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The role of chemokines as chemotactic cytokines and their functions in the immune system and related pathologies are well defined. Recently, strong evidence supporting the hypothesis that chemokines can act as modulators of neuronal activity and influence neurotransmission has been reported. The chemokine CXCL12 is constitutively expressed in adult brain and expression of CXCL12 and its cognate receptor CXCR4 have been reported in regions of rat brain that construct dopamine (DA) and glutamate (GLU) pathways such as ventral tegmental area (VTA), substantia nigra (SN), and nucleus accumbens (NAc). In the central nervous system (CNS), activation of CXCR4 on dopaminergic neurons and astrocytes initiate cascade of events that leads to DA and GLU release and influence synaptic transmission. In vivo, intracerebroventricular (ICV) CXCL12 has been shown to potentiate cocaine-induced locomotor activity. Based on these evidences, the studies, as outlined in this dissertation, aimed to expand understanding of how CXCL12/CXCR4 interaction can affect cocaine-induced behavior and reinforcement, with special focus on mechanisms involving GLU. We first evaluated involvement of CXCR4 activation by CXCL12 on cocaine-induced locomotor activity using a selective CXCR4 antagonist AMD3100. Results demonstrated that AMD3100 (5, 10 mg/kg, IP) pretreatment dose-dependently attenuated cocaine-induced locomotor activity without affecting the baseline activity. Thereafter, effects of AMD3100 on cocaine’s reinforcing efficacy were tested using a biased conditioned place preference (CPP) paradigm. In all CPP experiments, saline pretreated controls established a significant preference for the cocaine-paired context following four pairings with cocaine (10 mg/kg, IP). Rats pretreated with 2.5 and 5 mg/kg AMD3100 prior to each pairing session showed significantly lower preference for the cocaine-paired side, whereas rats pretreated with 1 mg/kg AMD3100 showed similar preference for the cocaine-paired side as the saline controls when tested in the absence of the drug. Rats pretreated with AMD3100 (5 mg/kg, IP) just once prior to testing showed significantly lower preference for the cocaine-paired side. These results demonstrate that CXCR4 antagonism reduces development and expression of cocaine-induced CPP. Intravenous cocaine self-administration (SA) was performed to examine the effects of AMD3100 on the acquisition of cocaine-taking behavior and reinstatement to cocaine-seeking. Acquisition of cocaine SA was studied using three doses of cocaine (0.375, 0.5, 0.75 mg/kg/infusion) on a fixed-ratio 1 (FR-1) schedule of reinforcement. Two doses of AMD3100 (5, 10 mg/kg, IP) were tested. In all SA experiments, saline pretreated controls readily acquired cocaine self-administration. The lower and higher AMD3100 decreased the number of reinforcers earned during the two hour sessions compared to saline controls when tested against acquisition of 0.375 and 0.5 mg/kg/infusion cocaine. However, when tested against the 0.75 mg/kg/infusion cocaine, only 10 mg/kg of AMD3100 resulted in reduction in responding, but not the lower dose. When a dose response curve was plotted using all doses of cocaine and AMD3100 tested, the effects of AMD3100 were represented by a significant downward shift of the dose response curve. Effects of AMD3100 on cocaine-seeking were evaluated using the reinstatement model, in which rats that were extinguished from self-administration of 0.5 mg/kg/infusion cocaine underwent reinstatement testing with cue or cue + drug presentation. A compound cue (light and tone stimulus), that was used during the acquisition training, and submaximal dose of cocaine (5mg/kg, IP) were used. In both reinstatement conditions, rats pretreated with saline reinstated following the presentation of cue or cue + drug prime. Rats pretreated with AMD3100, 30 minutes prior to reinstatement session, showed significantly lower number of lever presses indicating drug-seeking was not as robust compared to the saline pretreated controls. Following the observations that cocaine-induced behaviors may be partially mediated by CXCL12/CXCR4 interaction, neurochemical changes were examined to elucidate the underlying mechanisms. CXCR4 immunoreactivity in prefrontal cortex (PFC) following withdrawal from 7 days of repeated cocaine (15 mg/kg, IP) was evaluated. Although positive CXCR4 immunoreactivity was observed in PFC, there were no significant differences in the intensity of CXCR4 expression compared to the saline treated controls at acute (2 hours, 2 and 10 days) or protracted (30 days) withdrawal time points. In contrast, CXCL12 protein levels in PFC and NAc were negatively influenced after protracted withdrawal from 7 days of repeated cocaine (15 mg/kg, IP) administration. Following assessment of regional expression of CXCR4, cellular expression was evaluated using triple labeling immunohistochemistry which revealed the positive CXCR4-immunoreactivity on cells staining positively for vesicular glutamate transporter 1 (vGlut1) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) showing that the glutamatergic neurons and astrocytes in the PFC express CXCR4. To assess the effects of CXCL12 on GLU transmission, microdialysis of NAc was performed. Following unilateral injection of 50 ng CXCL12 into the lateral ventricle, increase in extracellular GLU was observed. In a follow up study, AMD3100 pretreatment (10 mg/kg, IP) attenuated cocaine-induced increase in extracellular GLU in the NAc. Since the glutamate transporter subtype-1 (GLT-1) is a major regulator of extracellular GLU and upregulation of GLT-1 expression and function has been shown to attenuate reinstatement to cocaine-seeking, its expression was evaluated using immunoblot analysis of the NAc and PFC of rats that self-administered cocaine. The results revealed that AMD3100 (10 mg/k, IP; daily injection 30 min prior to SA session) pretreatment upregulated GLT-1 levels in the NAc but not PFC. In summary, results of the present study show that CXCL12/CXCR4 interaction may modulate cocaine-induced behavioral effects including reinforcement and reinstatement to cocaine-seeking. Neurochemical assessments revealed the presence of CXCR4-expressing glutamatergic neurons in the PFC and AMD3100-induced up-regulation of GLT-1. Most importantly, we provided direct evidence of CXCL12/CXCR4 mediated GLU transmission in NAc. Together, these results expand our understanding of chemokine’s role as neuromodulators and identify CXCR4 as a novel target for development of new pharmacotherapies for the treatment of cocaine addiction. / Pharmacology

Die Erforschung von Mechanismen der malignen Transformation ermöglicht das Verständnis von zahlreichen Signalwegen in der Zelle. In dieser Arbeit wurden Mechanismen untersucht, in die die Proliferation und das Homing leukämischer Progenitorzellen involviert sind. Diese Ergebnisse wurden im Anschluss mit gesunden Kontrollen korreliert. Die Migration von Stammzellen ist ein wichtiger zellulärer Mechanismus in der hämatopoetischen Stammzell-Biologie und in der Leukämie-Forschung. CXCR4 und sein Ligand SDF-1 sind wichtige Regulatoren der Stammzell-Migration und des Homings. Sie beeinflussen physiologische, pathologische und zelluläre Migrationsprozesse, die unter anderem für die Vaskularisierung (Nagasawa, 2001), aber auch für die Metastasierung von Tumorzellen (Helbig et al., 2003) von zentraler Bedeutung sind. FLT3 mutierte AML-Zellen zeigen erhöhte CXCR4-Level und ein verbessertes Anwachsen den Zellen im Knochenmark nach Transplantation in NOD/SCID-Mäuse. Tierexperimentelle Daten deuten darauf hin, dass ein verstärktes Homing von leukämischen Zellen mit einer erhöhten Resistenz gegenüber Chemotherapie assoziiert ist. Möglicherweise ist dies eine der Hauptursachen für das Therapieversagen bei diesen Patienten. Das Ziel des Projektes, dem diese Arbeit zugrunde liegt, war es, Interaktionen zwischen FLT3-ITD und CXCR4 zu untersuchen und mögliche Auswirkungen dieser Interaktionen für Migration und Homing von Stammzellen zu ermitteln. Letztlich können diese Erkenntnisse sowohl zur Verbesserung der klinischen Stammzell-Transplantationen und zur Definition neuer Strategien zur Behandlung von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie beitragen. Untersuchungsgegenstände dieser Arbeit waren zum einen die Gewinnung von Erkenntnissen über die Wirkung einer FLT3-ITD-Überexpression auf die Expression verschiedener Signalmoleküle und ihr möglicher Einfluss auf CXCR4/SDF-1 vermittelte Signalwege. Des Weiteren die Rolle der CXCR4/SDF-1-Achse und der Einfluss einer Mikroumgebung auf AML-Zellen. Zum anderen die Wirkung des CXCR4 Inhibitiors AMD3100 auf AML-Blasten sowie die Blockierung der CXCR4/SDF-1-Achse als mögliche Therapie gegen AML. Interne Tandemduplikation (ITD)-Mutationen des FLT3-Rezeptors sind mit einer hohen Inzidenz von Rückfällen bei akuter myeloischer Leukämie (AML) verbunden. Die Expression des CXCR4-Rezeptors in FLT3-ITD-positiven AML-Blasten ist mit schlechten Prognosen für die Patienten verbunden. Die Blockierung von CXCR4 führt zu einer Sensibilisierung von AML-Blasten gegenüber einer Chemotherapie. Im Rahmen dieser Arbeit wurden primäre Blasten von Patienten mit FLT3-ITD oder FLT3-wt-AML verwendet. Darüber hinaus wurden humane CD34+ hämatopoetische Vorläuferzellen (HSCs) bis zu 80% mit retroviralen Vektoren transduziert, die ein humanes FLT3-ITD-Transgen beinhalteten. Im Gegensatz zu früheren Daten von murinen Zellen wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass eine Überexpression des FLT3-ITD-Transgens in humanen HSCs eine signifikant reduzierte Migration zu SDF-1-in vitro aufweist. Dies spiegelte sich außerdem in einem reduzierten Knochenmark-Homing in NOD/SCID-Mäusen wider. Ko-Kultivierungsexperimente von sowohl FLT3-ITD-positiven AML-Blasten als auch von FLT3-ITD-positiven HSCs auf Stromazellen des Knochenmarks führten zu einem signifikanten Proliferationsvorteil und zu erhöhten zeitigen CAFCs im Vergleich zu FLT3-wt-AML-Blasten bzw. zu kontrolltransduzierten HSCs. Die Zugabe des CXCR4-Inhibitors AMD3100 zeigte während der Ko-Kultur eine deutliche Reduktion der Proliferation und von CAFCs bei FLT3-ITD-positiven Zellen, aber nicht bei FLT3-wt-Blasten. Zusammenfassend liefert diese Studie den Beweis für eine Stroma-vermittelte Resistenz von FLT3-ITD-positiven HSCs und Blasten. Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren, dass die Hemmung von CXCR4 die zellulären Wechselwirkungen von Stromazellen und leukämischen Zellen behindert. Somit bestätigt sich eine funktionelle Bedeutung der CXCR4/SDF-1-Achse bei AML. Um die Kontrolle über leukämische Zellen und ihre Proliferation zu bekommen, könnte die Hemmung von CXCR4 eine neue therapeutische Strategie bei Patienten mit fortgeschrittener FLT3-ITD-positiver AML sein.

Die Erforschung von Mechanismen der malignen Transformation ermöglicht das Verständnis von zahlreichen Signalwegen in der Zelle. In dieser Arbeit wurden Mechanismen untersucht, in die die Proliferation und das Homing leukämischer Progenitorzellen involviert sind. Diese Ergebnisse wurden im Anschluss mit gesunden Kontrollen korreliert. Die Migration von Stammzellen ist ein wichtiger zellulärer Mechanismus in der hämatopoetischen Stammzell-Biologie und in der Leukämie-Forschung. CXCR4 und sein Ligand SDF-1 sind wichtige Regulatoren der Stammzell-Migration und des Homings. Sie beeinflussen physiologische, pathologische und zelluläre Migrationsprozesse, die unter anderem für die Vaskularisierung (Nagasawa, 2001), aber auch für die Metastasierung von Tumorzellen (Helbig et al., 2003) von zentraler Bedeutung sind. FLT3 mutierte AML-Zellen zeigen erhöhte CXCR4-Level und ein verbessertes Anwachsen den Zellen im Knochenmark nach Transplantation in NOD/SCID-Mäuse. Tierexperimentelle Daten deuten darauf hin, dass ein verstärktes Homing von leukämischen Zellen mit einer erhöhten Resistenz gegenüber Chemotherapie assoziiert ist. Möglicherweise ist dies eine der Hauptursachen für das Therapieversagen bei diesen Patienten. Das Ziel des Projektes, dem diese Arbeit zugrunde liegt, war es, Interaktionen zwischen FLT3-ITD und CXCR4 zu untersuchen und mögliche Auswirkungen dieser Interaktionen für Migration und Homing von Stammzellen zu ermitteln. Letztlich können diese Erkenntnisse sowohl zur Verbesserung der klinischen Stammzell-Transplantationen und zur Definition neuer Strategien zur Behandlung von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie beitragen. Untersuchungsgegenstände dieser Arbeit waren zum einen die Gewinnung von Erkenntnissen über die Wirkung einer FLT3-ITD-Überexpression auf die Expression verschiedener Signalmoleküle und ihr möglicher Einfluss auf CXCR4/SDF-1 vermittelte Signalwege. Des Weiteren die Rolle der CXCR4/SDF-1-Achse und der Einfluss einer Mikroumgebung auf AML-Zellen. Zum anderen die Wirkung des CXCR4 Inhibitiors AMD3100 auf AML-Blasten sowie die Blockierung der CXCR4/SDF-1-Achse als mögliche Therapie gegen AML. Interne Tandemduplikation (ITD)-Mutationen des FLT3-Rezeptors sind mit einer hohen Inzidenz von Rückfällen bei akuter myeloischer Leukämie (AML) verbunden. Die Expression des CXCR4-Rezeptors in FLT3-ITD-positiven AML-Blasten ist mit schlechten Prognosen für die Patienten verbunden. Die Blockierung von CXCR4 führt zu einer Sensibilisierung von AML-Blasten gegenüber einer Chemotherapie. Im Rahmen dieser Arbeit wurden primäre Blasten von Patienten mit FLT3-ITD oder FLT3-wt-AML verwendet. Darüber hinaus wurden humane CD34+ hämatopoetische Vorläuferzellen (HSCs) bis zu 80% mit retroviralen Vektoren transduziert, die ein humanes FLT3-ITD-Transgen beinhalteten. Im Gegensatz zu früheren Daten von murinen Zellen wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass eine Überexpression des FLT3-ITD-Transgens in humanen HSCs eine signifikant reduzierte Migration zu SDF-1-in vitro aufweist. Dies spiegelte sich außerdem in einem reduzierten Knochenmark-Homing in NOD/SCID-Mäusen wider. Ko-Kultivierungsexperimente von sowohl FLT3-ITD-positiven AML-Blasten als auch von FLT3-ITD-positiven HSCs auf Stromazellen des Knochenmarks führten zu einem signifikanten Proliferationsvorteil und zu erhöhten zeitigen CAFCs im Vergleich zu FLT3-wt-AML-Blasten bzw. zu kontrolltransduzierten HSCs. Die Zugabe des CXCR4-Inhibitors AMD3100 zeigte während der Ko-Kultur eine deutliche Reduktion der Proliferation und von CAFCs bei FLT3-ITD-positiven Zellen, aber nicht bei FLT3-wt-Blasten. Zusammenfassend liefert diese Studie den Beweis für eine Stroma-vermittelte Resistenz von FLT3-ITD-positiven HSCs und Blasten. Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren, dass die Hemmung von CXCR4 die zellulären Wechselwirkungen von Stromazellen und leukämischen Zellen behindert. Somit bestätigt sich eine funktionelle Bedeutung der CXCR4/SDF-1-Achse bei AML. Um die Kontrolle über leukämische Zellen und ihre Proliferation zu bekommen, könnte die Hemmung von CXCR4 eine neue therapeutische Strategie bei Patienten mit fortgeschrittener FLT3-ITD-positiver AML sein.

L’injection de cellules souches provenant de la moelle osseuse est reconnue pour améliorer la fonction ventriculaire ainsi que le remodelage cicatriciel après un infarctus du myocarde (IM). Le Stromal Cell-derived factor-1 alpha (SDF-1 alpha), une chimiokine induite par l’ischémie cardiaque, représente une grande importance en raison de son rôle dans le recrutement de cellules inflammatoires et de cellules souches de la moelle osseuse vers les sites endommagés. Quoique les recherches sur le rôle de la chimiokine SDF-1 alpha dans le remodelage ventriculaire se multiplient, son implication dans la phase aiguë du remodelage reste inexplorée. Le but de la présente étude est de déterminer l’effet du SDF-1 alpha sur la taille de la cicatrice, l’hypertrophie cardiaque ainsi que la fonction ventriculaire chez des rats et des souris une semaine après un IM. La stratégie utilisée implique l’administration de l’AMD3100 (1 mg/kg, 24 heures après l’IM, pendant 6 jours), l’antagoniste sélectif du récepteur du SDF-1 alpha, le CXCR4. Ce récepteur est couplé à une protéine G alpha i et induit la migration et la prolifération cellulaire. Chez les rats du groupe IM, l’expression de la chimiokine a été détectée surtout dans les cellules musculaires lisses et les cellules endothéliales des vaisseaux cicatriciels. Le profil d’expression de la chimiokine dans le cœur infarci indique un gradient de concentration vers la cicatrice. Une semaine après l’IM, le traitement avec l’AMD3100 a diminué la taille de la cicatrice, résultant en une amélioration de la fonction ventriculaire et une diminution de l’élévation de l’expression de l’ARNm de l’ANP dans le ventricule gauche non infarci (VGNI). Chez les souris, le traitement avec l’AMD3100 a engendré les mêmes effets, soit une diminution de la taille de la cicatrice ainsi qu’une amélioration de la fonction ventriculaire. La réduction de la taille de la région infarcie chez les souris traitées avec l’AMD3100 est associée avec une atténuation de l’infiltration des neutrophiles dans la région ischémique. Ces résultats suggèrent que le blocage pharmacologique de l’axe SDF-1 alpha/CXCR4 lors de la phase aiguë du remodelage ventriculaire après un IM diminue la taille de la cicatrice et améliore la fonction ventriculaire, en partie, par la diminution de la réaction inflammatoire. / The injection of bone marrow stem cells in the infarcted heart was shown to improve ventricular function and scar remodelling. The chemokine Stromal Cell-derived factor-1 alpha (SDF-1 alpha) is implicated in the migration of inflammatory and bone marrow derived stem cells to damaged region. Despite a local increase of SDF-1 alpha expression in the damaged myocardium, the biological impact of the chemokine during the acute phase of remodelling in the ischemic heart remains undefined. Therefore, the present study examined the role of SDF-1 alpha on scar expansion, cardiac hypertrophy and ventricular function in rats following myocardial infarction (MI) via administration of AMD3100 (1 mg/kg, 24 hours post-MI and continued for 6 days) a selective antagonist of the SDF-1 alpha receptor, CXCR4. This receptor is coupled to a G alpha i protein and induced migration and proliferation of cells. In 1-week post-MI rats, chemokine expression was detected in smooth muscle and endothelial cells of blood vessels residing in the infarcted region. An SDF-1 alpha gradient towards the infarcted region was detected in the post-MI rat heart. In 1-week post-MI rats, AMD3100 therapy reduced scar size, concomitantly improved left ventricular function and partially supressed the elevated expression of ANP mRNA in the non-infarcted left ventricule. Preliminary studies on mice showed that the reduced infarct size in AMD3100-treated post-MI mice was associated with an attenuation of neutrophil infiltration in the ischemic region. These data highlight the novel observation that pharmacological antagonism of the SDF-1 alpha/CXCR4 axis during the acute phase of repartive fibrosis post-MI attenuated scar expansion and improved ventricular function in part via attenuation of the inflammatory response.

L’injection de cellules souches provenant de la moelle osseuse est reconnue pour améliorer la fonction ventriculaire ainsi que le remodelage cicatriciel après un infarctus du myocarde (IM). Le Stromal Cell-derived factor-1 alpha (SDF-1 alpha), une chimiokine induite par l’ischémie cardiaque, représente une grande importance en raison de son rôle dans le recrutement de cellules inflammatoires et de cellules souches de la moelle osseuse vers les sites endommagés. Quoique les recherches sur le rôle de la chimiokine SDF-1 alpha dans le remodelage ventriculaire se multiplient, son implication dans la phase aiguë du remodelage reste inexplorée. Le but de la présente étude est de déterminer l’effet du SDF-1 alpha sur la taille de la cicatrice, l’hypertrophie cardiaque ainsi que la fonction ventriculaire chez des rats et des souris une semaine après un IM. La stratégie utilisée implique l’administration de l’AMD3100 (1 mg/kg, 24 heures après l’IM, pendant 6 jours), l’antagoniste sélectif du récepteur du SDF-1 alpha, le CXCR4. Ce récepteur est couplé à une protéine G alpha i et induit la migration et la prolifération cellulaire. Chez les rats du groupe IM, l’expression de la chimiokine a été détectée surtout dans les cellules musculaires lisses et les cellules endothéliales des vaisseaux cicatriciels. Le profil d’expression de la chimiokine dans le cœur infarci indique un gradient de concentration vers la cicatrice. Une semaine après l’IM, le traitement avec l’AMD3100 a diminué la taille de la cicatrice, résultant en une amélioration de la fonction ventriculaire et une diminution de l’élévation de l’expression de l’ARNm de l’ANP dans le ventricule gauche non infarci (VGNI). Chez les souris, le traitement avec l’AMD3100 a engendré les mêmes effets, soit une diminution de la taille de la cicatrice ainsi qu’une amélioration de la fonction ventriculaire. La réduction de la taille de la région infarcie chez les souris traitées avec l’AMD3100 est associée avec une atténuation de l’infiltration des neutrophiles dans la région ischémique. Ces résultats suggèrent que le blocage pharmacologique de l’axe SDF-1 alpha/CXCR4 lors de la phase aiguë du remodelage ventriculaire après un IM diminue la taille de la cicatrice et améliore la fonction ventriculaire, en partie, par la diminution de la réaction inflammatoire. / The injection of bone marrow stem cells in the infarcted heart was shown to improve ventricular function and scar remodelling. The chemokine Stromal Cell-derived factor-1 alpha (SDF-1 alpha) is implicated in the migration of inflammatory and bone marrow derived stem cells to damaged region. Despite a local increase of SDF-1 alpha expression in the damaged myocardium, the biological impact of the chemokine during the acute phase of remodelling in the ischemic heart remains undefined. Therefore, the present study examined the role of SDF-1 alpha on scar expansion, cardiac hypertrophy and ventricular function in rats following myocardial infarction (MI) via administration of AMD3100 (1 mg/kg, 24 hours post-MI and continued for 6 days) a selective antagonist of the SDF-1 alpha receptor, CXCR4. This receptor is coupled to a G alpha i protein and induced migration and proliferation of cells. In 1-week post-MI rats, chemokine expression was detected in smooth muscle and endothelial cells of blood vessels residing in the infarcted region. An SDF-1 alpha gradient towards the infarcted region was detected in the post-MI rat heart. In 1-week post-MI rats, AMD3100 therapy reduced scar size, concomitantly improved left ventricular function and partially supressed the elevated expression of ANP mRNA in the non-infarcted left ventricule. Preliminary studies on mice showed that the reduced infarct size in AMD3100-treated post-MI mice was associated with an attenuation of neutrophil infiltration in the ischemic region. These data highlight the novel observation that pharmacological antagonism of the SDF-1 alpha/CXCR4 axis during the acute phase of repartive fibrosis post-MI attenuated scar expansion and improved ventricular function in part via attenuation of the inflammatory response.

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No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO-NILBERTO DIAS DE ARAUJO.pdf: 4228893 bytes, checksum: 66567041ba30f108930af2db43e2c393 (MD5) Previous issue date: 2014-09-30 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The bone marrow is the mean site described as reserve subpopulations of adult stem cells, including hematopoietic stem cells (HSC) and mesenchymal stem cells (MSC). Different factors potentially stimulate mobilization of these stem cells into peripheral blood. The G-CSF and AMD3100 have been shown to act by disrupting CXCR4/SDF-1α retention axis, stimulating mobilization of HSC and MSC to the bloodstream. The aim of this study was to evaluate the influence of G-CSF and AMD3100 in HCS and MSC mobilization to the peripheral blood and in the cytokine profile produced by these cells in vitro. For this experiment, we were used 5 groups with 09 male mice, BALB-c. HSC and MSC were identified through specific cell markers by flow cytometry. The HSC and MSC samples, from peripheral blood (PB) and bone marrow (BM) were cultured in vitro and cytokines were measured in supernatants of these cultures by flow Cytometry CBA (Cytometric Bead Array System). Statistical analyzes were performed with the GraphPad Prism 5.0. In results we observed the statistically significant difference in HSC mobilization in mice treated with PBS that received one dose of AMD3100 and the animals treated with G-CSF over 04 successive days. Regarding the MSC, was observed a statistically significant difference in mobilization only in the group of animals treated with G-CSF. In the bone marrow cultures with or without G-CSF stimulus we observed adherent cells with fibroblastoid morphology. In the cultures of peripheral blood was observed that the cells had this same morphology when they were stimulated with G-CSF. There was an increased production of IL-6, TNF-α, IFN-γ and IL-10 in early cultivation of the SC stimulated with G-CSF, in the cultures of bone marrow cells and peripheral blood. Increased IL-2 and IL-4 cytokines was found in some groups in the late stage of the cultivation. IL-17A had different concentrations, maintaining a stable production in different groups and days of cultivation. Thus, it can be suggested that AMD3100 induces a rapid mobilization of CD34+ cells into the circulation and that G-CSF is directly or indirectly involved in the mobilization of stem cells from bone marrow to peripheral blood, as is kwown, but also in the differentiation of MSC, modulation process and production of several other cytokines. / A medula óssea é o principal local descrito como reserva de subpopulações de células-tronco adultas, incluindo as células-tronco hematopoiéticas (CTH) e células-tronco mesenquimais (CTM). Diferentes fatores estimulam potencialmente a mobilização dessas células para o sangue periférico. O G-CSF e o AMD3100 têm demonstrado agir na interrupção do eixo de retenção CXCR4/SDF-1α estimulando a mobilização de CTH e CTM para a corrente sanguínea. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência do G-CSF e do AMD3100 na mobilização de CTH e CTM para o sangue periférico e no perfil de citocinas produzidas in vitro por essas células. Foram utilizados 5 grupos com 09 camundongos machos, BALB-c. As CTH e CTM mobilizadas foram identificadas por meio de marcadores celulares específicos por citometria de fluxo. As amostras de CTH e CTM, de sangue periférico (SP) e medula óssea (MO) foram cultivadas in vitro e as citocinas foram dosadas nos sobrenadantes destas culturas pela técnica de citometria de fluxo CBA (Cytometric Bead Array System). As análises estatísticas foram realizadas com o programa GraphPad Prism 5.0. Os resultados demonstraram uma mobilização estatisticamente significativa de CTH nos camundongos tratados com PBS e que receberam 01 dose de AMD3100, e no grupo dos animais que foram tratados com G-CSF diariamente, por 04 dias consecutivos. Em relação às CTM, foi observada uma mobilização estatisticamente significativa apenas no grupo dos animais tratados com G-CSF. As culturas de medula óssea que receberam ou não estímulo (G-CSF) in vitro apresentaram células aderentes, com morfologia fibroblastóides. Nas culturas de sangue periférico, observou-se que as células apresentaram essa mesma morfologia quando foram estimuladas com G-CSF. No perfil de citocinas, houve uma maior produção de IL-6, TNF-α, IFN-γ e IL-10 na fase inicial do cultivo das CT que foram estimuladas com G-CSF, tanto em culturas da MO quanto do SP. As citocinas IL-2 e IL-4 encontraram-se mais elevadas em alguns grupos nas fases tardias do cultivo. IL-17A apresentou concentrações distintas, mantendo sua produção estável nos diferentes grupos e dias de cultivo. Dessa maneira, pode-se sugerir que, o AMD3100 induz uma rápida mobilização de células CD34+ para a circulação e o G-CSF participa direta ou indiretamente no processo de mobilização de subpopulações de CT da medula óssea para o sangue periférico, na diferenciação de CTM, e no processo de modulação e produção de citocinas.

L’interaction d’un ligand avec un récepteur à sept domaines transmembranaires (7TMR) couplé aux protéines G, mène à l’adoption de différentes conformations par le récepteur. Ces diverses conformations pourraient expliquer l’activation différentielle des voies de signalisation. Or, le lien entre la conformation et l’activité du récepteur n’est pas tout à fait claire. Selon les modèles classiques pharmacologiques, comme le modèle du complexe ternaire, il n’existe qu’un nombre limité de conformations qu’un récepteur peut adopter. Afin d’établir un lien entre la structure et la fonction des récepteurs, nous avons choisi dans un premier temps, le récepteur de chimiokine CXCR4 comme récepteur modèle. Ce dernier, est une cible thérapeutique prometteuse, impliqué dans l’entrée du VIH-1 dans les cellules cibles et dans la dissémination de métastases cancéreuses. Grâce au transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) nous pouvons détecter les changements conformationnels des homodimères constitutifs de CXCR4 dans les cellules vivantes. En conséquence, nous avons mesuré les conformations de mutants de CXCR4 dont les mutations affecteraient sa fonction. Nous montrons que la capacité des mutants à activer la protéine Galphai est altérée suite au traitement avec l’agoniste SDF-1. Notamment, ces mutations altèrent la conformation du récepteur à l’état basal ainsi que la réponse conformationnelle induite suite au traitement avec l’agoniste SDF-1, l’agoniste partiel AMD3100 ou l’agoniste inverse TC14012. Ainsi, différentes conformations de CXCR4 peuvent donner lieu à une activation similaire de la protéine G, ce qui implique une flexibilité des récepteurs actifs qui ne peut pas être expliquée par le modèle du complexe ternaire (Berchiche et al. 2007). Également, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CCR2, exprimé à la surface des cellules immunitaires. Il joue un rôle important dans l’inflammation et dans des pathologies inflammatoires telles que l’asthme. CCR2 forme des homodimères constitutifs et possède différents ligands naturels dont la redondance fonctionnelle a été suggérée. Nous avons étudié le lien entre les conformations et les activations d’effecteurs (fonctions) de CCR2. Notre hypothèse est que les différents ligands naturels induisent différentes conformations du récepteur menant à différentes fonctions. Nous montrons que les réponses de CCR2 aux différents ligands ne sont pas redondantes au niveau pharmacologique et que les chimiokines CCL8, CCL7 et CCL13 (MCP-2 à MCP-4) sont des agonistes partiels de CCR2, du moins dans les systèmes que nous avons étudiés. Ainsi, l’absence de redondance fonctionnelle parmi les chimiokines liant le même récepteur, ne résulterait pas de mécanismes complexes de régulation in vivo, mais ferait partie de leurs propriétés pharmacologiques intrinsèques (Berchiche et al. 2011). Enfin, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CXCR7. Récemment identifié, CXCR7 est le deuxième récepteur cible de la chimiokine SDF-1. Cette chimiokine a été considérée comme étant capable d’interagir uniquement avec le récepteur CXCR4. Notamment, CXCR4 et CXCR7 possèdent un patron d’expression semblable dans les tissus. Nous avons évalué l’effet de l’AMD3100, ligand synthétique de CXCR4, sur la conformation et la signalisation de CXCR7. Nos résultats montrent qu’AMD3100, tout comme SDF-1, lie CXCR7 et augmente la liaison de SDF-1 à CXCR7. Grâce au BRET, nous montrons aussi qu’AMD3100 seul est un agoniste de CXCR7 et qu’il est un modulateur allostérique positif de la liaison de SDF-1 à CXCR7. Aussi, nous montrons pour la première fois le recrutement de la beta-arrestine 2 à CXCR7 en réponse à un agoniste. L’AMD3100 est un ligand de CXCR4 et de CXCR7 avec des effets opposés, ce qui appelle à la prudence lors de l’utilisation de cette molécule pour l’étude des voies de signalisation impliquant SDF-1 (Kalatskaya et al. 2009). En conclusion, nos travaux amènent des évidences qu’il existe plusieurs conformations actives des récepteurs et appuient les modèles de structure-activité des récepteurs qui prennent en considération leur flexibilité conformationnelle. / Ligand binding to 7TMRs is thought to induce conformational changes within the receptor that translate into activation of downstream effectors. The link between receptor conformation and activity is still poorly understood, as current models of receptor activation fail to take an increasing amount of experimental data into account. Classical pharmacological models such as the ternary complex model are based on the concept that receptors can only adopt a limited number of conformations. To clarify structure-function relationships in 7TMRs, first we studied chemokine receptor CXCR4. This receptor is an important drug target, involved in HIV-1 entry and cancer metastasis. Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) allows us to directly probe conformational changes within pre-formed CXCR4 homodimers in live cells. Using BRET, we measured the conformation of CXCR4 mutants and we also monitored their function by measuring their ability to induce Galphai activation. The analyzed mutants had substitutions in locations which are pivotal molecular switches for receptor conformation and activation. We show that agonist induced Gi activation is altered for most mutants. These mutations also alter CXCR4’s conformation at basal conditions (in absence of ligand) and in the presence of the agonist, SDF-1, the partial agonist, AMD3100 and the inverse agonist, TC14012. Moreover, different conformations of active receptors were detected in the presence of SDF-1, suggesting that different receptor conformations are able to trigger Galphai activity. These data provide biophysical evidence for different active receptor conformations, that cannot be explained by classical models of receptor function (Berchiche et al. 2007). Furthermore, the second part of our work focused on chemokine receptor CCR2. Mainly expressed on immune cells, CCR2 is involved in many inflammatory and vascular diseases. This receptor binds seven natural ligands that have been referred to as redundant. We set out to explore whether the different chemokine ligands of CCR2 receptor induce different conformational changes leading to different functional consequences. Our results show that the different natural ligands of CCR2 are not pharmacologically redundant. Moreover, chemokines CCL8, CCL7 and CCL13 (MCP-2 to MCP-4) are partial agonists of CCR2, at least in the systems we used. Our results support the validity of models for receptor-ligand interactions in which different ligands stabilize different receptor conformations also for endogenous receptor ligands, demonstrating that these natural ligands are not pharmacologically and functionally redundant (Berchiche et al. 2011). As the third part of this work, we studied chemokine receptor CXCR7, the alternative receptor for SDF-1. Until recently, CXCR4 was the only receptor known to bind SDF-1. Moreover, the expression patterns are similar for receptors CXCR4 and CXCR7. Therefore, we investigated the conformational and functional consequences of the synthetic inhibitor of CXCR4, AMD3100, on CXCR7. We show that AMD3100 also binds the alternative SDF-1 receptor, CXCR7. SDF-1 or AMD3100 alone trigger beta-arrestin recruitment to CXCR7, which we identify as a previously unreported signalling pathway of CXCR7. In addition, AMD3100 has positive allosteric effects on SDF-1 binding to CXCR7, on SDF-1-induced conformational rearrangements in the receptor dimer as measured by BRET, and on SDF-1-induced beta-arrestin recruitment to CXCR7. The finding that AMD3100 not only binds CXCR4, but also to CXCR7, with opposite effects on the two receptors, call for caution in the use of this compound as a tool to dissect SDF-1 effects on the respective receptors in vitro and in vivo. Finally, these data provide biophysical evidence for different active receptor conformations, and support models of 7TMR structure-activity relationships that take conformational heterogeneity into account.

La NAFLD (non alcoholic fatty liver disease) ou stéatopathie dysmétabolique est la manifestation hépatique du syndrome métabolique. Elle regroupe l’ensemble des lésions hépatiques liées à l’obésité en dehors de toute consommation d’alcool : la stéatose, la NASH (non alcoholic steatohepatitis), la fibrose, la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Les systèmes immunitaires inné et adaptatif participent activement à la pathologie. J’ai étudié deux axes : l’axe du récepteur des glucocorticoïdes-GILZ dans les cellules de Kupffer et CXCR4-CXCL12 dans les lymphocytes T CD4+.Les cellules de Kupffer (CK) jouent un rôle clé dans la pathologie de la NASH. GILZ (glucocorticoid induced leucine zipper) est exprimé par les monocytes/macrophages et est sous le contrôle du récepteur aux glucocorticoïdes (GR). De plus, GILZ intervient dans l’inhibition des processus inflammatoires. J’ai montré que l’obésité entraîne une diminution de l’expression du GR et de GILZ dans les CK. En utilisant du RU486, un antagoniste spécifique du GR, j’ai prouvé que la diminution de l’expression du GR entraîne la diminution de l’expression de GILZ et sensibilise les CK au LPS. Ce mécanisme joue un rôle déterminant dans le développement de l’inflammation hépatique au cours de l’obésité, en modulant la réponse inflammatoire des CK. Le recrutement de cellules inflammatoires dans le foie est un élément clé de la progression de la NASH. Les lymphocytes T CD4+ issus de souris obèses ont des propriétés chimiotactiques accrues dépendantes de CXCR4. J’ai montré que la NASH augmente les propriétés migratoires dépendantes de CXCR4 des lymphocytes T CD4+ chez l’homme et la souris dans trois modèles murins de NASH. Le traitement de souris obèses par de l’AMD3100, un antagoniste de CXCR4, permet de diminuer le recrutement hépatique de lymphocytes. L’augmentation du chimiotactisme des lymphocytes T CD4+ n’était pas dû, ni à une augmentation de l’expression de CXCR4 et CXCR7, ni même de CXCL12 au niveau du foie. J’ai montré que ce mécanisme dépendait de l’augmentation de l’affinité de CXCR4 pour CXCL12.Ainsi, j’ai mis en évidence deux axes participant à l’inflammation hépatique au cours de l’obésité. Ces axes représentent de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. / NAFLD (non alcoholic fatty liver disease) is the hepatic manifestation of metabolic syndrome. It encompasses the entire spectrum of obesity-related liver lesions : steatosis, NASH (non alcoholic steatohepatitis), fibrosis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Innate and adaptative immune systems participate actively to the pathophysiology.I studied two axis : the glucocorticoid receptor-GILZ axis in Kupffer cells and CXCR4-CXCL12 in CD4+ T lymphocytes.Kupffer cells (KC) play a key role in pathophysiology of NASH. GILZ (glucocorticoid induced leucine zipper) is expressed by monocytes/macrophages and is under the control of glucocorticoid receptor (GR). Moreover, GILZ takes part in inhibition of inflammatory processes. I showed that obesity induces a decreased expression of GR and GILZ in KC. Using RU486, a GR antagonist, I proved that decreased expression of GR induces the decreased expression of GILZ and sensitize KC to LPS. This mechanism plays a decisive role in initiation of liver inflammation in obesity, modulating inflammatory response of KC. In obese mice, recruitment of inflammatory cells into the liver is a key element in the progression of NASH. CD4+ T lymphocytes from obese mice have enhanced CXCR4-dependent chemotactic properties. I showed that NASH enhances CXCR4-dependent chemotactic properties of CD4+ T lymphocytes in patients and in three mouse models of NASH. Obese mice treatment with AMD3100, a CXCR4 antagonist, decreases lymphocytes recruitement into the liver. Enhanced chemotactic properties of CD4+ T lymphocytes were not due to increased expressions of nor CXCR4 and CXCR7, neither CXCL12 in the liver. I showed that this mechanism was dependent of an increased affinity of CXCR4 to CXCL12.Therefore, I highlighted two axis participating to obesity-related liver inflammation. These axis represent new potential therapeutic targets.

L’interaction d’un ligand avec un récepteur à sept domaines transmembranaires (7TMR) couplé aux protéines G, mène à l’adoption de différentes conformations par le récepteur. Ces diverses conformations pourraient expliquer l’activation différentielle des voies de signalisation. Or, le lien entre la conformation et l’activité du récepteur n’est pas tout à fait claire. Selon les modèles classiques pharmacologiques, comme le modèle du complexe ternaire, il n’existe qu’un nombre limité de conformations qu’un récepteur peut adopter. Afin d’établir un lien entre la structure et la fonction des récepteurs, nous avons choisi dans un premier temps, le récepteur de chimiokine CXCR4 comme récepteur modèle. Ce dernier, est une cible thérapeutique prometteuse, impliqué dans l’entrée du VIH-1 dans les cellules cibles et dans la dissémination de métastases cancéreuses. Grâce au transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) nous pouvons détecter les changements conformationnels des homodimères constitutifs de CXCR4 dans les cellules vivantes. En conséquence, nous avons mesuré les conformations de mutants de CXCR4 dont les mutations affecteraient sa fonction. Nous montrons que la capacité des mutants à activer la protéine Galphai est altérée suite au traitement avec l’agoniste SDF-1. Notamment, ces mutations altèrent la conformation du récepteur à l’état basal ainsi que la réponse conformationnelle induite suite au traitement avec l’agoniste SDF-1, l’agoniste partiel AMD3100 ou l’agoniste inverse TC14012. Ainsi, différentes conformations de CXCR4 peuvent donner lieu à une activation similaire de la protéine G, ce qui implique une flexibilité des récepteurs actifs qui ne peut pas être expliquée par le modèle du complexe ternaire (Berchiche et al. 2007). Également, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CCR2, exprimé à la surface des cellules immunitaires. Il joue un rôle important dans l’inflammation et dans des pathologies inflammatoires telles que l’asthme. CCR2 forme des homodimères constitutifs et possède différents ligands naturels dont la redondance fonctionnelle a été suggérée. Nous avons étudié le lien entre les conformations et les activations d’effecteurs (fonctions) de CCR2. Notre hypothèse est que les différents ligands naturels induisent différentes conformations du récepteur menant à différentes fonctions. Nous montrons que les réponses de CCR2 aux différents ligands ne sont pas redondantes au niveau pharmacologique et que les chimiokines CCL8, CCL7 et CCL13 (MCP-2 à MCP-4) sont des agonistes partiels de CCR2, du moins dans les systèmes que nous avons étudiés. Ainsi, l’absence de redondance fonctionnelle parmi les chimiokines liant le même récepteur, ne résulterait pas de mécanismes complexes de régulation in vivo, mais ferait partie de leurs propriétés pharmacologiques intrinsèques (Berchiche et al. 2011). Enfin, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CXCR7. Récemment identifié, CXCR7 est le deuxième récepteur cible de la chimiokine SDF-1. Cette chimiokine a été considérée comme étant capable d’interagir uniquement avec le récepteur CXCR4. Notamment, CXCR4 et CXCR7 possèdent un patron d’expression semblable dans les tissus. Nous avons évalué l’effet de l’AMD3100, ligand synthétique de CXCR4, sur la conformation et la signalisation de CXCR7. Nos résultats montrent qu’AMD3100, tout comme SDF-1, lie CXCR7 et augmente la liaison de SDF-1 à CXCR7. Grâce au BRET, nous montrons aussi qu’AMD3100 seul est un agoniste de CXCR7 et qu’il est un modulateur allostérique positif de la liaison de SDF-1 à CXCR7. Aussi, nous montrons pour la première fois le recrutement de la beta-arrestine 2 à CXCR7 en réponse à un agoniste. L’AMD3100 est un ligand de CXCR4 et de CXCR7 avec des effets opposés, ce qui appelle à la prudence lors de l’utilisation de cette molécule pour l’étude des voies de signalisation impliquant SDF-1 (Kalatskaya et al. 2009). En conclusion, nos travaux amènent des évidences qu’il existe plusieurs conformations actives des récepteurs et appuient les modèles de structure-activité des récepteurs qui prennent en considération leur flexibilité conformationnelle. / Ligand binding to 7TMRs is thought to induce conformational changes within the receptor that translate into activation of downstream effectors. The link between receptor conformation and activity is still poorly understood, as current models of receptor activation fail to take an increasing amount of experimental data into account. Classical pharmacological models such as the ternary complex model are based on the concept that receptors can only adopt a limited number of conformations. To clarify structure-function relationships in 7TMRs, first we studied chemokine receptor CXCR4. This receptor is an important drug target, involved in HIV-1 entry and cancer metastasis. Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) allows us to directly probe conformational changes within pre-formed CXCR4 homodimers in live cells. Using BRET, we measured the conformation of CXCR4 mutants and we also monitored their function by measuring their ability to induce Galphai activation. The analyzed mutants had substitutions in locations which are pivotal molecular switches for receptor conformation and activation. We show that agonist induced Gi activation is altered for most mutants. These mutations also alter CXCR4’s conformation at basal conditions (in absence of ligand) and in the presence of the agonist, SDF-1, the partial agonist, AMD3100 and the inverse agonist, TC14012. Moreover, different conformations of active receptors were detected in the presence of SDF-1, suggesting that different receptor conformations are able to trigger Galphai activity. These data provide biophysical evidence for different active receptor conformations, that cannot be explained by classical models of receptor function (Berchiche et al. 2007). Furthermore, the second part of our work focused on chemokine receptor CCR2. Mainly expressed on immune cells, CCR2 is involved in many inflammatory and vascular diseases. This receptor binds seven natural ligands that have been referred to as redundant. We set out to explore whether the different chemokine ligands of CCR2 receptor induce different conformational changes leading to different functional consequences. Our results show that the different natural ligands of CCR2 are not pharmacologically redundant. Moreover, chemokines CCL8, CCL7 and CCL13 (MCP-2 to MCP-4) are partial agonists of CCR2, at least in the systems we used. Our results support the validity of models for receptor-ligand interactions in which different ligands stabilize different receptor conformations also for endogenous receptor ligands, demonstrating that these natural ligands are not pharmacologically and functionally redundant (Berchiche et al. 2011). As the third part of this work, we studied chemokine receptor CXCR7, the alternative receptor for SDF-1. Until recently, CXCR4 was the only receptor known to bind SDF-1. Moreover, the expression patterns are similar for receptors CXCR4 and CXCR7. Therefore, we investigated the conformational and functional consequences of the synthetic inhibitor of CXCR4, AMD3100, on CXCR7. We show that AMD3100 also binds the alternative SDF-1 receptor, CXCR7. SDF-1 or AMD3100 alone trigger beta-arrestin recruitment to CXCR7, which we identify as a previously unreported signalling pathway of CXCR7. In addition, AMD3100 has positive allosteric effects on SDF-1 binding to CXCR7, on SDF-1-induced conformational rearrangements in the receptor dimer as measured by BRET, and on SDF-1-induced beta-arrestin recruitment to CXCR7. The finding that AMD3100 not only binds CXCR4, but also to CXCR7, with opposite effects on the two receptors, call for caution in the use of this compound as a tool to dissect SDF-1 effects on the respective receptors in vitro and in vivo. Finally, these data provide biophysical evidence for different active receptor conformations, and support models of 7TMR structure-activity relationships that take conformational heterogeneity into account.