Notre laboratoire a développé une stratégie d'isolement de fragments d'anticorps recombinants à partir de primates non humains (Macaca fascicularis) immunisés, en utilisant la technologie des phages. Dans le cadre de cette thèse, une comparaison des séquences d'anticorps de macaques (Macaca Mulatta) et d'anticorps humains a toutefois montré que les anticorps des deux espèces présentent des différences qui rendent souhaitable une étape d'humanisation des anticorps de macaques. Cette stratégie a été utilisée dans le cadre du projet Européen AntiBotABE (www.antibotabe.com) et l'étape de criblage a été adaptée pour isoler des scFv neutralisant de façon croisée les toxines botuliques BoNT/B des sous-types B1 et B2, en utilisant séquentiellement l'holotoxine BoNT/B1 et un fragment recombinant représentant la région C-terminale de la chaîne lourde de BoNT/B2. Le meilleur scFv ciblant les régions C-terminales des chaînes lourdes de BoNT/B1 et BoNT/B2, B2-7, a montré une bonne capacité de neutralisation de BoNT/B1 et BoNT/B2 dans le test ex vivo de paralysie hémidiaphragmatique. Les régions charpentes du scFv B2-7 ont un pourcentage d'identité élevé (80 %) avec leurs homologues humains. Des scFv neutralisant BoNT/A1 en ciblant sa chaîne légère ont aussi été isolés, dont le scFv le plus efficace, 2H8, induit une diminution de 50% de l'activité endopeptidasique à une concentration correspondant à un rapport molaire 2H8/BoNT/A1 de 64000. Les régions charpentes de 2H8 ont également un pourcentage d'identité élevée (88%) avec leurs homologues humains. La versatilité de cette stratégie en fait un outil permettant l'isolement de nombreux autres fragments d'anticorps à visée thérapeutique. / Our laboratory has developed a strategy to isolate recombinant antibody fragments technology from immunized non human primates (Macaca fascicularis) by phage display. In the course of the present thesis, a comparison between macaque (Macaca mulatta) and human antibody sequences has demonstrated that antibodies of the two species are different. This difference makes the humanization of macaque antibodies desirable. The strategy was used in the framework of the European AntiBotABE project, and the screening was adapted to isolate antibody fragments cross neutralizing the B1 and B2 subtypes of botulinum B neurotoxin, by using sequentially the holotoxin BoNT/B1 and a recombinant fragment representing the C-terminal region of the heavy chain of BoNTB2. The best scFv targeting the C-terminal region of BoNT/B1 and BoNTB2 heavy chains, B2-7, demonstrated a high capacity to neutralize BoNT/B1 and BoNT/B2 in the ex vivo hemidiaphragmatic assay. A high identity (80%) between the framework regions of B2-7 and their human homologs was observed. ScFvs neutralizing BoNT/A1 by targeting its light chain were also isolated and among them, the scFv 2H8 induced a decrease of 50% in the endopeptidase activity at a concentration corresponding to a molar ratio of 2H8/BoNT/A1 of 64000. A high identity (88%) between the framework regions of 2H8 and their human homologs was also observed. Our strategy can be used to isolate other therapeutic antibody fragments.

Comment les agents anesthésiques induisent-ils une perte de conscience lors de l’anesthésie générale? La dissection des mécanismes neuronaux de l’anesthésie générale représente un défi important en neurosciences. L’émergence de l’IRM fonctionnelle (IRMf) chez le primate non-humain donne l’occasion d’étudier l’activité neuronale à l’état éveillé et sous anesthésie en s’affranchissant des contraintes cliniques. Le développement récent de paradigmes auditifs, tel que le paradigme ‘local-global’, qui explore spécifiquement les réseaux cérébraux impliqués dans l’état conscient, nous a permis d’émettre l’hypothèse que la combinaison de l’IRMf chez le primate, de paradigmes auditifs et de protocoles d’anesthésie contrôlés par l’électroencéphalogramme (EEG), pourraient aider à disséquer les mécanismes neuronaux de l’anesthésie générale.Dans une première étape, étant donnée l’utilisation extensive de l’IRM dans notre travail, il était important d’étudier systématiquement l’effet des agents anesthésiques sur l’oxygénation vasculaire cérébrale, paramètre critique pour le signal IRMf. Nous avons donc réalisé une expérience préliminaire, faisant appel à l’IRM à ultra-haut champ magnétique chez le rongeur, afin de détecter les éventuels modifications du signal T2* induits par chacun des agents anesthésiques. Nous avons pu démontrer que le propofol et la kétamine, deux agents anesthésiques utilisés en clinique, affectaient moins l’oxygénation sanguine cérébrale que les anesthésiques volatils.Dans une deuxième étape, nous avons développé une « boîte à outils » pour l’IRMf chez le primate éveillé et anesthésié, et avons validé notre dispositif expérimental avec un paradigme auditif basé sur des sons simples (basse et haute fréquence).Dans une troisième étape, nous avons testé le paradigme auditif ‘local-global’ chez le macaque éveillé et avons pu démontrer que le cerveau du macaque est capable d’un codage prédictif hiérarchique à travers un espace de travail global, composé d’un réseau fronto-pariéto-cingulaire, montrant une forte homologie avec celui de l’Homme.Dans une quatrième étape, nous avons testé le paradigme auditif ‘local-global’, chez le macaque anesthésié et avons pu démontrer une désorganisation progressive de l’espace de travail global neuronal sous anesthésie. Cette désorganisation a été proportionnelle au niveau de sédation sous propofol, et complète sous sédation profonde à la kétamine. Ces résultats sont compatibles avec l’hypothèse selon laquelle le mécanisme de la perte de conscience sous anesthésie, est lié à une désorganisation de l’organisation fonctionnelle hiérarchique de l’espace de travail neuronal. Le cortex pariétal apparaît comme une cible commune aux deux agents anesthésiques.Dans la dernière étape, nous avons étudié le réseau cérébral par défaut (« default mode network ») chez le macaque éveillé et anesthésié. Nous avons pu démontrer que sous anesthésie, le cerveau présentait encore des patrons de connectivité distincts et riches, mais que ces patrons étaient fortement liés à l’organisation anatomique sous-jacente, alors que, à l’état éveillé cette organisation se caractérisait par un haut degré de flexibilité temporelle ce qui permet une exploration non-stéréotypée d’une plus grande variété d’états cérébraux.En conclusion, les agents anesthésiques entraînent une désorganisation de l’espace de travail global neuronal, avec pour conséquence l’altération des dynamiques temporelles de l’activité cérébrale spontanée, induisant ainsi une suppression de la conscience. / How can anesthetics induce a loss of consciousness during general anesthesia? A major challenge in neuroscience is to dissect the mechanisms of general anesthesia, which is quite difficult to achieve in the clinical conditions. The dawning of monkey functional MRI (fMRI) in neuroscience is an important opportunity to investigate neuronal activity in awake and anesthetized conditions. The recent development of auditory paradigms, such as the ‘local-global’ paradigm, that specifically explore brain networks thought to be specific of the conscious state led us to hypothesize that the combination of primate fMRI, auditory paradigms and single-drug anesthetic protocols with electroencephalography (EEG) control would help dissect the neuronal mechanisms of general anesthesia. In a first step, because we planned an extensive use of fMRI in our work, it was key to screen anesthetic agents for their effects on brain vascular oxygenation, a critical parameter for fMRI signal. Thus we did a preliminary experiment using ultra-high field MRI in rodents to assess subtle changes of the T2* signal under different anesthetic conditions and could demonstrate that propofol and ketamine, both clinical anesthetics, affects less brain blood oxygenation than volatile agents. In a second step, we developed a toolbox for awake and anesthetized monkey fMRI and validated the experimental set-up with a simple sound paradigm (low and high frequency sounds). In the third step, we tested the ‘local-global’ auditory paradigm in awake monkeys and could demonstrate that the macaque brain was capable of hierarchical predictive coding through a hypothetical macaque Global Neuronal Workspace made of frontal, parietal and cingulate cortices, in a striking homology with humans. In the fourth step, we tested the ‘local-global’ auditory paradigm in anesthetized monkeys and could demonstrate a progressive disorganization of the macaque GNW under anesthesia when increasing the levels of propofol sedation, and a complete suppression of the macaque GNW under deep ketamine sedation. These results are compatible with the hypothesis that the mechanism of loss of consciousness under anesthesia is related to the disorganization of a hierarchical GNW, with the parietal cortex as a common target among anesthetics. In the final step we studied the default network by acquiring resting state in awake and anesthetized monkeys and could demonstrate that under anesthesia, the brain still exhibits distinct and rich connectivity patterns, but these patterns become strongly related to the underlying white-matter structural map in a monotonic manner, while the awake state is characterized by a high degree of temporal flexibility which allows for a non-stereotyped exploration of a greater variety of brain states. In conclusion, by disorganizing the GNW, anesthetics alter the temporal dynamics of spontaneous brain activity, and specifically its departure from mere random fluctuations along established anatomical routes, leading to consciousness suppression.

La compréhension des mécanismes impliqués dans les maladies neurodégénératives ou développementales ainsi que la mise en place de nouvelles approches thérapeutiques reposent sur l’utilisation de modèles expérimentaux pertinents et de techniques d’imagerie adaptées. Dans ce contexte, l’IRM est un outil de choix pour l’exploration anatomique in vivo dans la mesure où elle permet d’effectuer un suivi longitudinal. Le succès translationnel des thérapies du laboratoire au patient repose sur une bonne caractérisation des modèles et une continuité des biomarqueurs utilisés. Or, si l'IRM est disponible en préclinique et en clinique, les outils d'analyse sont peu « génériques ». Au cours de cette thèse, en s'inspirant des travaux menés chez l'Homme, nous avons développé et validé des outils automatiques de segmentation des structures neuroanatomiques chez le Macaque. La méthode proposée repose sur la mise en registre avec l'IRM du sujet d'un atlas digital probabiliste suivi de l'optimisation d'un modèle statistique par mélanges de gaussiennes et champs aléatoires de Markov. Elle a été validée chez un ensemble de sujets sains adultes puis mise en application dans le contexte du développement néonatal normal du cerveau. Afin de poser les bases d'une évaluation permettant une comparaison des biomarqueurs IRM avec les biomarqueurs post mortem de référence, nous avons également mis au point une chaîne de traitement permettant la reconstruction 3D de volumes histologiques du cerveau de Macaque et l'avons appliqué à la caractérisation du contraste IRM au cours d'une greffe de cellules souches après lésion excitotoxique. / Understanding the mechanisms involved in neurodegenerative or developmental diseases and designing new therapeutic approaches are based on the use of relevant experimental models as well as appropriate imaging techniques. In this context, MRI is a prominent tool for in vivo investigation as it allows for longitudinal follow-up. Successful translation from bench to bedside calls for well-characterized models as well as transferable biomarkers. Yet, despite the existence of both clinical and preclinical scanners, analysis tools are hardly translational. In this work, inspired by standards developed in Humans, we've built and validated tools for the automated segmentation of neuroanatomical structures in the Macaque. This method is based on the registration of a digital probabilistic atlas followed by the fitting of a statistical model consisting of a gaussian mixture and Markov random fields. It was first validated in healthy adults and then applied to the study of neonatal brain development. Furthermore, to pave the way for comparisons with gold standard post mortem biomarkers, we developed a pipeline for the automated 3D reconstruction of histological volumes that we applied to the characterization of MRI contrast in a stem-cell graft following an excitotoxic lesion.

La coqueluche est une pathologie due à la bactérie Bordetella pertussis qui touche les voies respiratoires des patients infectés causant toux, leucocytose, fièvre, et dont les symptômes peuvent aller jusqu’au décès chez les individus les plus à risque (nouveau-nés et enfants immunodéprimés en particulier). Ciblée par différents programmes vaccinaux depuis de nombreuses années, cette pathologie sévit à nouveau dans de nombreux pays développés où le nombre de cas augmente fortement depuis la fin des années 2000. Cette résurgence montre la nécessité de développer de nouvelles stratégies afin de comprendre les mécanismes de l’infection par B. pertussis. Dans ce contexte, la recherche préclinique apparaît comme essentielle pour comprendre la physiopathologie de la coqueluche. De nombreux modèles animaux ont été décrits pour l’étude de la coqueluche mais aucun de ces modèles ne permet de reproduire l’ensemble du spectre des symptômes cliniques de la pathologie, notamment la toux. Cependant, au cours des dernières années un modèle d’infection par Bordetella pertussis chez le jeune babouin a été développé aux Etats-Unis et permet de reproduire la pathologie observée chez l’homme, notamment concernant la toux et la transmission. Ce modèle semble ainsi très prometteur pour l’étude de la physiopathologie de la coqueluche.Cependant, de nombreuses inconnues subsistent dans ce modèle, notamment concernant la colonisation bactérienne et les interactions entre la bactérie et l’hôte. Nous avons ainsi cherché dans cette étude à évaluer d’une part l’impact de différents facteurs comme l’âge des animaux, la dose d’infection ainsi que la voie d’exposition sur la pathologie déclarée par les babouins suite à l’infection par la souche B1917 de B. pertussis afin de pouvoir proposer un parallèle avec les données cliniques disponibles. Nous avons également développé l’utilisation de techniques d’imagerie in vivo comme l’endomicroscopie confocale couplée à la bronchoscopie afin d’étudier la localisation et la cinétique de colonisation et certaines interactions du pathogène dans le tractus respiratoire inférieur au cours de la pathologie. Cette étude nous a ainsi permis d’approfondir les connaissances de physiopathologie de la coqueluche dans ce modèle babouin et consolidera cet outil précieux pour l’évaluation des futures stratégies de prévention contre cette pathologie. / Whooping cough, or pertussis, is a respiratory disease caused by Bordetella pertussis bacterial colonization of human airways. Main symptoms are cough, leukocytosis, fever and may even be lethal for some patients (e.g. newborn infants and immuno-deficient patients). Despite a good vaccination coverage worldwide against pertussis, whooping cough cases have been re-increasing in several developed countries in the past twenty years. This resurgence points out the crucial need to develop new control strategies and to better understand pertussis pathophysiology, notably using appropriate animal models. Numerous preclinical models including mice, rats, rabbits and swine have been described for B. pertussis infection studies. However, none of these models reproduce the full spectrum of clinical pertussis symptoms, especially cough. The recent baboon model of whooping cough described in the last few years in the US appears to be a very relevant model for pertussis pathophysiology studies as these animals reproduced all clinical symptoms as observed in humans including cough.However, many aspects of bacterial colonization and interactions with the host have yet to be described in this model.We have then evaluated diverse parameters such as animal age, the inoculum dose and the exposition route on the pathology symptoms and immune responses developed by baboons following B. pertussis B1917 strain inoculation in order to draw a parallel with human clinical data. We also developed in this model in vivo imaging techniques like confocal endomicroscopy coupled with bronchoscopy in order to evaluate bacterial colonization kinetics, localization and some interactions in the lower respiratory tract of infected baboons. Then, this study brought additional data on whooping cough physiopathology in this baboon model, which will be crucial for evaluating future prevention strategies against pertussis disease

Introduction : La dystonie est définie comme un syndrome de cocontractions musculaires soutenues aboutissant à des mouvements répétitifs et des postures anormales. Cependant la physiopathologie des dystonies reste mal comprise. Les études menées chez l’homme soulignent le rôle crucial des ganglions de la base dans la physiopathologie des dystonies. Des données récentes obtenues chez le rongeur suggèrent l’implication d’un désordre de la transmission cholinergique striatale mais es modèles qu’ils soient génétiques ou pharmacologiques n’aboutissent pas toujours à un phénotype de dystonie. C’est pourquoi il était important de proposer une étude chez le primate non humain, visant à vérifier notre hypothèse de travail, à savoir : est-ce qu’une augmentation de la transmission cholinergique dans le putamen est capable d’induire un phénotype clinique de dystonie similaire à celui rencontré chez l’homme.Méthodes : Nous avons réalisé des infusions chroniques d’un agoniste muscarinique non sélectif (Oxotremorine) au sein du territoire sensori-moteur du striatum chez le primate non-humain. Les symptômes cliniques induits par ce produit ont été évalués à l’aide de l’échelle de Burke-Fahn-Marsden (BFM) adaptée à l’animal. Nous avons également utilisé une approche électromyographique pour caractériser l’activité musculaire en lien avec la clinique ainsi que des enregistrements de l’activité Multi-Unitaire et Unitaire au sein des ganglions de la base afin d’établir des corrélations électro-cliniques.Résultats : Les infusions d’Oxotremorine nous ont permis d’observer : (i) des postures et des mouvements anormaux similaires aux mouvements dystoniques rencontrés en pathologie humaine ; (ii) une fréquence de décharge neuronale anormalement basse dans le GPi (13,5Hz) et un pattern de décharge de type « bursty » principalement lorsque les symptômes sont sévères ; (iii) une activité oscillatoire (28-30Hz) au sein du putamen, du GPe et du GPi; (iv) l’absence de cohérence de l’activité oscillatoire entre ces structures ; (v) que le GPi est la seule structure à présenter une cohérence de l’activité oscillatoire.Conclusion : Nos travaux démontrent pour la première fois qu’un modèle de dystonie chronique peut être obtenu chez le primate non humain par augmentation du tonus cholinergique dans le putamen. Ce travail valide l’hypothèse de l’implication des interneurones cholinergiques dans la physiopathologie des dystonies. Ils confortent l’idée qu’une augmentation du tonus cholinergique peu à elle seule induire un phénotype de dystonie. / Introduction: Dystonia is defined as a syndrome of sustained muscular cocontractions leading to repetitive movements and abnormal postures. However, the pathophysiology of dystonia remains poorly understood. Studies in humans emphasize the crucial role of basal ganglia in the pathophysiology of dystonia. Recent data in rodents suggest the involvement of a disorder in the striatal cholinergic transmission. But these genetic or pharmacological rodent models do not always express the phenotype of dystonia. Therefore, it was important to propose a primate study to test whether an increase of cholinergic transmission within the putamen is able to induce a clinical phenotype of dystonia similar to that seen in humans.Methods: To verify our hypothesis, we chronically infused non-selective muscarinic agonist (Oxotremorine) in the sensory-motor striatum in non-human primates. Dystonic clinical symptoms induced by this drug were assessed using the Burke-Fahn-Marsden (BFM) scale adapted to animals. We used electromyographic approach to characterize muscular activity linked to clinical symptoms, and we recorded Multi-Unit and Single-Unit neuronal activity in basal ganglia to establish electro-clinical correlations.Results: The infusions of Oxotremorine allowed us to observe: (i) abnormal postures and movements similar to the dystonic movements encountered in human pathology; (ii) an abnormally low neuronal firing frequency in the GPi (13.5Hz) and a bursty firing pattern mainly when the symptoms where severe; (iii) oscillatory activity (28-30Hz) within the putamen, GPe and GPi; (iv) the lack of coherence of the oscillatory activity between these structures; (v) that the GPi is the only structure to present a coherence of the oscillatory activity.Conclusion: We have demonstrated for the first time that a model of chronic dystonia can be obtained in non-human primates by increasing cholinergic tone in the putamen. This work validates the hypothesis of an involvement of cholinergic interneurons and striatal acetylcholine levels in the pathophysiology of dystonia.

La maladie de Parkinson (MP) est la seconde maladie neurodégénérative la plus répandue. Les symptômes moteurs répondent initialement bien aux médicaments dopaminergiques. Toutefois, des complications motrices de ces médicaments finissent par survenir. Certains patients se voient alors proposer un traitement neurochirurgical par stimulation cérébrale profonde (SCP) et chronique du Noyau Subthalamique (NST). Plusieurs études suggèrent que la modulation du faisceau cortico-subthalamique moteur explique au moins en partie l’efficacité de la SCP du NST. Approfondir la compréhension du mécanisme d’action de la SCP du NST pour le traitement de la MP devrait permettre d’optimiser le rapport innocuité/efficacité de cette procédure qui s’adresse à des dizaines de milliers de patients dans le monde. L’objectif primaire de cette thèse est de caractériser le faisceau cortico-subthalamique moteur sur les plans anatomique et fonctionnel chez le primate non humain. Les objectifs secondaires sont : Permettre la visualisation directe et en conditions stéréotaxiques du NST chez le primate non humain et le patient parkinsonien - Mettre au point une méthodologie permettant de caractériser sur les plans anatomique et fonctionnel tout faisceau de fibres entre deux régions cérébrales anatomiquement distinctes, chez le primate non humain - Elaborer une loi de commande pour la stimulation du NST par optogénétique et en boucle fermée, afin de détruire sélectivement les oscillations béta et tester l’hypothèse de leur rôle dans l’émergence des symptômes moteurs de la MP... / Parkinson’s Disease (PD) is the second most widespread neurodegenerative disease. Motor symptoms initially respond well to dopaminergic medecines ; however, motor complications will eventually occur. Some patients are then proposed a neurosurgical treatment by chronical electrical deep brain stimulation (DBS) of the subthalamic nucleus (STN). Several studies suggested that the modulation of the motor cortico-subthalamic bundle might explain the efficacy of STN DBS, at least to a certain extent. A better understanding of the mechanism of action of DBS of the STN in order to treat PD should help to optimize the safety/efficacy of this surgical procedure from which tens of thousands of patients could benefit all over the world.The main purpose of the present thesis is to characterize, both anatomically and functionally, the motor cortico-subthalamic bundle in non-human primates. Secundary objectives are : (1) to allow the direct visualization, under stereotactic conditions, of the STN of non-human primates and of patients with PD ; (2) to develop a methodology enabling to characterize, both anatomically and functionally, any fiber bundle between two anatomically distinct cerebral areas, in non-human primates ; (3) to establish a command law for closed-loop stimulation of STN by optogenetics, in order to selectively destroy beta-oscillations and assess the hypothesis of their role in the occurrence of motor symptoms in PD...

Notre laboratoire a développé une stratégie d'isolement de fragments d'anticorps recombinants à partir de primates non humains (Macaca fascicularis) immunisés, en utilisant la technologie des phages. Dans le cadre de cette thèse, une comparaison des séquences d'anticorps de macaques (Macaca Mulatta) et d'anticorps humains a toutefois montré que les anticorps des deux espèces présentent des différences qui rendent souhaitable une étape d'humanisation des anticorps de macaques. Cette stratégie a été utilisée dans le cadre du projet Européen AntiBotABE (www.antibotabe.com) et l'étape de criblage a été adaptée pour isoler des scFv neutralisant de façon croisée les toxines botuliques BoNT/B des sous-types B1 et B2, en utilisant séquentiellement l'holotoxine BoNT/B1 et un fragment recombinant représentant la région C-terminale de la chaîne lourde de BoNT/B2. Le meilleur scFv ciblant les régions C-terminales des chaînes lourdes de BoNT/B1 et BoNT/B2, B2-7, a montré une bonne capacité de neutralisation de BoNT/B1 et BoNT/B2 dans le test ex vivo de paralysie hémidiaphragmatique. Les régions charpentes du scFv B2-7 ont un pourcentage d'identité élevé (80 %) avec leurs homologues humains. Des scFv neutralisant BoNT/A1 en ciblant sa chaîne légère ont aussi été isolés, dont le scFv le plus efficace, 2H8, induit une diminution de 50% de l'activité endopeptidasique à une concentration correspondant à un rapport molaire 2H8/BoNT/A1 de 64000. Les régions charpentes de 2H8 ont également un pourcentage d'identité élevée (88%) avec leurs homologues humains. La versatilité de cette stratégie en fait un outil permettant l'isolement de nombreux autres fragments d'anticorps à visée thérapeutique.

La vérification est un comportement volontaire mis en place à la suite d’un doute ou de la détection d’une erreur au cours d’une prise de décision. De très rares études se sont intéressées aux bases physiologiques de ce comportement, la majorité des travaux étant basés sur l’analyse des comportements pathologiques, comme les vérifications associées au trouble obsessionnel compulsif. Ces travaux de thèse ont consisté à déterminer les bases neurobiologiques du comportement de vérification chez le primate non-humain, un modèle de choix dans l’étude de la physiopathologie humaine. Pour cela deux singes macaque rhésus ont été entrainés à la tâche « Check-or-Go » permettant aux sujets de vérifier et éventuellement modifier la disponibilité d’une récompense avant de confirmer la décision afin d’accéder à cette même récompense. A l’aide d’une analyse comportementale, de dosages d’un biomarqueur de l’anxiété, d’enregistrements EEG du cortex préfrontal et d’enregistrements extracellulaires unitaires au niveau de CMAr et pré-SMA, nous avons pu montrer que : (i) les singes ont les capacités métacognitives d’exprimer un comportement volontaire de vérification similaire à celui observé chez l’Homme, (ii) ce comportement est sous tendu par l’émergence du doute, (iii) est corrélé au niveau d’anxiété, et (iv) est associé à des mécanismes cognitifs mettant en jeu le cortex préfrontal, et plus spécifiquement CMAr et pré-SMA. / Checking behavior is essential to maximizing gain and/or minimizing loss in our daily lives and relies on a normal action monitoring process. Although several studies have explored the neurobiological basis of doubt and uncertainty, both the physiology and physiopathology of checking, its most manifest behavioral consequence, remain poorly understood. This PhD project aims at characterizing physiological doubt and checking behavior in non-human primates. To do so, we trained two rhesus monkeys at a newly designed Check-or-Go task that allows the animal to multiple-check and change the availability of a reward before taking the final decision leading to that reward. During the task, we recorded frontal EEG activity and single neuronal activity in the rostral part of the ACC (CMAr), and the pre-supplementary motor area (pre-SMA), and quantified salivary cortisol in order to correlate this biological marker of anxiety with checking behavior. Our results show that, as humans, monkeys have the metacognitive ability to express voluntary checking behavior that depends on uncertainty monitoring, relates to anxiety and involves brain frontal areas.

Le cartilage a une capacité de régénération très limitée car il n'est pas vascularisé. Laréparation de ce tissu est un défi et les techniques chirurgicales actuelles sont insatisfaisantes à longterme. Le cartilage est donc un bon candidat pour l'ingénierie tissulaire. La transplantation dechondrocytes autologues (TCA) a été la première thérapie cellulaire développée en rhumatologie maiscette procédure implique une amplification des cellules qui aboutit à une perte du phénotypechondrocytaire (perte de l'expression du collagène de type II, protéine majoritaire du cartilage), auprofit d'un phénotype fibroblastique (caractérisé par l'expression du collagène de type I, retrouvé dansles tissus fibreux). La TCA conduit donc à une greffe de chondrocytes dédifférenciés produisant unfibrocartilage, dont les propriétés mécaniques sont inférieures à celles du cartilage articulaire.Aujourd'hui, les agences de santé au niveau international s'accordent pour dire que cette procédurenécessite d'être améliorée, par un meilleur contrôle du phénotype cellulaire et l'utilisation debiomatériaux pour mieux combler les lésions articulaires. Il s'agit donc de passer de la thérapiecellulaire à l'ingénierie tissulaire du cartilage.L'objectif de nos travaux a été d'évaluer la capacité d'un gel innovant de peptides autoassemblants,l'hydrogel IEIK13, à jouer le rôle de support pour des chondrocytes humains afin qu'ilsproduisent une matrice cartilage sous l'action de facteurs chondrogéniques. L'objectif visé a été lacréation d'un gel cartilage implantable par arthroscopie. Le défi a été de surmonter la dédifférenciationdes chondrocytes inhérente à leur amplification et incontournable pour augmenter le réservoircellulaire. L'amplification de chondrocytes humains a été réalisée en présence de FGF-2 et d'insuline(cocktail FI) puis leur redifférenciation a été induite en gel IEIK13 sous l'action de BMP-2, d'insuline etd'hormone T3 (cocktail BIT). C'est la combinaison sélective des deux cocktails qui permet la séquencedédifférenciation-redifférenciation. Le phénotype des chondrocytes et la nature de la matriceextracellulaire synthétisée en gel ont été évalués dans un premier temps in vitro, par des analyses dePCR en temps réel, Western-blots et d'immunohistochimie. Dans un second temps, nous avonstransplanté le gel cartilage dans des lésions articulaires de genou d'un modèle original de primate nonhumain(singe cynomolgus), un type de gros animal dont la posture et le fonctionnement desarticulations s'apparentent à l'homme. Nos études d'imagerie non invasive (telle qu'elle est pratiquéechez l'homme) et immunohistochimiques trois mois après implantation montrent une réparationsatisfaisante des lésions, en comparaison avec les lésions laissées non comblées. L'ensemble de nosrésultats montre pour la première fois que l'hydrogel IEIK13 est un biomatériau favorable pourreconstruire le cartilage et que le primate non-humain est un modèle préclinique unique pour évaluerl'efficacité de l'ingénierie tissulaire du cartilage / Cartilage is not vascularized and presents poor capacity of self-regeneration. Repairing thistissue is a challenge and current surgical techniques are not satisfactory in the long term. Cartilage isthus a good candidate for tissue engineering. Autologous chondrocyte transplantation (ACT) was thefirst cell therapy developed for cartilage repair. This procedure implies amplification of cells whichresults in chondrocyte dedifferentiation (loss of expression of type II collagen, the major protein ofcartilage and acquisition of expression of type I collagen, the major protein found in fibrous tissues).Thus, ACT results in implantation of fibroblastic cells producing fibrocartilage with biomechanicalproperties inferior to native articular cartilage. The international health agencies agree that ACT needsto be improved with better control of the chondrocyte phenotype and use of biomaterials. Therefore,cell therapy of cartilage needs to move towards tissue engineering of cartilage.The objective of our study was to evaluate the capacity of an innovative self-assemblingpeptide (IEIK13) to support cartilage matrix production by human chondrocytes. Our goal was to createa cartilage gel that can be implanted by arthroscopy. A main challenge was to meet the problem ofchondrocyte dedifferentiation induced by cell amplification necessary to increase the cellularreservoir. Amplification of human chondrocytes was performed in the presence of FGF-2 and insulin(cocktail FI), and redifferentiation was subsequently induced in IEIK13 gel with BMP-2, insulin, andtriiodothyronine T3 (cocktail BIT). The specific combination of these two cocktails alloweddedifferentiation-redifferentiation of chondrocytes. The status of the chondrocyte phenotype and thenature of the extracellular matrix secreted in gel were first assessed in vitro by real-time PCR, Westernblottingand immunhostochemistry analyses. With a view of clinical application, we then transplantedIEIK13-engineered cartilages into defects created in knees of an original model of non-human primate(cynomolgus monkey), a type of large animal whose anatomy and biomechanics mimic human. Ournon-invasive imaging analyses and our inmmunohistochemical studies performed three months afterimplantation show correct reparation of the lesions, in comparison with the defects left untreated.Altogether, our results demonstrate for the first time that IEIK13 is a suitable biomaterial for cartilagerepair and that cynomolgus monkey represents a unique preclinical model to evaluate efficiency ofcartilage tissue engineering.

La neurohormone ocytocine (OT) est de plus en plus étudiée pour son potentiel thérapeutique dans les troubles du comportement social, comme l'autisme, qui sont associés à une dérégulation de plusieurs systèmes de neurotransmission, notamment l'OT et la sérotonine (5-HT). Dans ce cadre, une étape importante afin de développer des médicaments basés sur des mécanismes biologiques est de caractériser les interactions entre l'OT et les autres neurotransmetteurs. La littérature sur les rongeurs montre que la relation entre OT et 5-HT est fortement impliquée dans plusieurs aspects du comportement social. Par ailleurs, nous avons récemment montré chez le sujet sain que le fonctionnement du récepteur 5-HT 1A (5-HT1AR) est modifié suite à l'administration d'OT.neuroJ'ai donc réalisé une première expérience chez des patients autistes en utilisant le scanner TEP avec le radiotraceur [18F]MPPF (spécifique du 5-HT1AR). Aucune différence n'est apparue, à l'état basal, entre 18 patients autistes et 24 sujets contrôles. Par ailleurs, l'OT n'a pas modifié le système 5-HT1AR. Enfin, alors qu'une corrélation entre la densité de 5-HT1AR et le volume de matière grise du striatum a été observé dans le groupe contrôle, cette relation était absente dans le groupe de patients. Ces résultats suggèrent une altération subtile du 5-HT1AR, ne pouvant être détectée qu'au niveau fonctionnel.Parce que le scanner TEP ne permet pas de dire si les changements observés sont dus à une libération de sérotonine ou à une modification directe du récepteur, j'ai réalisé une deuxième expérience chez 3 macaques rhésus, avec le [18F]MPPF et le [11C]DASB (marquant le transporteur de la 5-HT). Par rapport au placebo, l'OT injectée dans le ventricule latéral a significativement augmenté la liaison du [18F]MPPF dans l'amygdale et l'insula tandis que la liaison du [11C]DASB diminuait dans ces mêmes régions. Ainsi, nous pouvons dire que l'OT a provoqué la libération de 5-HT ainsi qu'une modification du 5-HT1AR dans ces régions importantes pour les comportements socio-émotionnels. Une étude par autoradiographie a confirmé cette interprétation.Ces expériences montrent qu'il existe une action régulatrice de l'OT sur la 5-HT chez le primate, mais que ce mécanisme est dérégulé chez les patients avec autisme. Cela ouvre donc la voie à l'investigation de traitements combinés exerçant un effet sur ces deux neurotransmetteurs / The neurohormone oxytocin (OT) is increasingly studied for its therapeutic potential in social disorders, like autism, which are associated with the deregulation of several neurotransmission systems, including OT and serotonin (5-HT). Hence investigating OT’s interactions with other neurotransmitters is a relevant step towards mechanism-based treatments. Studies in rodents demonstrated that the interaction between OT and 5-HT, is critical for several aspects of social behaviour. Moreover, using PET-scan in humans we have recently found that 5-HT 1A receptor (5-HT1AR) function is modified after intra-nasal oxytocin intake. Thus I performed a first experiment in which intra-nasal OT was administered to patients with autism undergoing a [18F]MPPF (a 5-HT1AR radiotracer) PET scanner, in order to study their basal serotonergic system and to look if the oxytocin modulates the 5-HT1AR system. I found no differences of baseline 5-HT1AR concentration between 18 autistic subjects and 24 controls. Critically, in patients, OT did not induce changes on the 5-HT1AR system. Moreover, in controls, there was a correlation between 5-HT1AR and grey matter volume in the striatum, that was not observed in patients. These results suggest a subtle disruption of patients’ serotonergic system, that can only be seen at the functional level. Because PET scan does not tell us if the observed modification is due to a change in 5-HT1AR or 5-HT concentration, I performed a second PET scan experiment on 3 macaque monkeys, using [18F]MPPF and [11C]DASB, that marks the serotonin transporter. Compared to placebo, OT injections in the lateral ventricle significantly reduced [11C]DASB binding potential in right amygdala, insula and hippocampus whereas [18F]MPPF binding potential increased in right amygdala and insula. Thus we reproduced results obtained in healthy humans and extended it by suggesting that OT provokes the release of 5-HT in key limbic regions involved in socio-emotional processing. These results were confirmed with autoradiography.Taken together, these experiments indicate that OT modulates 5-HT release in primates, but this mechanism is disrupted in patients with autism. This opens ways to investigate combined OT/5-HT treatments, especially since FDA approved drugs targeting the two systems are already available for use in patients with autism