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Le récepteur de chimiokine CXCR7 a été récemment identifié comme liant la chimiokine SDF-1, anciennement considérée comme ligand exclusif du récepteur CXCR4. Ces deux récepteurs sont exprimés majoritairement dans les mêmes types cellulaires et, ainsi, la découverte de CXCR7 incite à réévaluer les effets respectifs de SDF-1 sur CXCR4. Étant donné son rôle dans le cancer, CXCR4 est une cible de choix pour le développement de molécules thérapeutiques. Également, CXCR7 semble être impliqué dans la croissance tumorale. AMD3100, un antagoniste «sélectif» pour CXCR4, est maintenant commercialisé. Cet antagoniste a été identifié comme liant lui aussi CXCR7. De plus, sur CXCR7, l’AMD3100 agit comme agoniste puisqu’il induit le recrutement de la β-arrestine, à l’opposé de son effet sur. En revanche, AMD3100 n’induit pas le recrutement de la β-arrestine à CXCR4. Basé sur ces résultats, il est nécessaire de revoir la sélectivité d’autres antagonistes synthétiques de CXCR4. À l’aide de la technique de BRET (Résonance d’un transfert d’énergie par bioluminescence), nos résultats montrent que le Tc14012, un autre antagoniste synthétique de CXCR4, et structurellement distinct de l’AMD3100, interagit avec CXCR7. Contrairement à CXCR4, les deux antagonistes de CXCR4 agissent comme agonistes sur CXCR7 en induisant le recrutement de la β-arrestine. Nos résultats suggèrent que l’organisation spatiale du corps du récepteur serait responsable de cet effet opposé. En conclusion, AMD3100 et Tc14012 ne sont pas sélectifs pour CXCR4, puisqu’ils interagissent avec CXCR7. Lors du développement de nouvelles molécules synthétiques ciblant CXCR4, il serait alors nécessaire d’en évaluer leur sélectivité, et leurs effets en les testant aussi sur CXCR7. / ASBTRACT SDF-1 was at first thought to exclusively bind CXCR4, but it was subsequently found to also bind to the chemokine receptor CXCR7. CXCR4 is a promising target for drug development due to its role in cancer. AMD3100 is newly commercialised synthetic antagonist of CXCR4. This drug leads to massive release of hematopoietic stem cell into the peripheral blood. It was found that AMD3100 also binds to CXCR7 and acts as an agonist of β-arrestin recruitment to CXCR7. An antagonist of CXCR4 acts as an agonist on CXCR7. Prompted by this observation, we tested whether this might hold true for other CXCR4 antagonist. Tc14012, a peptidomimetic of T140, has been extensively described as a potent CXCR4 antagonist. We find that TC14012 also interacts on CXCR7. Like AMD3100, TC14012 alone induces β-arrestin recruitment to CXCR7. Thus, two structurally unrelated CXCR4 antagonists, AMD3100 and TC14012, are agonists of the CXCR7-arrestin pathway. This suggests distinct activation mechanisms of the arrestin pathway by CXCR4 and CXCR7. The results we obtained using a BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer)-based arrestin recruitment assay, suggest that the CXCR7 receptor core is responsible for the recruitment of beta-arrestin in response to AMD3100 and TC14012. The finding that both AMD3100 and TC14012 do not only bind CXCR4, but also CXCR7, with opposite effects on arrestin recruitment, is important for the use of the compounds as tools to dissect SDF-1-mediated effects. This may be a general feature of synthetic ligands of the two receptors, with potential consequences for drug development. Key words: Chemokine receptor, CXCR4 and CXCR7, BRET, β-arrestin recruitement, TC14012, AMD3100 and SDF-1.

RÉSUMÉ Le récepteur de chimiokine CXCR7 a été récemment identifié comme liant la chimiokine SDF-1, anciennement considérée comme ligand exclusif du récepteur CXCR4. Ces deux récepteurs sont exprimés majoritairement dans les mêmes types cellulaires et, ainsi, la découverte de CXCR7 incite à réévaluer les effets respectifs de SDF-1 sur CXCR4. Étant donné son rôle dans le cancer, CXCR4 est une cible de choix pour le développement de molécules thérapeutiques. Également, CXCR7 semble être impliqué dans la croissance tumorale. AMD3100, un antagoniste «sélectif» pour CXCR4, est maintenant commercialisé. Cet antagoniste a été identifié comme liant lui aussi CXCR7. De plus, sur CXCR7, l’AMD3100 agit comme agoniste puisqu’il induit le recrutement de la β-arrestine, à l’opposé de son effet sur. En revanche, AMD3100 n’induit pas le recrutement de la β-arrestine à CXCR4. Basé sur ces résultats, il est nécessaire de revoir la sélectivité d’autres antagonistes synthétiques de CXCR4. À l’aide de la technique de BRET (Résonance d’un transfert d’énergie par bioluminescence), nos résultats montrent que le Tc14012, un autre antagoniste synthétique de CXCR4, et structurellement distinct de l’AMD3100, interagit avec CXCR7. Contrairement à CXCR4, les deux antagonistes de CXCR4 agissent comme agonistes sur CXCR7 en induisant le recrutement de la β-arrestine. Nos résultats suggèrent que l’organisation spatiale du corps du récepteur serait responsable de cet effet opposé. En conclusion, AMD3100 et Tc14012 ne sont pas sélectifs pour CXCR4, puisqu’ils interagissent avec CXCR7. Lors du développement de nouvelles molécules synthétiques ciblant CXCR4, il serait alors nécessaire d’en évaluer leur sélectivité, et leurs effets en les testant aussi sur CXCR7. Mot-clés : Récepteur de chimiokine CXCR4 et CXCR7, BRET, recrutement de la β-arrestine, AMD3100, Tc14012 et SDF-1. / ASBTRACT SDF-1 was at first thought to exclusively bind CXCR4, but it was subsequently found to also bind to the chemokine receptor CXCR7. CXCR4 is a promising target for drug development due to its role in cancer. AMD3100 is newly commercialised synthetic antagonist of CXCR4. This drug leads to massive release of hematopoietic stem cell into the peripheral blood. It was found that AMD3100 also binds to CXCR7 and acts as an agonist of β-arrestin recruitment to CXCR7. An antagonist of CXCR4 acts as an agonist on CXCR7. Prompted by this observation, we tested whether this might hold true for other CXCR4 antagonist. Tc14012, a peptidomimetic of T140, has been extensively described as a potent CXCR4 antagonist. We find that TC14012 also interacts on CXCR7. Like AMD3100, TC14012 alone induces β-arrestin recruitment to CXCR7. Thus, two structurally unrelated CXCR4 antagonists, AMD3100 and TC14012, are agonists of the CXCR7-arrestin pathway. This suggests distinct activation mechanisms of the arrestin pathway by CXCR4 and CXCR7. The results we obtained using a BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer)-based arrestin recruitment assay, suggest that the CXCR7 receptor core is responsible for the recruitment of beta-arrestin in response to AMD3100 and TC14012. The finding that both AMD3100 and TC14012 do not only bind CXCR4, but also CXCR7, with opposite effects on arrestin recruitment, is important for the use of the compounds as tools to dissect SDF-1-mediated effects. This may be a general feature of synthetic ligands of the two receptors, with potential consequences for drug development. Key words: Chemokine receptor, CXCR4 and CXCR7, BRET, β-arrestin recruitement, TC14012, AMD3100 and SDF-1.

L’interaction d’un ligand avec un récepteur à sept domaines transmembranaires (7TMR) couplé aux protéines G, mène à l’adoption de différentes conformations par le récepteur. Ces diverses conformations pourraient expliquer l’activation différentielle des voies de signalisation. Or, le lien entre la conformation et l’activité du récepteur n’est pas tout à fait claire. Selon les modèles classiques pharmacologiques, comme le modèle du complexe ternaire, il n’existe qu’un nombre limité de conformations qu’un récepteur peut adopter. Afin d’établir un lien entre la structure et la fonction des récepteurs, nous avons choisi dans un premier temps, le récepteur de chimiokine CXCR4 comme récepteur modèle. Ce dernier, est une cible thérapeutique prometteuse, impliqué dans l’entrée du VIH-1 dans les cellules cibles et dans la dissémination de métastases cancéreuses. Grâce au transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) nous pouvons détecter les changements conformationnels des homodimères constitutifs de CXCR4 dans les cellules vivantes. En conséquence, nous avons mesuré les conformations de mutants de CXCR4 dont les mutations affecteraient sa fonction. Nous montrons que la capacité des mutants à activer la protéine Galphai est altérée suite au traitement avec l’agoniste SDF-1. Notamment, ces mutations altèrent la conformation du récepteur à l’état basal ainsi que la réponse conformationnelle induite suite au traitement avec l’agoniste SDF-1, l’agoniste partiel AMD3100 ou l’agoniste inverse TC14012. Ainsi, différentes conformations de CXCR4 peuvent donner lieu à une activation similaire de la protéine G, ce qui implique une flexibilité des récepteurs actifs qui ne peut pas être expliquée par le modèle du complexe ternaire (Berchiche et al. 2007). Également, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CCR2, exprimé à la surface des cellules immunitaires. Il joue un rôle important dans l’inflammation et dans des pathologies inflammatoires telles que l’asthme. CCR2 forme des homodimères constitutifs et possède différents ligands naturels dont la redondance fonctionnelle a été suggérée. Nous avons étudié le lien entre les conformations et les activations d’effecteurs (fonctions) de CCR2. Notre hypothèse est que les différents ligands naturels induisent différentes conformations du récepteur menant à différentes fonctions. Nous montrons que les réponses de CCR2 aux différents ligands ne sont pas redondantes au niveau pharmacologique et que les chimiokines CCL8, CCL7 et CCL13 (MCP-2 à MCP-4) sont des agonistes partiels de CCR2, du moins dans les systèmes que nous avons étudiés. Ainsi, l’absence de redondance fonctionnelle parmi les chimiokines liant le même récepteur, ne résulterait pas de mécanismes complexes de régulation in vivo, mais ferait partie de leurs propriétés pharmacologiques intrinsèques (Berchiche et al. 2011). Enfin, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CXCR7. Récemment identifié, CXCR7 est le deuxième récepteur cible de la chimiokine SDF-1. Cette chimiokine a été considérée comme étant capable d’interagir uniquement avec le récepteur CXCR4. Notamment, CXCR4 et CXCR7 possèdent un patron d’expression semblable dans les tissus. Nous avons évalué l’effet de l’AMD3100, ligand synthétique de CXCR4, sur la conformation et la signalisation de CXCR7. Nos résultats montrent qu’AMD3100, tout comme SDF-1, lie CXCR7 et augmente la liaison de SDF-1 à CXCR7. Grâce au BRET, nous montrons aussi qu’AMD3100 seul est un agoniste de CXCR7 et qu’il est un modulateur allostérique positif de la liaison de SDF-1 à CXCR7. Aussi, nous montrons pour la première fois le recrutement de la beta-arrestine 2 à CXCR7 en réponse à un agoniste. L’AMD3100 est un ligand de CXCR4 et de CXCR7 avec des effets opposés, ce qui appelle à la prudence lors de l’utilisation de cette molécule pour l’étude des voies de signalisation impliquant SDF-1 (Kalatskaya et al. 2009). En conclusion, nos travaux amènent des évidences qu’il existe plusieurs conformations actives des récepteurs et appuient les modèles de structure-activité des récepteurs qui prennent en considération leur flexibilité conformationnelle. / Ligand binding to 7TMRs is thought to induce conformational changes within the receptor that translate into activation of downstream effectors. The link between receptor conformation and activity is still poorly understood, as current models of receptor activation fail to take an increasing amount of experimental data into account. Classical pharmacological models such as the ternary complex model are based on the concept that receptors can only adopt a limited number of conformations. To clarify structure-function relationships in 7TMRs, first we studied chemokine receptor CXCR4. This receptor is an important drug target, involved in HIV-1 entry and cancer metastasis. Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) allows us to directly probe conformational changes within pre-formed CXCR4 homodimers in live cells. Using BRET, we measured the conformation of CXCR4 mutants and we also monitored their function by measuring their ability to induce Galphai activation. The analyzed mutants had substitutions in locations which are pivotal molecular switches for receptor conformation and activation. We show that agonist induced Gi activation is altered for most mutants. These mutations also alter CXCR4’s conformation at basal conditions (in absence of ligand) and in the presence of the agonist, SDF-1, the partial agonist, AMD3100 and the inverse agonist, TC14012. Moreover, different conformations of active receptors were detected in the presence of SDF-1, suggesting that different receptor conformations are able to trigger Galphai activity. These data provide biophysical evidence for different active receptor conformations, that cannot be explained by classical models of receptor function (Berchiche et al. 2007). Furthermore, the second part of our work focused on chemokine receptor CCR2. Mainly expressed on immune cells, CCR2 is involved in many inflammatory and vascular diseases. This receptor binds seven natural ligands that have been referred to as redundant. We set out to explore whether the different chemokine ligands of CCR2 receptor induce different conformational changes leading to different functional consequences. Our results show that the different natural ligands of CCR2 are not pharmacologically redundant. Moreover, chemokines CCL8, CCL7 and CCL13 (MCP-2 to MCP-4) are partial agonists of CCR2, at least in the systems we used. Our results support the validity of models for receptor-ligand interactions in which different ligands stabilize different receptor conformations also for endogenous receptor ligands, demonstrating that these natural ligands are not pharmacologically and functionally redundant (Berchiche et al. 2011). As the third part of this work, we studied chemokine receptor CXCR7, the alternative receptor for SDF-1. Until recently, CXCR4 was the only receptor known to bind SDF-1. Moreover, the expression patterns are similar for receptors CXCR4 and CXCR7. Therefore, we investigated the conformational and functional consequences of the synthetic inhibitor of CXCR4, AMD3100, on CXCR7. We show that AMD3100 also binds the alternative SDF-1 receptor, CXCR7. SDF-1 or AMD3100 alone trigger beta-arrestin recruitment to CXCR7, which we identify as a previously unreported signalling pathway of CXCR7. In addition, AMD3100 has positive allosteric effects on SDF-1 binding to CXCR7, on SDF-1-induced conformational rearrangements in the receptor dimer as measured by BRET, and on SDF-1-induced beta-arrestin recruitment to CXCR7. The finding that AMD3100 not only binds CXCR4, but also to CXCR7, with opposite effects on the two receptors, call for caution in the use of this compound as a tool to dissect SDF-1 effects on the respective receptors in vitro and in vivo. Finally, these data provide biophysical evidence for different active receptor conformations, and support models of 7TMR structure-activity relationships that take conformational heterogeneity into account.

L’interaction d’un ligand avec un récepteur à sept domaines transmembranaires (7TMR) couplé aux protéines G, mène à l’adoption de différentes conformations par le récepteur. Ces diverses conformations pourraient expliquer l’activation différentielle des voies de signalisation. Or, le lien entre la conformation et l’activité du récepteur n’est pas tout à fait claire. Selon les modèles classiques pharmacologiques, comme le modèle du complexe ternaire, il n’existe qu’un nombre limité de conformations qu’un récepteur peut adopter. Afin d’établir un lien entre la structure et la fonction des récepteurs, nous avons choisi dans un premier temps, le récepteur de chimiokine CXCR4 comme récepteur modèle. Ce dernier, est une cible thérapeutique prometteuse, impliqué dans l’entrée du VIH-1 dans les cellules cibles et dans la dissémination de métastases cancéreuses. Grâce au transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) nous pouvons détecter les changements conformationnels des homodimères constitutifs de CXCR4 dans les cellules vivantes. En conséquence, nous avons mesuré les conformations de mutants de CXCR4 dont les mutations affecteraient sa fonction. Nous montrons que la capacité des mutants à activer la protéine Galphai est altérée suite au traitement avec l’agoniste SDF-1. Notamment, ces mutations altèrent la conformation du récepteur à l’état basal ainsi que la réponse conformationnelle induite suite au traitement avec l’agoniste SDF-1, l’agoniste partiel AMD3100 ou l’agoniste inverse TC14012. Ainsi, différentes conformations de CXCR4 peuvent donner lieu à une activation similaire de la protéine G, ce qui implique une flexibilité des récepteurs actifs qui ne peut pas être expliquée par le modèle du complexe ternaire (Berchiche et al. 2007). Également, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CCR2, exprimé à la surface des cellules immunitaires. Il joue un rôle important dans l’inflammation et dans des pathologies inflammatoires telles que l’asthme. CCR2 forme des homodimères constitutifs et possède différents ligands naturels dont la redondance fonctionnelle a été suggérée. Nous avons étudié le lien entre les conformations et les activations d’effecteurs (fonctions) de CCR2. Notre hypothèse est que les différents ligands naturels induisent différentes conformations du récepteur menant à différentes fonctions. Nous montrons que les réponses de CCR2 aux différents ligands ne sont pas redondantes au niveau pharmacologique et que les chimiokines CCL8, CCL7 et CCL13 (MCP-2 à MCP-4) sont des agonistes partiels de CCR2, du moins dans les systèmes que nous avons étudiés. Ainsi, l’absence de redondance fonctionnelle parmi les chimiokines liant le même récepteur, ne résulterait pas de mécanismes complexes de régulation in vivo, mais ferait partie de leurs propriétés pharmacologiques intrinsèques (Berchiche et al. 2011). Enfin, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CXCR7. Récemment identifié, CXCR7 est le deuxième récepteur cible de la chimiokine SDF-1. Cette chimiokine a été considérée comme étant capable d’interagir uniquement avec le récepteur CXCR4. Notamment, CXCR4 et CXCR7 possèdent un patron d’expression semblable dans les tissus. Nous avons évalué l’effet de l’AMD3100, ligand synthétique de CXCR4, sur la conformation et la signalisation de CXCR7. Nos résultats montrent qu’AMD3100, tout comme SDF-1, lie CXCR7 et augmente la liaison de SDF-1 à CXCR7. Grâce au BRET, nous montrons aussi qu’AMD3100 seul est un agoniste de CXCR7 et qu’il est un modulateur allostérique positif de la liaison de SDF-1 à CXCR7. Aussi, nous montrons pour la première fois le recrutement de la beta-arrestine 2 à CXCR7 en réponse à un agoniste. L’AMD3100 est un ligand de CXCR4 et de CXCR7 avec des effets opposés, ce qui appelle à la prudence lors de l’utilisation de cette molécule pour l’étude des voies de signalisation impliquant SDF-1 (Kalatskaya et al. 2009). En conclusion, nos travaux amènent des évidences qu’il existe plusieurs conformations actives des récepteurs et appuient les modèles de structure-activité des récepteurs qui prennent en considération leur flexibilité conformationnelle. / Ligand binding to 7TMRs is thought to induce conformational changes within the receptor that translate into activation of downstream effectors. The link between receptor conformation and activity is still poorly understood, as current models of receptor activation fail to take an increasing amount of experimental data into account. Classical pharmacological models such as the ternary complex model are based on the concept that receptors can only adopt a limited number of conformations. To clarify structure-function relationships in 7TMRs, first we studied chemokine receptor CXCR4. This receptor is an important drug target, involved in HIV-1 entry and cancer metastasis. Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) allows us to directly probe conformational changes within pre-formed CXCR4 homodimers in live cells. Using BRET, we measured the conformation of CXCR4 mutants and we also monitored their function by measuring their ability to induce Galphai activation. The analyzed mutants had substitutions in locations which are pivotal molecular switches for receptor conformation and activation. We show that agonist induced Gi activation is altered for most mutants. These mutations also alter CXCR4’s conformation at basal conditions (in absence of ligand) and in the presence of the agonist, SDF-1, the partial agonist, AMD3100 and the inverse agonist, TC14012. Moreover, different conformations of active receptors were detected in the presence of SDF-1, suggesting that different receptor conformations are able to trigger Galphai activity. These data provide biophysical evidence for different active receptor conformations, that cannot be explained by classical models of receptor function (Berchiche et al. 2007). Furthermore, the second part of our work focused on chemokine receptor CCR2. Mainly expressed on immune cells, CCR2 is involved in many inflammatory and vascular diseases. This receptor binds seven natural ligands that have been referred to as redundant. We set out to explore whether the different chemokine ligands of CCR2 receptor induce different conformational changes leading to different functional consequences. Our results show that the different natural ligands of CCR2 are not pharmacologically redundant. Moreover, chemokines CCL8, CCL7 and CCL13 (MCP-2 to MCP-4) are partial agonists of CCR2, at least in the systems we used. Our results support the validity of models for receptor-ligand interactions in which different ligands stabilize different receptor conformations also for endogenous receptor ligands, demonstrating that these natural ligands are not pharmacologically and functionally redundant (Berchiche et al. 2011). As the third part of this work, we studied chemokine receptor CXCR7, the alternative receptor for SDF-1. Until recently, CXCR4 was the only receptor known to bind SDF-1. Moreover, the expression patterns are similar for receptors CXCR4 and CXCR7. Therefore, we investigated the conformational and functional consequences of the synthetic inhibitor of CXCR4, AMD3100, on CXCR7. We show that AMD3100 also binds the alternative SDF-1 receptor, CXCR7. SDF-1 or AMD3100 alone trigger beta-arrestin recruitment to CXCR7, which we identify as a previously unreported signalling pathway of CXCR7. In addition, AMD3100 has positive allosteric effects on SDF-1 binding to CXCR7, on SDF-1-induced conformational rearrangements in the receptor dimer as measured by BRET, and on SDF-1-induced beta-arrestin recruitment to CXCR7. The finding that AMD3100 not only binds CXCR4, but also to CXCR7, with opposite effects on the two receptors, call for caution in the use of this compound as a tool to dissect SDF-1 effects on the respective receptors in vitro and in vivo. Finally, these data provide biophysical evidence for different active receptor conformations, and support models of 7TMR structure-activity relationships that take conformational heterogeneity into account.

L'encéphalomyélite myalgique (EM) aussi connue sous le nom de syndrome de fatigue chronique est une maladie multi-systémique caractérisée par une fatigue extrême et un malaise post-effort, associés à d’autres symptômes débilitants comme l’intolérance orthostatique et des troubles du sommeil. L’EM se caractérise également par des altérations au niveau du système immunitaire et des perturbations du métabolisme énergétique affectant également le métabolisme des lipides. Dans ce contexte, nous avons exploré la contribution possible de la sphingomyéline phosphodiesterase acide 3b (SMPDL3B), produite par le gène SMPDL3B, dans la pathogénèse de l’EM. Celle-ci est une protéine multifonctionnelle ancrée par un groupement glycophosphatidylinositol (GPI) au niveau de la membrane des cellules. Cette enzyme a suscité notre intérêt compte tenu de son rôle dans la régulation de l'immunité innée et dans la conversion métabolique des sphingolipides en céramides. En effet, des études métabolomiques antérieures ont rapporté une réduction drastique des taux plasmatiques de céramides de 50% chez les hommes et de 86% chez les femmes souffrant d'EM. Nous proposons que l’élévation des niveaux circulants en SMPDL3B contribue à la sévérité de plusieurs symptômes chez les personnes atteintes d’EM (PAEM) via différents mécanismes. Les niveaux plasmatiques en SMPDL3B ont été mesurés par ELISA au niveau d’une cohorte prospective québécoise composée de PAEM (n=147) et de témoins sédentaires appariés pour le sexe et l’âge (n=62) n’ayant aucun antécédent familial d’EM. Nous avons également testé, par la même approche, des échantillons de plasma d’une cohorte norvégienne composée de PAEM (n=141). L’analyse de ces deux cohortes indépendantes a permis de mettre en évidence une corrélation positive entre les taux circulants en SMPDL3B et la sévérité des symptômes des PAEM. Nous avons également observé des niveaux plasmatiques plus élevés chez les PAEM atteints d’intolérance orthostatique lorsque comparés aux PAEM ne présentant pas ce symptôme. Finalement, nous avons confirmé à l’aide de la spectrométrie cellulaire diélectrique que la forme soluble de la protéine SMPDL3B peut se lier avec une haute affinité au récepteur de chimiokines CCR3 présent chez les cellules Jurkat et mis en évidence que l’occupation de ce récepteur par la chimiokine CCL11 ou un antagoniste pharmacologique pouvait augmenter la liaison de la forme soluble de la protéine SMPDL3B vers un autre récepteur membranaire qui demeure pour l’instant inconnu. Ce projet de maîtrise a permis une meilleure compréhension de la pathophysiologie de l’EM et de la contribution de la protéine SMPDL3B (forme ancrée et soluble) dans sa pathogénèse. / Myalgic encephalomyelitis (ME) also known as chronic fatigue syndrome is a multi-systemic disease characterized by extreme fatigue, post-exercise malaise, orthostatic intolerance, and sleep disturbances. ME is also characterized by alterations in the immune system and disturbances in energy metabolism that also affect lipid metabolism. In this context, we explored the possible contribution of sphingomyelin acid phosphodiesterase 3b, produced by the SMPDL3B gene, in the pathogenesis of ME. This is a multifunctional protein anchored by a glycophosphatidylinositol (GPI) group at the cell membrane. This enzyme has intrigued our interest given its role in the regulation of innate immunity and in the metabolic conversion of sphingolipids into ceramides. Indeed, previous metabolomics studies have reported a drastic reduction in plasma ceramide levels by 50% in men and 86% in women with ME. We propose that elevation of circulating levels of SMPDL3B increases the severity of several symptoms in persons with ME (PwME) via different mechanisms. Plasma levels of SMPDL3B were measured by ELISA in a Quebec cohort composed of PwME (n=147) and sedentary controls matched for sex and age (n=62) with no family history of ME. We also tested, by the same method, plasma samples from a Norwegian cohort composed of PwME (n=141). The analysis of these two independent cohorts revealed a positive correlation between SMPDL3B and the severity of PwME symptoms. We also observed higher plasma levels in PwMEs with orthostatic instability when compared to PwMEs without this symptom. Finally, we confirmed using dielectric cell spectrometry that the soluble form of the SMPDL3B protein can bind with high affinity to the CCR3 chemokine receptor present in Jurkat cells and demonstrated that the occupation of this receptor by the chemokine CCL11 or a pharmacological antagonist could increase the binding to another membrane receptor which remains unknown for the moment. This master's project allowed a better understanding of the pathophysiology of ME and the contribution of the SMPDL3B protein in its pathogenesis.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) forment la plus grande et la plus diversifiée des familles de protéines localisées à la surface cellulaire et responsables de la transmission de signaux à l’intérieur des cellules. D’intenses recherches effectuées au cours des trente dernières années ont mené à l’identification de dizaines de protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant la signalisation, la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation de ces importantes cibles pharmacologiques. Contrairement aux processus régulant l’activité des récepteurs à partir de la membrane plasmique, les mécanismes moléculaires contrôlant la biosynthèse des RCPGs dans le reticulum endoplasmique (RE) et leur transport jusqu’à la surface cellulaire sont très peu caractérisés. Une meilleure compréhension de ces processus nécessite l’identification de la machinerie protéique responsable de la maturation des RCPGs. Un crible protéomique basé sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), qui permet la mesure d’interactions protéiques dans les cellules vivantes, a mené à l’identification de plusieurs nouvelles protéines localisées dans la voie de sécrétion et interagissant potentiellement avec les RCPGs. Ces protéines étant localisées dans les compartiments cellulaires (reticulum endoplasmique et appareil de Golgi) responsables de la synthèse, du repliement adéquat et du transport à la membrane plasmique des récepteurs, il est très probable qu’elles soient impliquées dans le contrôle de l’expression des RCPGs à la surface cellulaire. La caractérisation de l’homologue humain de cornichon 4 (CNIH4), un nouvel intéracteur des RCPGs identifié dans le crible, a démontré que cette protéine localisée dans les compartiments précoces de la voie de sécrétion (RE et ERGIC) interagit de façon sélective avec les RCPGs. De plus, la suppression de l’expression endogène de cette protéine préalablement non-caractérisée, diminue le transport à la membrane plasmique d’un récepteur, indiquant que CNIH4 influence positivement l’export des RCPGs du RE. Ceci est supporté par l’observation que la surexpression de CNIH4 à de faibles niveaux favorise la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE. Nous avons également pu démontrer que CNIH4 est associée à la protéine Sec23, une des composantes de l’enveloppe des vésicules COPII qui sont responsables du transport des protéines du RE vers le Golgi, suggérant que CNIH4 pourrait favoriser le recrutement des récepteurs dans ces vésicules. La surexpression de CNIH4 à de très hauts niveaux provoque également la rétention intracellulaire des récepteurs. Cet effet dominant négatif pourrait être causé par la titration d’un autre facteur d’export des RCPGs. Une deuxième étude a permis de révéler que la protéine transmembranaire 9 (TMEM9), un nouvel intéracteur des RCPGs également identifié dans le crible, interagit sélectivement avec les récepteurs et avec CNIH4. La surexpression de cette protéine aux fonctions précédemment inconnues, rétablit le transport normal d’un récepteur en présence de CNIH4 surexprimée. De plus, la co-expression de TMEM9 potentialise la capacité de CNIH4 à augmenter la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE, suggérant que ces deux protéines forment un complexe régulant la maturation des RCPGs. Au cours de cette thèse, de nouvelles protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant leur expression à la membrane plasmique ont donc été identifiées, permettant une meilleure compréhension des mécanismes régulant le transport des récepteurs du RE à la surface cellulaire. / G protein coupled receptors (GPCR) form the largest and most diversified family of cell-surface receptors responsible for signal transduction inside the cells. Extensive research over the last thirty years have led to the identification of multiple proteins interacting with GPCRs and controlling the signalisation, desensitization, internalization and degradation of these important pharmaceutical targets. In contrast to the processes regulating GPCR activity at the plasma membrane, the molecular mechanisms controlling GPCR biogenesis in the endoplasmic reticulum (ER) and their transport to the cell-surface are poorly characterized. The identification of the proteins regulating GPCR maturation is essential in order to understand how receptors are expressed at the plasma membrane. A proteomic screen based on bioluminescence resonance energy transfer (BRET), which allows for the detection of protein-protein interaction in living cells, led to the identification of several potential novel GPCR interactors localized in the secretory pathway. Since the cellular compartments where these proteins are localized are responsible for the synthesis, proper folding and transport to the plasma membrane of the receptors, it is highly probable that they are involve in regulating GPCR cell-surface expression. The characterization of the human cornichon homolog 4 (CNIH4), a novel GPCR interactor identified in the screen, showed that this protein localized in the early secretory pathway (ER and ERGIC), selectively interacts with GPCRs. Knockdown of the endogenous expression of this previously uncharacterized protein led to a decrease in the cell-surface expression of a receptor indicating that CNIH4 has a positive function in the ER export of GPCR. Supporting this, over-expression of CNIH4 at low levels increased the maturation of a mutant receptor normally retained in the ER. Moreover, CNIH4 interacts with Sec23, a component of the inner coat of COPII vesicles which transport proteins from the ER to the Golgi apparatus, suggesting that CNIH4 could recruit GPCRs in these vesicles. CNIH4 over-expression at very high levels also resulted in the intracellular trapping of the receptors. This dominant negative effet could be caused by the titration of another component of the GPCR export process. Another study showed that the transmembrane protein 9 (TMEM9), a novel GPCR interactor also identified in the screen, selectively interacts with GPCRs and CNIH4. Over-expression of this protein of previously unknown function restored normal receptor trafficking in presence of over-expressed CNIH4. Morevover, co-expression of TMEM9 potentialized CNIH4 ability to increase the maturation of a mutant receptor normally retained in the ER, suggesting that these proteins form a complex regulating GPCR maturation. During this thesis, novel GPCR interacting proteins controlling receptor expression at the plasma membrane were identified, allowing for a better understanding of the mechanisms controlling receptor trafficking from the ER to the cell-surface.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) forment la plus grande et la plus diversifiée des familles de protéines localisées à la surface cellulaire et responsables de la transmission de signaux à l’intérieur des cellules. D’intenses recherches effectuées au cours des trente dernières années ont mené à l’identification de dizaines de protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant la signalisation, la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation de ces importantes cibles pharmacologiques. Contrairement aux processus régulant l’activité des récepteurs à partir de la membrane plasmique, les mécanismes moléculaires contrôlant la biosynthèse des RCPGs dans le reticulum endoplasmique (RE) et leur transport jusqu’à la surface cellulaire sont très peu caractérisés. Une meilleure compréhension de ces processus nécessite l’identification de la machinerie protéique responsable de la maturation des RCPGs. Un crible protéomique basé sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), qui permet la mesure d’interactions protéiques dans les cellules vivantes, a mené à l’identification de plusieurs nouvelles protéines localisées dans la voie de sécrétion et interagissant potentiellement avec les RCPGs. Ces protéines étant localisées dans les compartiments cellulaires (reticulum endoplasmique et appareil de Golgi) responsables de la synthèse, du repliement adéquat et du transport à la membrane plasmique des récepteurs, il est très probable qu’elles soient impliquées dans le contrôle de l’expression des RCPGs à la surface cellulaire. La caractérisation de l’homologue humain de cornichon 4 (CNIH4), un nouvel intéracteur des RCPGs identifié dans le crible, a démontré que cette protéine localisée dans les compartiments précoces de la voie de sécrétion (RE et ERGIC) interagit de façon sélective avec les RCPGs. De plus, la suppression de l’expression endogène de cette protéine préalablement non-caractérisée, diminue le transport à la membrane plasmique d’un récepteur, indiquant que CNIH4 influence positivement l’export des RCPGs du RE. Ceci est supporté par l’observation que la surexpression de CNIH4 à de faibles niveaux favorise la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE. Nous avons également pu démontrer que CNIH4 est associée à la protéine Sec23, une des composantes de l’enveloppe des vésicules COPII qui sont responsables du transport des protéines du RE vers le Golgi, suggérant que CNIH4 pourrait favoriser le recrutement des récepteurs dans ces vésicules. La surexpression de CNIH4 à de très hauts niveaux provoque également la rétention intracellulaire des récepteurs. Cet effet dominant négatif pourrait être causé par la titration d’un autre facteur d’export des RCPGs. Une deuxième étude a permis de révéler que la protéine transmembranaire 9 (TMEM9), un nouvel intéracteur des RCPGs également identifié dans le crible, interagit sélectivement avec les récepteurs et avec CNIH4. La surexpression de cette protéine aux fonctions précédemment inconnues, rétablit le transport normal d’un récepteur en présence de CNIH4 surexprimée. De plus, la co-expression de TMEM9 potentialise la capacité de CNIH4 à augmenter la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE, suggérant que ces deux protéines forment un complexe régulant la maturation des RCPGs. Au cours de cette thèse, de nouvelles protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant leur expression à la membrane plasmique ont donc été identifiées, permettant une meilleure compréhension des mécanismes régulant le transport des récepteurs du RE à la surface cellulaire. / G protein coupled receptors (GPCR) form the largest and most diversified family of cell-surface receptors responsible for signal transduction inside the cells. Extensive research over the last thirty years have led to the identification of multiple proteins interacting with GPCRs and controlling the signalisation, desensitization, internalization and degradation of these important pharmaceutical targets. In contrast to the processes regulating GPCR activity at the plasma membrane, the molecular mechanisms controlling GPCR biogenesis in the endoplasmic reticulum (ER) and their transport to the cell-surface are poorly characterized. The identification of the proteins regulating GPCR maturation is essential in order to understand how receptors are expressed at the plasma membrane. A proteomic screen based on bioluminescence resonance energy transfer (BRET), which allows for the detection of protein-protein interaction in living cells, led to the identification of several potential novel GPCR interactors localized in the secretory pathway. Since the cellular compartments where these proteins are localized are responsible for the synthesis, proper folding and transport to the plasma membrane of the receptors, it is highly probable that they are involve in regulating GPCR cell-surface expression. The characterization of the human cornichon homolog 4 (CNIH4), a novel GPCR interactor identified in the screen, showed that this protein localized in the early secretory pathway (ER and ERGIC), selectively interacts with GPCRs. Knockdown of the endogenous expression of this previously uncharacterized protein led to a decrease in the cell-surface expression of a receptor indicating that CNIH4 has a positive function in the ER export of GPCR. Supporting this, over-expression of CNIH4 at low levels increased the maturation of a mutant receptor normally retained in the ER. Moreover, CNIH4 interacts with Sec23, a component of the inner coat of COPII vesicles which transport proteins from the ER to the Golgi apparatus, suggesting that CNIH4 could recruit GPCRs in these vesicles. CNIH4 over-expression at very high levels also resulted in the intracellular trapping of the receptors. This dominant negative effet could be caused by the titration of another component of the GPCR export process. Another study showed that the transmembrane protein 9 (TMEM9), a novel GPCR interactor also identified in the screen, selectively interacts with GPCRs and CNIH4. Over-expression of this protein of previously unknown function restored normal receptor trafficking in presence of over-expressed CNIH4. Morevover, co-expression of TMEM9 potentialized CNIH4 ability to increase the maturation of a mutant receptor normally retained in the ER, suggesting that these proteins form a complex regulating GPCR maturation. During this thesis, novel GPCR interacting proteins controlling receptor expression at the plasma membrane were identified, allowing for a better understanding of the mechanisms controlling receptor trafficking from the ER to the cell-surface.