Les adénovirus (Ad) sont parmi les vecteurs les plus utilisés en thérapie génique. Cependant, les données d’essais pré-Cliniques et cliniques ont montré qu’ils induisaient une forte toxicité hépatique consécutive à leur tropisme hépatique, une réponse inflammatoire et une forte thrombocytopénie. Différents travaux avaient montré que l’interaction de l’Ad avec le facteur de la coagulation X (FX).était responsable de la transduction in vivo des hépatocytes après administration systémique des vecteurs Ad. Cependant, des résultats précédents du laboratoire avaient montré également que le pseudotypage d’une autre protéine de capside, la fibre, permettait de réduire la transduction hépatique. Dans le but de mieux comprendre le rôle de la fibre dans le tropisme et la toxicité des Ad, nous avons comparé des Ad recombinants pseudotypés pour tout (tige et tête de la fibre : AdF3) ou partie (tige : AdS3K5) de la fibre Ad3 avec un Ad5 à capside non modifiée (Adwt). Après administration systémique chez la souris, l’AdF3 et l’AdS3K5 induisent une plus faible expression du transgène dans le foie et la rate comparativement à l’Ad5wt. Cette réduction ne résulte ni d’un défaut de capture de ces vecteurs dans le foie ni de leur incapacité à utiliser le FX. Cependant, nos résultats ont révélé que les Ad pseudotypés par la fibre Ad3 étaient capturés de façon plus importante par les cellules de Kupffer. Nous avons montré que cette capture était une propriété intrinsèque de la fibre Ad3 puisqu’elle était observée également après administration systémique d’un Ad de sérotype 3. De façon intéressante, les Ad pseudotypés par la fibre Ad3 restent capables de transférer des gènes dans les tumeurs aussi efficacement que l’Adwt.Dans la deuxième partie de nos travaux, nous avons cherché à mieux comprendre les mécanismes de la thrombocytopénie consécutive à l’administration d’Ad. Nous avons défini la cinétique de la thrombocytopénie ainsi que l’effet de la dose virale. Nous avons montré que certains facteurs de l’hôte comme les facteurs de la coagulation ou la rate n’étaient pas impliqués dans la thrombocytopénie. De façon intéressante, nous avons montré que la fibre Ad5 jouait un rôle dans l’induction de la baisse plaquettaire puisque l’administration des virus à fibre Ad3 n’induisait plus de forte baisse plaquettaire. Parallèlement, nous avons observé un profil inflammatoire associé à l’administration des Ad à fibre modifiée beaucoup plus réduit que celui de l’Adwt. Nos travaux en cours évaluent l’existence possible d’une corrélation entre la production de cytokines/chimiokines et la thrombocytopénie.L’ensemble de ces résultats montre que le pseudotypage des Ad5 par la fibre de l’Ad3 permet de réduire leur toxicité et de limiter la réponse inflammatoire tout en conservant un transfert de gènes efficace dans les tumeurs. L’introduction de ce type de modification de capside dans les Ad oncolytiques devrait permettre de conserver leur capacité à se répliquer dans les tumeurs tout en limitant les toxicités liées à leur dissémination par voie systémique. / To date adenoviruses (Ad) are the most used vectors in gene therapy. However, Ad use is hampered by a strong liver tropism that leads to hepatotoxicity, a strong inflammatory response and the induction of thrombocytopenia. Binding of Ad hexon to coagulation factor X (FX) is responsible for hepatocyte transduction in vivo. As a consequence, mutation of hexon protein abrogates Ad interaction with FX and reduces liver transduction. However, previous results of our lab have demonstrated that Ad5 pseudotyping with fiber Ad3 also resulted in significant reduction of liver transduction. To understand how fiber modification affects in vivo Ad tropism, we used two pseudotyped viruses with whole (AdF3) or only the shaft (AdS3K5) of Ad3 fiber.Following systemic delivery of fiber-Modified Ads, a reduced transduction was observed 2 days p.i. in liver and spleen. This reduction was not due to the impairment of fiber-Modified Ads liver entry or FX use in vivo. Remarkably, after Kupffer cells depletion, a restored transgene expression level was observed, suggesting that fiber-Modified Ads are strongly uptaken by Kupffer cells. We have demonstrated that this strong uptake is an Ad3 intrinsic property since Ad3 was also strongly uptaken by Kupffer cells. Interestingly, fiber-Modified Ads transduce tumours as efficiently as Ad5. In the second part of this work, we aimed to better understand the mechanism of Ad-Induced thrombocytopenia. We first defined the kinetic and dose-Dependence of Ad-Induced thrombocytopenia. Then, we have shown that factors of the host such as the coagulation factors and the spleen were not involved in the thrombocytopenia development. Interestingly, we demonstrated o role for Ad5 in this platelet count reduction since fiber-Modified Ad induced only a modest thrombocytopenia. In parallel, we have observed a reduced production of inflammatory cytokine and chemokine following fiber-Modified Ad administration. Experiments are ongoing to investigate a possible correlation between inflammatory responses and thrombocytopenia. Altogether, our findings demonstrate that Ad5 pseudotyping with Ad3 fiber allows à reduced toxicity and inflammatory response while tumour transduction efficacy is remained. Therfore, oncolytic Ad pseudotyped with Ad3 fiber might be potent tool in tumor virotherapy while limiting risk of toxicity.

La NAFLD (non alcoholic fatty liver disease) ou stéatopathie dysmétabolique est la manifestation hépatique du syndrome métabolique. Elle regroupe l’ensemble des lésions hépatiques liées à l’obésité en dehors de toute consommation d’alcool : la stéatose, la NASH (non alcoholic steatohepatitis), la fibrose, la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Les systèmes immunitaires inné et adaptatif participent activement à la pathologie. J’ai étudié deux axes : l’axe du récepteur des glucocorticoïdes-GILZ dans les cellules de Kupffer et CXCR4-CXCL12 dans les lymphocytes T CD4+.Les cellules de Kupffer (CK) jouent un rôle clé dans la pathologie de la NASH. GILZ (glucocorticoid induced leucine zipper) est exprimé par les monocytes/macrophages et est sous le contrôle du récepteur aux glucocorticoïdes (GR). De plus, GILZ intervient dans l’inhibition des processus inflammatoires. J’ai montré que l’obésité entraîne une diminution de l’expression du GR et de GILZ dans les CK. En utilisant du RU486, un antagoniste spécifique du GR, j’ai prouvé que la diminution de l’expression du GR entraîne la diminution de l’expression de GILZ et sensibilise les CK au LPS. Ce mécanisme joue un rôle déterminant dans le développement de l’inflammation hépatique au cours de l’obésité, en modulant la réponse inflammatoire des CK. Le recrutement de cellules inflammatoires dans le foie est un élément clé de la progression de la NASH. Les lymphocytes T CD4+ issus de souris obèses ont des propriétés chimiotactiques accrues dépendantes de CXCR4. J’ai montré que la NASH augmente les propriétés migratoires dépendantes de CXCR4 des lymphocytes T CD4+ chez l’homme et la souris dans trois modèles murins de NASH. Le traitement de souris obèses par de l’AMD3100, un antagoniste de CXCR4, permet de diminuer le recrutement hépatique de lymphocytes. L’augmentation du chimiotactisme des lymphocytes T CD4+ n’était pas dû, ni à une augmentation de l’expression de CXCR4 et CXCR7, ni même de CXCL12 au niveau du foie. J’ai montré que ce mécanisme dépendait de l’augmentation de l’affinité de CXCR4 pour CXCL12.Ainsi, j’ai mis en évidence deux axes participant à l’inflammation hépatique au cours de l’obésité. Ces axes représentent de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. / NAFLD (non alcoholic fatty liver disease) is the hepatic manifestation of metabolic syndrome. It encompasses the entire spectrum of obesity-related liver lesions : steatosis, NASH (non alcoholic steatohepatitis), fibrosis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Innate and adaptative immune systems participate actively to the pathophysiology.I studied two axis : the glucocorticoid receptor-GILZ axis in Kupffer cells and CXCR4-CXCL12 in CD4+ T lymphocytes.Kupffer cells (KC) play a key role in pathophysiology of NASH. GILZ (glucocorticoid induced leucine zipper) is expressed by monocytes/macrophages and is under the control of glucocorticoid receptor (GR). Moreover, GILZ takes part in inhibition of inflammatory processes. I showed that obesity induces a decreased expression of GR and GILZ in KC. Using RU486, a GR antagonist, I proved that decreased expression of GR induces the decreased expression of GILZ and sensitize KC to LPS. This mechanism plays a decisive role in initiation of liver inflammation in obesity, modulating inflammatory response of KC. In obese mice, recruitment of inflammatory cells into the liver is a key element in the progression of NASH. CD4+ T lymphocytes from obese mice have enhanced CXCR4-dependent chemotactic properties. I showed that NASH enhances CXCR4-dependent chemotactic properties of CD4+ T lymphocytes in patients and in three mouse models of NASH. Obese mice treatment with AMD3100, a CXCR4 antagonist, decreases lymphocytes recruitement into the liver. Enhanced chemotactic properties of CD4+ T lymphocytes were not due to increased expressions of nor CXCR4 and CXCR7, neither CXCL12 in the liver. I showed that this mechanism was dependent of an increased affinity of CXCR4 to CXCL12.Therefore, I highlighted two axis participating to obesity-related liver inflammation. These axis represent new potential therapeutic targets.

Le virus de l’hépatite murine de type 3 (MHV3) est un excellent modèle animal pour l’étude des différents désordres immunologiques lors d’infections virales. L’hépatite aiguë fulminante induite par ce virus chez la souris susceptible C57BL/6 se caractérise par la présence de plusieurs foyers nécrotiques et inflammatoires dans le foie associée à une immunodéficience en lymphocytes B et T, tuant les souris entre 3 et 5 jours post-infection. L’évolution rapide de cette maladie virale suggère un débalancement dans les mécanismes de l’immunité naturelle sous le contrôle des cellules NK et NK-T et un bris de l’équilibre entre la tolérance hépatique et la réponse inflammatoire. Afin d’élucider les rôles respectifs des différents mécanismes de la défense innée impliqués dans le développement de l’hépatite aiguë, des infections in vivo ont été réalisées chez des souris C57BL/6 avec la souche pathogène L2-MHV3 ou avec des variants du virus MHV3. Ces derniers possèdent des tropismes différents pour les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques et les cellules de Kupffer, tels que les virus faiblement atténué 51.6-MHV3, fortement atténué CL12-MHV3 et non pathogène YAC-MHV3. Ces études in vivo ont montré une diminution des cellules NK spléniques et myéloïdes suite à une infection avec le virus MHV3. Cette chute en cellules NK spléniques reflète un recrutement de ces cellules au niveau du foie. Par contre, les cellules NK se sont avérées permissives à la réplication virale entraînant un processus d’apoptose suite à la formation de syncétia induits par le virus. Les niveaux de recrutement et d’apoptose des cellules NK et NK-T dans le foie reflètent la pathogénicité des variants MHV3 durant les trois premiers jours de l’infection virale bien que les cellules NK recrutées au niveau du foie maintiennent leur activité cytotoxique. L’ajout des IL-12 et IL-18, qui sont normalement diminués lors de l’hépatite aiguë, provoque une production synergique d’IFN-g par les cellules NK, résultant d’une interaction entre l’activation de la voie p38 MAPK et la réplication virale. Par ailleurs, le récepteur viral CEACAM1a (carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1a) serait essentiel à cette synergie, mais exercerait aussi une action inhibitrice dans la production de l’IFN-g. D’autre part, les niveaux de production des cytokines immunosuppressives IL-10, TGF-b et PGE2, impliquées dans la tolérance hépatique et particulièrement produites par les cellules de Kupffer et les cellules endothéliales sinusoïdales, sont en relation inverse avec le degré de pathogénicité des variants du virus MHV3. Finalement, le virus pathogène L2-MHV3 déclenche la production de cytokines inflammatoires par les macrophages, tels que l’IL-6 et le TNF-a. L’induction de ces cytokines par les macrophages serait indépendante de la présence de la molécule CEACAM1a. Cette stimulation est plutôt reliée à la fixation des particules virales sur des récepteurs TLR2, en association avec les régions riches en héparanes sulfates. Tous ces résultats mettent en évidence de nouveaux mécanismes par lesquels le virus MHV3 peut diminuer l’efficacité des mécanismes de l’immunité naturelle sous le contrôle des cellules NK et NK-T intrahépatiques, suite à une stimulation de l’inflammation résultant du bris de la tolérance hépatique. / Mouse hepatitis virus type 3 (MHV3) is an excellent model to study immunological disorders related to viral infections. The fulminant acute hepatitis induced in susceptible C57BL/6 mice is characterized by the presence of necrotic and inflammatory foci in the liver associated with B and T cell immunodeficiencies leading to the death of the animals in 3 to 5 days post-infection. The fulminance of this viral infection suggests a deficiency in the natural immunity mechanisms under control of NK and NK-T cells and an imbalance between the hepatic tolerance and the inflammatory responses. To understand the different mechanisms involved in the acute hepatitis, in vivo infections have been done in C57BL/6 mice with either the pathogenic L2-MHV3, or with its attenuated variants: the weak attenuated 51.6-MHV3, the highly attenuated CL12-MHV3 or the non-pathogenic YAC-MHV3 viruses, possessing different tropisms for liver sinusoidal endothelial cells and Kupffer cells. The results demonstrate that splenic and myeloid NK cells are impaired during a MHV3 infection. This impairment is due to a recruitment of these cells in the liver and a virus-induced apoptotic phenomenon. The recruitment and the subsequent apoptosis of NK and NK-T cells during the first three days of infection are in relation with the pathogenicity of the MHV3 variants. In spite of the fact that hepatic recruited NK cells are still cytotoxic, these cells undergo apoptosis due to viral replication via the formation of syncytia. Addition of IL-12 and IL-18, which are impaired during the acute hepatitis, promote a synergistic IFN-g production by NK cells depending of both the p38 MAPK pathway and the viral replication. Moreover, the specific viral receptor CEACAM1a (carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1a) is essential for this response but also exerts an inhibitory action. Levels of the immunosuppressive cytokines IL-10, TGF-b and PGE2, mainly produced by Kupffer cells and sinusoidal endothelial cells, and implicated in the natural hepatic tolerance, are in inverse correlation with the pathogenicity of the MHV3 variants. Finally, viral infection promotes the secretion of IL-6 and TNF-a by macrophages, triggered by the fixation of viral particules to TLR2 and heparan sulfate receptors rather than the engagement of CEACAM1a receptor and viral replication. In conclusion, our results suggest new mechanisms by which the MHV3 virus disturbs the innate immunity under control of NK and NK-T cells, as well as the cytokines involved in the hepatic tolerance to the detriment of the inflammatory response.

Le virus de l’hépatite murine de type 3 (MHV3) est un excellent modèle animal pour l’étude des différents désordres immunologiques lors d’infections virales. L’hépatite aiguë fulminante induite par ce virus chez la souris susceptible C57BL/6 se caractérise par la présence de plusieurs foyers nécrotiques et inflammatoires dans le foie associée à une immunodéficience en lymphocytes B et T, tuant les souris entre 3 et 5 jours post-infection. L’évolution rapide de cette maladie virale suggère un débalancement dans les mécanismes de l’immunité naturelle sous le contrôle des cellules NK et NK-T et un bris de l’équilibre entre la tolérance hépatique et la réponse inflammatoire. Afin d’élucider les rôles respectifs des différents mécanismes de la défense innée impliqués dans le développement de l’hépatite aiguë, des infections in vivo ont été réalisées chez des souris C57BL/6 avec la souche pathogène L2-MHV3 ou avec des variants du virus MHV3. Ces derniers possèdent des tropismes différents pour les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques et les cellules de Kupffer, tels que les virus faiblement atténué 51.6-MHV3, fortement atténué CL12-MHV3 et non pathogène YAC-MHV3. Ces études in vivo ont montré une diminution des cellules NK spléniques et myéloïdes suite à une infection avec le virus MHV3. Cette chute en cellules NK spléniques reflète un recrutement de ces cellules au niveau du foie. Par contre, les cellules NK se sont avérées permissives à la réplication virale entraînant un processus d’apoptose suite à la formation de syncétia induits par le virus. Les niveaux de recrutement et d’apoptose des cellules NK et NK-T dans le foie reflètent la pathogénicité des variants MHV3 durant les trois premiers jours de l’infection virale bien que les cellules NK recrutées au niveau du foie maintiennent leur activité cytotoxique. L’ajout des IL-12 et IL-18, qui sont normalement diminués lors de l’hépatite aiguë, provoque une production synergique d’IFN-g par les cellules NK, résultant d’une interaction entre l’activation de la voie p38 MAPK et la réplication virale. Par ailleurs, le récepteur viral CEACAM1a (carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1a) serait essentiel à cette synergie, mais exercerait aussi une action inhibitrice dans la production de l’IFN-g. D’autre part, les niveaux de production des cytokines immunosuppressives IL-10, TGF-b et PGE2, impliquées dans la tolérance hépatique et particulièrement produites par les cellules de Kupffer et les cellules endothéliales sinusoïdales, sont en relation inverse avec le degré de pathogénicité des variants du virus MHV3. Finalement, le virus pathogène L2-MHV3 déclenche la production de cytokines inflammatoires par les macrophages, tels que l’IL-6 et le TNF-a. L’induction de ces cytokines par les macrophages serait indépendante de la présence de la molécule CEACAM1a. Cette stimulation est plutôt reliée à la fixation des particules virales sur des récepteurs TLR2, en association avec les régions riches en héparanes sulfates. Tous ces résultats mettent en évidence de nouveaux mécanismes par lesquels le virus MHV3 peut diminuer l’efficacité des mécanismes de l’immunité naturelle sous le contrôle des cellules NK et NK-T intrahépatiques, suite à une stimulation de l’inflammation résultant du bris de la tolérance hépatique. / Mouse hepatitis virus type 3 (MHV3) is an excellent model to study immunological disorders related to viral infections. The fulminant acute hepatitis induced in susceptible C57BL/6 mice is characterized by the presence of necrotic and inflammatory foci in the liver associated with B and T cell immunodeficiencies leading to the death of the animals in 3 to 5 days post-infection. The fulminance of this viral infection suggests a deficiency in the natural immunity mechanisms under control of NK and NK-T cells and an imbalance between the hepatic tolerance and the inflammatory responses. To understand the different mechanisms involved in the acute hepatitis, in vivo infections have been done in C57BL/6 mice with either the pathogenic L2-MHV3, or with its attenuated variants: the weak attenuated 51.6-MHV3, the highly attenuated CL12-MHV3 or the non-pathogenic YAC-MHV3 viruses, possessing different tropisms for liver sinusoidal endothelial cells and Kupffer cells. The results demonstrate that splenic and myeloid NK cells are impaired during a MHV3 infection. This impairment is due to a recruitment of these cells in the liver and a virus-induced apoptotic phenomenon. The recruitment and the subsequent apoptosis of NK and NK-T cells during the first three days of infection are in relation with the pathogenicity of the MHV3 variants. In spite of the fact that hepatic recruited NK cells are still cytotoxic, these cells undergo apoptosis due to viral replication via the formation of syncytia. Addition of IL-12 and IL-18, which are impaired during the acute hepatitis, promote a synergistic IFN-g production by NK cells depending of both the p38 MAPK pathway and the viral replication. Moreover, the specific viral receptor CEACAM1a (carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1a) is essential for this response but also exerts an inhibitory action. Levels of the immunosuppressive cytokines IL-10, TGF-b and PGE2, mainly produced by Kupffer cells and sinusoidal endothelial cells, and implicated in the natural hepatic tolerance, are in inverse correlation with the pathogenicity of the MHV3 variants. Finally, viral infection promotes the secretion of IL-6 and TNF-a by macrophages, triggered by the fixation of viral particules to TLR2 and heparan sulfate receptors rather than the engagement of CEACAM1a receptor and viral replication. In conclusion, our results suggest new mechanisms by which the MHV3 virus disturbs the innate immunity under control of NK and NK-T cells, as well as the cytokines involved in the hepatic tolerance to the detriment of the inflammatory response.

La réponse immunitaire est régulée spatialement et temporellement. Les cellules immunitaires font partie d’une plus grande communauté de populations cellulaires interconnectées qui coordonnent leurs actions par la signalisation intercellulaire. Suivant une blessure hépatique, la distribution et la composition du compartiment immunitaire évoluent rapidement au fil du temps. Par conséquent, l’information sur la position des cellules immunitaires dans le tissu hépatique est essentielle à la bonne compréhension de leurs fonctions dans la santé et la maladie. Cependant, l’organisation spatiale des cellules immunitaires en réponse à une atteinte hépatique aiguë, ainsi que les conséquences fonctionnelles de leur distribution topographique spécifique, restent mal comprises. Les macrophages hépatiques sont des cellules effectrices clés pendant l’homéostasie et en réponse à des blessures, et sont impliqués dans la pathogenèse de plusieurs maladies du foie. L’hétérogénéité et plasticité des macrophages dans le foie a été exposée avec l’émergence du séquençage de l’ARN, la cytométrie en flux et la cytométrie de masse. Ces techniques ont sensiblement contribué à la compréhension de l’origine, et fonctions des macrophages dans le foie. Cependant, ces technologies impliquent la destruction du tissu pour la préparation de suspension cellulaires ce qui entraîne une perte d’information spatiale et de contexte tissulaire. Par conséquent, la caractérisation spatiale et temporelle des macrophages dans le tissu hépatique pendant l’homéostasie tissulaire, et en réponse à une blessure, fournit une nouvelle information sur la façon dont les macrophages se rapportent aux cellules voisines et leur comportement pendant les réponses immunitaires. Dans la première partie de cette étude, nous avons conçu une stratégie pour le phénotypage spatial des cellules immunitaires hépatiques dans des échantillons de tissus. Cette stratégie combine techniques d'imagerie et l’alignement numérique des images pour surmonter les limitations actuelles du nombre de marqueurs pouvant être visualisés simultanément. En outre, nous avons généré des protocoles pour la quantification automatisée des cellules d’intérêt dans des sections de tissus pour réduire la subjectivité associée à la quantification par inspection visuelle, et pour augmenter la surface et la vitesse de l’analyse. Par conséquent, un plus grand nombre de populations de cellules immunitaires ont été visualisées, quantifiées et cartographiées, et leurs relations spatiales ont été déterminées. Dans la deuxième partie de l’étude, nous avons déterminé la cinétique et la dynamique spatiale des cellules de Kupffer (KCs) et des macrophages dérivés de monocytes (MoMFs) en réponse à une atteinte hépatique aiguë au CCl4, afin de mieux comprendre leurs rôles fonctionnels, et la répartition du travail entre eux. Nous avons constaté que les KC et les MoMFs présentent des différences au niveau de la distribution tissulaire, la morphologie, et la cinétique. En plus, seulement les KCs ont proliféré pour repeupler la population de macrophages résidents pendant la réparation tissulaire. Finalement, nous avons montré que le degré de colocalization de KCs et des MoMFs avec les cellules stellaires est différent. En plus, cette colocalisation varie avec la progression de la réponse immunitaire. Dans l’ensemble, nous avons montré que les KCs et les MoMFs ont des profils spatiaux et temporels différents en réponse à une atteinte hépatique aiguë. Dans l’ensemble, les observations faites dans cette étude suggèrent que le comportement spatial et temporel d’une sous-population donnée de cellules immunitaires est distinct et sous-tend sa capacité à remplir ses fonctions spécifiques pendant la réponse immunitaire. / The immune response is spatially and temporally regulated. Immune cells are part of a larger community of interconnected immune and non-immune cell populations that coordinate their actions mostly through cell-cell intercellular signaling. In the liver, the distribution pattern, and the composition of the immune compartment evolve during an immune response to injury influencing disease pathology, progression, and response to treatment. Hence, information on the location and interacting partners of immune cells in the hepatic tissue is critical for the proper understanding of their functions in health and disease. However, the spatial organization of hepatic resident and infiltrating immune cells in response to acute injury, and the functional consequences of their specific topographical distribution, remain poorly defined. Hepatic macrophages are key effector cells during homeostasis and in response to injury and are involved in the pathogenesis of several liver diseases. The heterogeneity and plasticity of the macrophage compartment in the liver have only recently started to be appreciated with the emergence of RNA sequencing, flow cytometry, and mass cytometry. Detailed transcriptomic and phenotypic profiling have deeply expanded our understanding of macrophage biology. However, these technologies involve tissue disruption with loss of spatial information and tissue context. Therefore, the spatial and temporal profiling of liver macrophages in tissue samples during the steady state, and in response to injury, provide novel information on how the macrophages relate to neighboring cells and their behavior during immune responses. In the first part of this study, we designed a strategy for the spatial phenotyping of hepatic immune cells in tissue samples. This strategy combined serial and sequential labeling, and digital tissue alignment to overcome current limitations in the number of markers that can be simultaneously visualized. In addition, we generated protocols for automated quantification of cells of interest in whole tissue sections which removed the subjectivity associated with quantification by visual inspection and greatly increased the area and the speed of the analysis. As a result, a larger number of immune cell populations were visualized, quantified, and mapped, and their spatial relations were determined in an unbiased manner. In the second part of this study, we monitored the kinetics, and spatial dynamics of resident Kupffer cells (KCs) and infiltrating monocyte-derived macrophages (MoMFs) in response to acute liver injury with CCl4, to gain insight into their functional roles, and the distribution of labor between them. KCs and MoMFs exhibited different tissue distribution patterns and cell morphology, different kinetics, and occupied neighboring but unique microanatomical tissue locations. KCs and MoMFs displayed a different capacity to replenish the macrophage pool upon acute injury, and were differentially related to hepatic stellate cells. Different kinetics and spatial profiles revealed that KCs and MoMFs have distinct spatial signatures and suggest that they perform distinct functions during the wound-healing response to acute liver injury. In summary, we optimized techniques and put together a strategy for the spatial profiling of hepatic immune cells. Then, we used this methodology to profile resident and infiltrating macrophage subpopulations to gain insight into their biology and distinct contribution to healing in response to acute liver injury. Overall, the observations made in this study suggest that the spatial and temporal behavior of a given subpopulation of immune cells underlie its ability to perform its specific functions during the immune response.