en fibres de tension et la migration cellulaire en activant la stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38 : p38) via le VEGFR-2 (vascular endothelial growth factor receptor-2). Cette étude vise à identifier puis à caractériser les fonctions des cibles de p38 dans les cellules endothéliales activées par le VEGF. Suite à une électrophorèse bi-dimensionnelle et à une analyse par spectrométrie de masse, nous avons isolé l'annexine 1 (ANXA1) comme une protéine dont la phosphorylation est induite par le VEGF et est diminuée en inhibant p38. L'ANXAl a d'abord été caractérisée comme une protéine qui module l'action anti-inflammatoire des glucocorticoïdes en inhibant la phospholipase A2. En outre, plusieurs études indiquent que l'ANXAl joue un rôle dans la prolifération et la différenciation cellulaires et qu'elle interagit avec des protéines du cytosquelette comme la tubuline et l'actine. Après avoir identifié l'ANXAl en aval de p38 nous avons caractérisé ses fonctions ainsi que la kinase responsable de sa phosphorylation. En utilisant des essais de phosphorylation in vitro et in vivo, nous avons montré que la MAPKAP kinase-2 activée par le VEGF régule la phosphorylation de l'ANXAl en aval de p38. Dans les cellules non stimulées, l'annexine 1 est prédominante dans le noyau, tandis que lorsque les cellules endothéliales sont stimulées au VEGF, elle se déplace du noyau vers le cytoplasme où elle co-localise avec l'actine F dans les lamellipodes. L'inhibition de la translocation par le SB203580 et la leptomycine B suggère qu'elle nécessite une phosphorylation et le système cargo CRM1. De plus, la migration cellulaire est inhibée à la suite du knockdown de l'ANXAl par l'utilisation d'un ARNi ciblant l'ARNm de la protéine. En outre, la migration cellulaire et la tubulogenèse initiées par le VEGF sont inhibées à la suite du knockdown de l'ANXAl. En conclusion, nos résultats suggèrent que la phosphorylation de l'ANXAl régule l'effet angiogénique associé à l'activation de la voie de signalisation p38/MAPKAP kinase-2 par le VEGF.

L’imagerie par résonance magnétique (IRM) est couramment utilisée en médecine pour obtenir des images anatomiques de haute résolution. L’IRM permet également de suivre la migration de cellules injectées in vivo. Dans ce contexte, un agent de contraste est nécessaire afin de clairement visualiser les cellules. Actuellement, les produits de contraste les plus utilisés en IRM clinique sont les chélates de gadolinium puisqu’ils permettent de rehausser le signal des tissus fortement vascularisés. Cependant, la majorité de ces composés ne sont que faiblement internalisés et retenus à l’intérieur des cellules. Afin de permettre un marquage cellulaire plus efficace, des nanoparticules d’oxyde de gadolinium (Gd2O3) ont récemment été développées. La première partie de ce projet de maîtrise consistait donc en l’utilisation de ces particules, revêtues de diéthylène glycol (Gd2O3-DEG), comme marqueur cellulaire. Une fois marquées avec ce produit, les cellules peuvent être visualisées en IRM, in vitro et in vivo (œuf de poulet fertilisé). Or, les particules de Gd2O3-DEG s’agglomèrent en solution aqueuse saline (milieu de culture) et à haute concentration, elles peuvent affecter la prolifération des cellules. De ce fait, la seconde partie de ce projet consistait à remplacer le DEG par du polyéthylène glycol (PEG) afin de conférer aux nanocristaux une meilleure stabilité et de diminuer leur cytotoxicité. Dans le cadre de cette maîtrise, le greffage de PEG a été réalisé à l’aide de trois polymères différents, soit le PEG-phosphate, le PEG-silane et le PEG diacide. Dans le but de déterminer le meilleur groupement chimique pouvant réagir avec le Gd2O3, ces polymères ont été greffés à la fois sur les particules et sur des films minces de Gd2O3. Différentes stratégies de greffage ont été élaborées avec les deux systèmes afin d’identifier les conditions de réaction optimales. Suite à ces expériences, les caractéristiques physico-chimiques des particules et des surfaces recouvertes de PEG ont été mesurées à l’aide de différentes techniques d’analyse. En somme, cette étude a permis de démontrer que le PEG-phosphate interagit plus fortement avec les nanomatériaux à base de Gd2O3 que les deux autres PEG. De plus, les particules de Gd2O3-PEG-phosphate possèdent des propriétés physico-chimiques et relaxométriques supérieures à tous les autres systèmes étudiés dans le cadre de ce projet (nanoparticules revêtues de DEG, de PEG-silane et de PEG diacide). Ces particules pourraient donc être considérées, dans le futur, comme agent de contraste pour l’IRM cellulaire et pourraient remplacer les produits employés à ce jour (principalement des nanoparticules d’oxyde de fer). / Magnetic resonance imaging (MRI) is widely used in medicine to achieve high resolution, in-depth anatomical images. MRI can also be used to detect cells injected in vivo and to track their migration. For this purpose, the cells cannot be clearly visualized in MRI without the use of contrast agents. Gadolinium (III) complexes are by far the most widely used contrast agents in clinical medicine because they provide a drastic enhancement of MRI signal in vascularized tissues. However, the vast majority of these chelates is poorly uptaken and retained into cells. In order to efficiently label cells, gadolinium oxide nanoparticles (Gd2O3) have been recently developed. Therefore, these particles, covered with diethylene glycol (DEG-Gd2O3), were used in the first part of this project to label cells. DEG-Gd2O3-labeled cells can be visualized in MRI, in vitro and in vivo (using the chicken embryo model). However, DEG-Gd2O3 particles aggregate in aqueous saline solution (cell culture medium) and at high concentration, they can impact on the cell proliferation. Molecules such as polyethylene glycol (PEG) can be used to remove DEG so as to improve the stability of the particles and to limit their cytotoxicity. In the course of this project, DEG-Gd2O3 particles were treated with three different polymers: PEG-phosphate, PEG-silane and PEG diacid. In order to determine the functional group that can react strongly with the rare-earth oxide, these polymers were grafted on both Gd2O3 particles and thin films. Different grafting methodologies were developed to identify the optimal reaction conditions. The physicochemical properties of the PEG-Gd2O3 particles and the PEG-treated surfaces were measured with different surface characterization techniques. In conclusion, this study shows that PEG-phosphate reacts more strongly with Gd2O3 nanomaterials compared to the other PEG derivatives. Moreover, PEG-phosphate-Gd2O3 particles have better physicochemical and relaxometric properties than all the other systems studied in this research project (particles covered with DEG, PEG-silane and PEG diacid). These particles might be considered in the future as a potential contrast agent for cellular MRI and could replace the products used currently (mainly iron oxides nanoparticles).

La malignité des astrocytomes est établie sur base de critères morphologiques définis au sein de la classification de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS). Ce système de gradation, qui s’échelonne de I à IV, constitue actuellement l’outil pronostique le plus fiable. Par facilité, les cliniciens regroupent les astrocytomes de grade I (astrocytomes pilocytiques) et les astrocytomes diffus de grade II sous le terme d’« Astrocytomes de bas-grade » par opposition aux astrocytomes de haut-grade, constitués des astrocytomes anaplasiques (grade III) et des glioblastomes (GBM ;grade IV). Cette terminologie conduit à des prises en charge cliniques inadéquates car elle englobe des tumeurs très différentes en terme d’agressivité :les astrocytomes de grade I, majoritairement non infiltrants, non évolutifs et indolents et les astrocytomes diffus de grade II, toujours infiltrants et évolutifs, progressant systématiquement en astrocytomes de haut-grade et entraînant le plus souvent le décès prématuré du patient. Bien que ces tumeurs soient définies par la classification de l’OMS comme des entités clinicopathologiques distinctes, peu de données sont disponibles dans la littérature pour expliquer leurs particularités biologiques et la pratique quotidienne montre que les différencier peut être difficile. <p><p>Le but des études entreprises au cours de ce travail de thèse est d’apporter une contribution à la compréhension des mécanismes de tumorigenèse qui différencient l’astrocytome de grade I des astrocytomes diffus (grade II-IV), de manière à identifier des voies biologiques qui permettraient, au moins en partie, d’expliquer ces différences de comportement. <p><p>Au cours de la première partie de ce travail, nous avons caractérisé les profils d’expression génomique des astrocytomes de grade I et de grade II, en comparant les données d’expression de gènes (évaluées par des technologies de micropuces d’ADN) de travaux publiés entre 2000 et 2005. L’expression des gènes identifiés a été validée par des analyses de RT-PCR quantitative sur une série indépendante d’astrocytomes de grade I, II et IV. Les fonctions biologiques des protéines codées par chacun de ces gènes ont fait l’objet de recherches bibliographiques détaillées afin de proposer un modèle permettant d’approcher les différences de comportement de ces tumeurs. Cette analyse nous a permis d’identifier TIMP4 (tissue inhibitor of metalloproteinases 4) et IGFBP2 (insulin-like growth factor binding protein 2) comme gènes candidats pour améliorer la caractérisation biologique et clinique des astrocytomes de grade I par rapport aux astrocytomes diffus. TIMP4 et IGFBP2 codent respectivement pour un inhibiteur endogène des métalloprotéinases matricielles (MMPs) et une protéine de liaison capable d’inhiber l’action des « insulin-like growth factors » (IGFs, dont IGFI et IGFII), des facteurs impliqués dans la croissance et la migration des astrocytes normaux et tumoraux. <p><p>Sur base de la surexpression de TIMP4 et d’IGFBP2 dans les astrocytomes de grade I, en comparaison aux astrocytomes diffus de grade II, nous avons posé l’hypothèse suivante :« L’absence d’agressivité des astrocytomes de grade I, en comparaison aux astrocytomes diffus (grade II-IV) pourrait en partie être liée à l’inhibition par TIMP-4 de la protéolyse des complexes IGFBP2-IGFII au sein de ces tumeurs ». Cette protéolyse, qui diminue l’affinité d’IGFBP2 pour IGFII, pourrait contribuer à libérer IGFII dans la matrice extracellulaire (MEC), favoriser la liaison d’IGFII à son récepteur IGF-IR et stimuler la croissance et la migration des cellules astrocytaires tumorales. Pour tester cette hypothèse, nous avons réalisé différentes analyses biochimiques afin i) de caractériser les actions protéolytiques de MMP-2, MMP-9 et MT1-MMP sur le complexe IGFBP2-IGFII, ii) d’identifier la libération d’IGFII lors du clivage de ce complexe, et iii) d’étudier l’action inhibitrice de TIMP-4. A l’aide d’un modèle cellulaire in vitro (lignée astrocytaire tumorale LN229), nous avons ensuite observé l’influence de la protéolyse du complexe IGFBP2-IGFII sur la croissance et la motilité cellulaire. Cette étude a montré :(1) la protéolyse du complexe IGFBP2-IGFII par MMP-9, (2) l’inhibition partielle de cette protéolyse par TIMP-4, (3) la libération d’IGFII résultant de cette protéolyse et (4) les effets stimulants de la libération d’IGFII sur la croissance et la motilité des cellules LN229. Cette étude souligne le rôle important de la protéolyse des complexes IGFBP2-IGFII dans l’agressivité des astrocytomes diffus. Elle confirme les effets stimulants propres d’IGFII, d’IGFBP2 et de MMP-9 sur la motilité et/ou la croissance des cellules astrocytaires tumorales. Enfin, elle identifie un rôle inhibiteur potentiel de TIMP-4 sur la protéolyse du complexe IGFBP2-IGFII, qui pourrait contribuer à expliquer le caractère plus indolent des astrocytomes de grade I en comparaison aux astrocytomes diffus.<p><p>\ / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished