Th.--Méd.--Nancy 1, 1984. N°: 90.

Le PAF (Platelet-Activating Factor) est un médiateur reconnu pour son implication dans plusieurs effets physiologiques et pathologiques, particulièrement les états inflammatoires. À l'instar du PAF, les lymphocytes T Th17 sont aussi reconnus comme exerçant un rôle majeur dans la physiopathologie des maladies auto-immunes. L'objectif de ce projet est de déterminer s'il existe un lien entre ces deux composants. En fait, nous avons émis l'hypothèse que le PAF pourrait provoquer une production de cytokines spécifiques par les cellules présentatrices d'antigène qui elles, interagissant avec les lymphocytes T, pourraient mener ultimement à une différentiation en Th17. En effet, les cellules T ne peuvent interagir directement avec le PAF puisqu'elles n'expriment pas de récepteur pour celui-ci à leur surface. Les cellules T Th17 expriment un facteur de transcription spécifique RORr, nécessitent absolument la sous-unité IL-23p19 pour leur expansion et produisent IL-17. Nous avons donc, dans un premier temps, regardé la capacité d'un type de cellules présentatrices d'antigène, les cellules de Langerhans à produire IL-23p19 en réponse au PAF. Ensuite, nous avons mis en contact ces cellules de Langerhans pré-stimulées au PAF avec des lymphocytes T activés pendant 5 jours pour vérifier l'expression de RORII et la production d'IL-17 dans ces lymphocytes T, plus précisément les lymphocytes T CD4 + . Cette étude nous a permis de mettre en évidence que certains éléments impliqués dans les processus inflammatoires sont possiblement inséparables et interagissent probablement les uns avec les autres pour mener aux séquelles multiples de l'inflammation.

Th.--Méd.--Nancy 1, 1984. N°: 87.

Le cancer du col utérin est précédé par des lésions prénéoplasiques. Celles-ci sont associées dans plus de 95% des cas à une infection par un papillomavirus (HPV). Un phénomène fréquent durant la cancérogenèse cervicale est l'intégration du génome dun HPV oncogène dans lADN cellulaire. Celle-ci entraîne une expression sélective de gènes codant pour des oncoprotéines virales (appelées E6 et E7) capables d'inactiver les produits de certains gènes suppresseurs de tumeurs (p53, p21, pRb) ou dinteragir avec dautres protéines cellulaires impliquées dans le contrôle du cycle cellulaire. Des travaux antérieurs du laboratoire daccueil suggèrent que le développement du cancer du col utérin est associé à une faible capacité de présentation dantigènes au système immunitaire, comme le démontre la rareté et le déficit fonctionnel des cellules de Langerhans (LC, cellules dendritiques ayant une fonction professionnelle de présentation antigénique au niveau de la peau et des muqueuses) dans les lésions (pré)cancéreuses cervicales. Ces altérations pourraient empêcher une réponse immunitaire efficace et faciliter la persistance du virus ainsi que la progression tumorale. Il est actuellement bien admis que les kératinocytes (cellules cibles de linfection par HPV) sont susceptibles dinfluencer les réactions immunitaires au niveau de la peau et des muqueuses épidermoïdes par lintermédiaire de facteurs solubles, les chémokines (CCL20, contrôlant linfiltration des LC immatures au sein de lépithélium) ou de contacts membranaires (E-cadhérine). Les kératinocytes infectés par HPV pourraient se différencier des cellules normales pour la production de ces facteurs, ce qui pourrait contribuer aux altérations des cellules de Langerhans/cellules dendritiques (LC/DC) observées dans les lésions (pré)cancéreuses cervicales. Le fait que la molécule dadhésion E-cadhérine intervienne dans lattachement des LC aux kératinocytes suggère limportance de cette molécule dadhésion dans la rétention des CL au sein de lépithélium cervical. Les objectifs de ce travail ont été détudier linfluence des oncogènes viraux sur lexpression de facteurs immunitaires et dexaminer les conséquences de linhibition de E6 et de E7 sur lexpression de la E-cadhérine et de CCL20, qui jouent un rôle important dans limmunosurveillance au niveau des épithélia via leur action sur les cellules de Langerhans. En accord avec notre hypothèse, nous avons montré une diminution de lexpression de la E-cadhérine dans les lésions (pré)néoplasiques du col par rapport à lépithélium exocervical normal (Hubert et coll. 2005). Par des expériences dARN interférence (siRNA), nous avons également démontré limplication de loncoprotéine virale E7 dans linhibition de lexpression de la E-cadhérine membranaire (Caberg et coll. 2008) et limplication des oncoprotéines virales E6 et E7 dans la diminution de la sécrétion de la chémokine CCL20 dans des kératinocytes transformés par HPV16 (Caberg et coll. 2008).

Le follicule pileux (FP) est un appendice cutané animé par un cycle régénératif dynamique provoquant des modifications de son microenvironnement. Les cellules de Langerhans (CLs), sentinelles de l’épiderme, sont en partie localisées à proximité du FP. Cette association spatiale nous a conduit à explorer le possible impact du cycle pileux sur l’homéostasie des CLs. Durant mon doctorat, nous avons mis en évidence (1) une augmentation de la prolifération des CLs au cours de l’anagène (phase de pousse du poil), (2) le mécanisme moléculaire sous-jacent impliquant une variation d’expression folliculaire de l’IL-34, une cytokine cruciale dans l’homéostasie des CLs et (3) un départ accru des CLs vers les ganglions lymphatiques en catagène (phase de régression du FP) concomitant avec le recrutement de cellules susceptibles d’être des précurseurs des CLs.Par ailleurs, la structure de la peau ainsi que la densité et le type de FP peuvent varier selon la région corporelle considérée. Nous avons émis l’hypothèse de variations locales dans la composition du système immunitaire cutané. Notre étude, focalisée sur les cellules dendritiques cutanées, a démontré l’existence d’une hétérogénéité de ces cellules en fonction de la zone de peau considérée. / The hair follicle (HF) is a skin appendage endowed with a dynamic regenerating cycle. This renewal remodels the HF microenvironment. Langerhans cells (LCs) are epidermal immune sentinels, a part of which localizes close to the HF. This spatial association led us to explore whether the HF cycle could impact on LC homeostasis. During my doctorate, we uncovered an anagen (HF growing phase)-associated burst of LC proliferation with dividing cells associated with the HF. Using mouse models of HF loss and hair cycle manipulation, we showed that HFs are dispensable for initial formation of the LC network but critical for the proliferation burst. We correlated it to a cyclic variation of IL-34 expression, a crucial cytokine for LC homeostasis, by a specific subset of HF cells. In addition, catagen (HF regression phase) is characterized by the departure of LCs to draining lymph nodes and the concomitant recruitment of a potential LC precursor.The skin structure as well as the density and type of HFs vary across body areas. This observation led us to assess the possibility of local variations in skin immune cells composition. Our study, focused on cutaneous dendritic cells, highlighted an heterogeneity in those cells according to the skin area considered.

La métaplasie épithéliale est un phénomène d'adaptation tissulaire apparaissant à la suite d'une agression chronique. Caractérisées par le remplacement d'un épithélium par un autre, ces transformations métaplasiques peuvent apparaître dans différentes régions anatomiques (bronches, sophage, col de l'utérus, estomac et vessie). Bien que mieux adapté à résister à un agent irritatif, l'épithélium métaplasique présente cependant une susceptibilité accrue au développement cancéreux. Ainsi, la grande majorité (87%) des lésions (pré)néoplasiques cervicales se développe au sein du microenvironnement métaplasique de la zone de transformation du col utérin. Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse ont contribué à une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la métaplasie épidermoïde cervicale et ont démontré, pour la première fois, une implication du TGF-β1 et de la PGE2 dans limmunodéficience locale observée dans les foyers de métaplasie mature et immature. Ainsi, en réduisant lexpression de E-cadhérine, le TGF-β1 altère indirectement la rétention épithéliale des cellules présentatrices dantigène en empêchant leurs interactions avec les cellules épithéliales. Quant à la PGE2, elle affecte la migration et le phénotype de ces cellules immunitaires, les rendant tolérogènes et, par conséquent, incapables dactiver les lymphocytes T naïfs. Par ailleurs, il est possible que la réduction de ΔNp63 par les facteurs de transcription Snail et Slug participe à la mise en place des épithélia métaplasiques ainsi quà leur transformation maligne.

La nature des cellules dendritiques (DC) engagées lors d'une vaccination conditionne la qualité de la réponse immunitaire adaptative. L'immunisation par la peau est particulièrement efficace car elle cible de nombreuses sous-populations de DC cutanées telles que les cellules de Langerhans (LC). Cependant, les relations entre ces DC et les cellules effectrices associées à la réponse humorale ne sont pas connues. L'objectif de ma thèse est d'identifier les mécanismes cellulaires précoces impliqués dans l'initiation de la réponse humorale, dans un contexte de vaccination intradermique (i.d.) avec un antigène particulaire. En étudiant la distribution spatiale et temporelle des particules synthétiques de PLA adsorbées par la protéine p24 du VIH, nous avons observé leur prise en charge par les DC cutanées mais également par les DC résidentes des ganglions drainant de la peau. Cependant, l'étude de la réponse immunitaire a démontré que seules les cellules cutanées, et en particulier les LC, induisent la polarisation des lymphocytes T CD4+ folliculaires (TFH) et le développement des lymphocytes B sécrétant des IgA. L'immunisation i.d. a également généré l'infiltration de cellules inflammatoires au niveau du site d'injection et du ganglion. En utilisant un modèle murin Ccr2-/-, nous avons démontré que les cellules dépendantes de CCR2+ interfèrent avec la formation des TFH. Enfin, l'étude du micro-environnement ganglionnaire suggère que TNF est favorable à la polarisation des TFH. En conclusion, ces résultats soulignent l'importance de cibler les DC cutanées lors de la vaccination afin de proposer de nouvelles stratégies vaccinales. / The quality of the adaptive immune response to a vaccine is driven by the nature of dendritic cells (DCs) engaged during vaccination. Skin immunization is particularly efficient as it targets the numerous cutaneous DCs, including Langerhans cells (LCs). However, the relationship between DCs and effector cells associated with humoral immunity has not been elucidated. The main objective of my thesis was to identify cellular mechanisms implicated in the initialization of the humoral immune response, in the context of intradermal (i.d.) vaccination with particle-based antigens. In examining the spatial and temporal distribution of synthetic PLA particles adsorbed with the HIV-p24 protein, we observed their uptake by both cutaneous DCs and also skin-draining lymph node (dLNs) resident DCs. However, our immune response study highlighted that only skin cells, and in particular LCs, were able to stimulate polarization of follicular helper T cells (TFH) and the development of IgA-secreting B lymphocytes. I.d. vaccination also induced an inflammatory cell infiltration at both the injection site and in dLNs. Using a Ccr2-/- mouse model, we have shown the CCR2+ dependant cells can interfere in TFH polarization. Finally, the study of the dLN micro-environment suggested TNF can promote TFH formation. In conclusion, these findings highlight the importance of targeting skin DC in vaccination to propose new vaccine strategies.

Les cellules dendritiques jouent un rôle primordial dans le système immunitaire. En effet, ces cellules sont à l'interface entre l'immunité innée et adaptative par leur capacité de reconnaissance, d'internalisation et de dégradation de pathogènes afin de présenter des antigènes aux lymphocytes. La capacité de reconnaissance est engendrée par l'expression de différents récepteurs à la surface de ces cellules. Parmi ces récepteurs, deux grandes familles permettent la reconnaissance d'un large panel de différents pathogènes, comme les TLRs (" Toll-Like Receptors) et les lectines de type-C. Ces récepteurs sont utilisés comme marqueurs des différents sous-types de cellules dendritiques. Par exemple, parmi les lectines de type-C, DC-SIGN est majoritairement exprimée dans les cellules dendritiques dermiques alors que la Langérine est, quand à elle, fortement exprimée par les cellules dendritiques épidermiques, les cellules de Langerhans. Ces deux sous-types de cellules dendritiques divergent par leur réponse à l'infection par le VIH (" virus d'immunodéficience humain "). En effet, le virus utilise DC-SIGN pour détourner le rôle de ces cellules afin d'infecter les lymphocytes T alors que la reconnaissance du VIH par la Langérine, dans les cellules de Langerhans, conduit à la clairance de virus par son internalisation dans le granule de Birbeck. Cet organite est spécifique des cellules de Langerhans et nécessite l'expression de la Langérine. Ce travail de thèse s'est donc focalisé sur la caractérisation structurale et fonctionnelle de la Langérine. Il a permis de mettre en évidence l'importance de la structure tertiaire du domaine CRD et de la structure quaternaire de la protéine pour la formation et la bonne structuration du granule de Birbeck. Ensuite, l'étude fonctionnelle de cette lectine, notamment par résonance plasmonique de surface, nous a conduit à identifier une nouvelle spécificité de reconnaissance de la Langérine pour les glycosaminoglycanes dans un site d'interaction différent du site canonique. Enfin, nous avons caractérisé une spécificité de reconnaissance du site canonique pour les monosaccharides sulfatés de type glucosamine en utilisant la résonance plasmonique de surface et la cristallographie.

Les cellules dendritiques jouent un rôle primordial dans le système immunitaire. En effet, ces cellules sont à l'interface entre l'immunité innée et adaptative par leur capacité de reconnaissance, d'internalisation et de dégradation de pathogènes afin de présenter des antigènes aux lymphocytes. La capacité de reconnaissance est engendrée par l'expression de différents récepteurs à la surface de ces cellules. Parmi ces récepteurs, deux grandes familles permettent la reconnaissance d'un large panel de différents pathogènes, comme les TLRs (« Toll-Like Receptors) et les lectines de type-C. Ces récepteurs sont utilisés comme marqueurs des différents sous-types de cellules dendritiques. Par exemple, parmi les lectines de type-C, DC-SIGN est majoritairement exprimée dans les cellules dendritiques dermiques alors que la Langérine est, quand à elle, fortement exprimée par les cellules dendritiques épidermiques, les cellules de Langerhans. Ces deux sous-types de cellules dendritiques divergent par leur réponse à l'infection par le VIH (« virus d'immunodéficience humain »). En effet, le virus utilise DC-SIGN pour détourner le rôle de ces cellules afin d'infecter les lymphocytes T alors que la reconnaissance du VIH par la Langérine, dans les cellules de Langerhans, conduit à la clairance de virus par son internalisation dans le granule de Birbeck. Cet organite est spécifique des cellules de Langerhans et nécessite l'expression de la Langérine. Ce travail de thèse s'est donc focalisé sur la caractérisation structurale et fonctionnelle de la Langérine. Il a permis de mettre en évidence l'importance de la structure tertiaire du domaine CRD et de la structure quaternaire de la protéine pour la formation et la bonne structuration du granule de Birbeck. Ensuite, l'étude fonctionnelle de cette lectine, notamment par résonance plasmonique de surface, nous a conduit à identifier une nouvelle spécificité de reconnaissance de la Langérine pour les glycosaminoglycanes dans un site d'interaction différent du site canonique. Enfin, nous avons caractérisé une spécificité de reconnaissance du site canonique pour les monosaccharides sulfatés de type glucosamine en utilisant la résonance plasmonique de surface et la cristallographie. / Dendritic cells play a crucial role in the immune system. Indeed, these cells are at the interface between innate and acquired immunity by their capacities of recognition, internalisation and pathogen degradation to present antigens to T lymphocytes. The recognition capacity is generated by the expression of diverse receptors onto the cell surface. Among these receptors, two large families allow the recognition of a large panel of different pathogens, as TLRs (“Toll-Like Receptor) and C-type lectins. These receptors are used as markers of different dendritic cells subtypes. For example, and among the C-type lectins, DC-SIGN is mainly expressed onto dermic dendritic cells contrary to langerin, which is highly expressed onto epidermic dendritic cells, called Langerhans cells. These two subtypes of dendritic cells differ in their response of HIV infection. Indeed, the virus recognition by DC-SIGN enables hijacking the dendritic cell to infect T lymphocyte contrary to langerin recognition, in Langerhans cells, which allows the clearance of the virus by its internalisation into Birbeck granules. This organite is specific of Langerhans cells and requires langerin expression. This work is focused on structural and functional characterisation of langerin. It highlights the importance of the CRD tertiary structure and the quaternary structure of the protein for the formation and the structure of Birbeck granules. Then, functional study by surface plasmon resonance enabled us to identify a new binding site of langerin for glycosaminoglycans. Finally, we have characterised a recognition specificity of langerin for sulphated monosaccharide of glucosamine type using surface plasmon resonance and crystallography.

Ma thèse a permis de développer une nouvelle approche pour étudier, par imagerie in vivo, le comportement des cellules présentatrices d’antigènes (CPA) de la peau suite à la vaccination par voie intradermique chez le primate non-humain. Le ciblage des CPA a été réalisé par injection in vivo d’un anticorps monoclonal anti-HLA-DR fluorescent. L’effet sur les CPA d’un adjuvant (R-848, ligand du TLR7/8) et l’immuno-ciblage des cellules de Langerhans par une protéine de fusion vaccinale anti-VIH (anti-langérine-VIHGag) ont ainsi été évalués par imagerie in vivo, vidéomicroscopie confocale ex vivo et cytométrie en flux. Ce travail a contribué à améliorer nos connaissances immunologiques sur les effets locaux et précoces des vaccins et /ou adjuvants. / My pHD project allowed the development of in vivo imaging approaches to study the skin antigen presenting cell (APC) behavior post-intradermal vaccination in non-human primates. APC targeting was performed by in vivo injection of fluorescent anti-HLA-DR monoclonal antibody. The effect of an adjuvant (R-848, ligand of TLR7/8) on skin APC and the immunotargeting of Langerhans cells by anti-HIV vaccinal fusion protein (anti-langerin-HIVGag) were assessed by in vivo fluorescent imaging, ex vivo confocal videomicroscopy and flow cytometry. This work contributed to improve immunological knowledge on local and early events post-vaccination with or without adjuvant.