Le foie, en tant qu'organe exerçant un rôle prédominant dans le métabolisme de plusieurs substances, tels le glucose, les médicaments et les xénobiotiques, constitue une cible de prédilection pour le stress oxydant. Les kératines (K), protéines de la famille des filaments intermédiaires (FI) retrouvées dans le tissu epithelial, englobent une vingtaine de protéines du cytosquelette regroupées en type I (K9-23) et type II (Kl-8). Leur expression implique différentes paires type I/type II, corrélant avec l'état de différenciation des cellules épithéliales. Chez les hépatocytes, principales cellules constituant le parenchyme hépatique, ainsi que chez les cellules d'hépatome, les K8/K18 sont les seuls FI retrouvés. La présente étude vise à définir le mécanisme permettant aux cellules de l'hépatome H4IIE-C3 dépourvues de K8/K18 (shK8b) de résister plus efficacement au stress oxydant produit par un surplus de H2O2 que les mêmes cellules possédant les K8/K18 (H4ev). Les résultats montrent que la résistance des shK8b au H2O2 ne provient pas d'une altération dans l'activation de voies signalétiques en réponse au stress oxydant. Par contre, le taux de glucose présent dans le milieu de culture affecte de manière différentielle la survie des H4ev versus shK8b au H2O2. De plus, une augmentation du niveau d'hexokinases en surface des mitochondries des shK8b corrèle avec la résistance de ces cellules au H2O2. Par ailleurs, une perturbation de cette association donne lieu à une augmentation de la sensibilité chez les shK8b se rapprochant du niveau observé chez les H4ev, tout en déclenchant une sortie du cytochrome c issu des mitochondries. Dans l'ensemble, les résultats obtenus suggèrent fortement que la résistance des shK8b au stress oxydant est principalement due à une altération dans l'utilisation du glucose, en lien avec l'association plus importante d'hexokinases aux mitochondries.

Kératines (K), protéines constitutives des filaments intermédiaires (FI) de l'épithélium, englobent une vingtaine de protéines du cytosquelette, exprimées différenti-ellement selon la différenciation et regroupées en deux catégories: type I (K9-20) et type II (Kl-8). Dans le foie, les FI des hépatocytes sont composés uniquement des K8 et Kl8, marqueurs typiques de l'épithélium simple. En raison de son métabolisme unique et de sa relation avec le tracrus gastro-intestinal, le foie constitue une cible majeure de la toxicité induite par les médicaments, les xénobiotiques et le stress oxydatif. La présente étude révèle que les hépatocytes de souris ainsi que les hépatomes H4IIE dépourvues de K8 (K8-null et shK8b respectivement) sont plus résistants que leurs homologues contenant la K8 (WT et H4ev respectivement), suite à un excès de H2O2. Les cellules meurent via les mitochondries en lien avec une activation et une localisation altérées de la PKCô dans les cellules shK8b. Même si le H2O2 modifie différentiellement les niveaux de glutathione (GSH) et des espèces reactives de l'oxygène (ROS) dans les cellules H4ev versus shK8b, la réponse de mort est largement indépendante du niveau de GSH. En outre, nos résultats montrent que la différence dans le niveau de GSH provient d'une altération dans le métabolisme du glucose dans les cellules shK8b. Une stimulation du récepteur de l'insuline à la surface cellulaire déclenche préférentiellement une signalisation dépendante du glucose associée à l'activation de la voie PI3K/AKT, qui à son tour régule différentes activités métaboliques. Comparativement aux cellules H4ev, la stimulation par l'insuline des cellules shK8b présente une cinétique de production du glycogène plus rapide et plus élevée, associée à une signalisation préférentiellement liée à la voie G6P/mTOR/S6K. Par contre dans les hépatocytes, la cinétique différentielle de la production du glycogène en absence de K8 est maintenue, mais a lieu préférentiellement via la voie PI3K/AKT. D'une manière commune, ces altérations dans les voies de signalisation métaboliques amenées par la perte des FI de K8/K18 semblent être liées à une perturbation dans le transport membranaire du glucose à la surface. Ensemble, ces résultats fournissent la première évidence directe de la régulation par les FI de K8/K18 du métabolisme du glucose dépendent de l'insuline et de la mort cellulaire induite par les ROS dans les cellules hépatiques.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / L'activité mécanique des cellules générée par l'interaction entre la matrice extracellulaire (MEC) et le cytosquelette d'actine est essentielle pour la régulation de l'adhésion, de l'étalement et de la migration des cellules lors du développement normal ou tumoral. La stimulation mécanique des cellules découle majoritairement des forces externes appliquées par la MEC ou bien des forces internes générées par la contraction de l'actomyosine. Ces stimuli mécaniques convergent aux intégrines situées aux points focaux d'adhérence (FA) reliant la MEC à l'actine fibrillaire. La formation des FA requiert des molécules adaptatrices pour l'actine, telle que la vinculine, ainsi que des molécules de signalisation, comme la FAK (« focal adhesion kinase ») ou les PKC (« protein kinase C »). Les filaments intermédiaires (FI) de kératines 8/18 (K8/K18) sont exprimés dans l'ensemble de l'épithélium simple, mais constituent les seuls FI présents dans les hépatocytes et les hépatomes. Bien que plusieurs évidences suggèrent une participation des FI K8/K18 dans la régulation de l'activité mécanique des cellules, le mécanisme exact demeure énigmatique. Les travaux présentés dans cette thèse examinent les mécanismes impliqués dans la modulation de l'activité mécanique des cellules par les FI K8/K18. Par une approche s'appuyant sur l'utilisation d'une pince optique et de substrats de rigidité variable, les résultats montrent que les FI K8/K18 contribuent à la rigidité cellulaire et aux mécanismes mécanosenseurs, en raison d'une modulation de la signalisation RhoA-ROCK responsable de la dynamique de l'actine fibrillaire, plutôt que de leurs propriétés viscoélastiques. Par ailleurs, la PKCô est identifiée comme un médiateur de la modulation de l'étalement et de la migration associée aux FI K8/K18 chez les hépatomes, via une boucle de rétroaction positive affectant la FAK et l'intégrine aux FA. En fait, ces éléments corrèlent avec l'assemblage d'un complexe formé de RACK1 « Receptor of Activated C Kinase 1», pi-intégrine, plectine, PKC et c-Src. À noter que les mécanismes dépendant de RhoA et PKC sont mutuellement impliqués dans la modulation de la migration et de la rigidité des cellules associées aux FI K8/K18. Dans leur ensemble, les résultats démontrent une implication incontestable des FI K8/K18 dans la modulation de l'homéostasie mécanique des cellules de l'épithélium simple.

Il est bien accepté dans des modèles en culture que les dynamiques mitochondriales et le remodelage des crêtes régulent le fonctionnement mitochondrial sous diverses conditions de stress, particulièrement l’apoptose et la famine. Malgré la quantité impressionnante de recherche effectuée dans ce domaine, on en connait encore très peu au sujet de l’importance des dynamiques mitochondriales et du remodelage de la structure mitochondriale sous des conditions physiologiques. Dans les années 1960, Hackenbrock a démontré que des mitochondries isolées adoptent des conformations internes distinctes selon l’état métabolique. D’après ses observations, il a prédit que les changements ultrastructurels de la mitochondrie régulent la production fonctionnelle de l’organite. Cependant, il n’est pas évident que ces changements ultrastructuraux suivent bien les changements métaboliques in vivo dans des conditions physiologiques. De plus, le métabolisme hépatique nécessite une adaptation constante de la production bioénergétique et biosynthétique de la mitochondrie suite aux changements de l’état anabolique/catabolique de la cellule hépatique. Toutefois, le fonctionnement de ce processus est encore largement inconnu. Dans cette étude, nous apportons les premières descriptions quantitatives in vivo de la réponse adaptative du réticulum mitochondrial aux transitions métaboliques du foie. Grâce à un modèle hépatique de souris postprandiale et une analyse cryo- microscopie électronique (cryo-EM) quantitative, nous montrons que, 5 heures après un repas, la voie mTORC1 est bloquée, le réseau mitochondrial se fragmente, la densité des crêtes diminue et la capacité respiratoire des mitochondries chute. Ces changements sont accompagnés d’une augmentation parallèle de la longueur des contacts mitochondrie-réticulum endoplasmique (MERCs), qui contrôle les échanges de calcium et de phospholipides entre les deux organites. De plus, ces évènements sont associés à l’expression transitoire de deux fragments C-terminaux (CTFs) inconnus jusqu’à présent provenant de la protéine Optic atrophy-1 (OPA1), une GTPase qui régule les dynamiques des crêtes mitochondriales et des mitochondries. Grâce à un protocole in vitro, nous montrons que ces CTFs proviennent d’un nouveau clivage d’OPA1, appellé clivage-C, qui élimine l’activité d’OPA1 en la coupant. Plus important encore, nous montrons que le clivage-C nécessite la présence de Mitofusin-2 (MFN2), une protéine clé dans la régulation de la fusion mitochondriale et dans la génèse des MERCs, mais pas la présence de l’homologue Mitofusin-1 (MFN1), ce qui confirme le lien entre le remodelage des crêtes et l’assemblage des MERCs. / It is well established in cultured models that mitochondrial dynamics and cristae remodeling regulate mitochondrial function under different stress conditions, such as starvation and apoptosis. Despite the tremendous amount of research in this field, relatively little is known about the significance of mitochondrial dynamics and ultrastructure remodeling under normal physiological conditions in vivo. In the 1960’s, Hackenbrock demonstrated that isolated mitochondria adopt distinct internal conformations under different metabolic states. Based on these observations, he predicted that mitochondrial ultrastructural changes regulate the organelles functional output. However, whether these ultrastructural changes also accompany metabolic transitions in vivo, under physiological conditions, is not known. Further, hepatic metabolism requires mitochondria to adapt their bioenergetic and biosynthetic output to the ever-changing anabolic/catabolic state of the liver cell, but the wiring of this process is still largely elusive. In this study, we provide the first in vivo quantitative description of the adaptive response of the mitochondrial reticulum to hepatic metabolic transitions. Using a postprandial mouse liver model and quantitative cryo-EM analysis we show that at 5 hours after feeding the mTORC1 signaling is blocked, the mitochondria network fragments, the cristae density decreases and the mitochondrial respiratory capacity drops. These changes are accompanied with a parallel increase in the mitochondria-ER contact (MERCs) lengths, which control calcium and phospholipids fluxes between the two organelles. Further, these events are associated with the transient expression of two previously unidentified C-terminal fragments (CTFs) of Optic atrophy-1 (OPA1), a mitochondrial GTPase that regulates cristae and mitochondrial dynamics. Using an in vitro assay, we show that these CTFs originate from a novel OPA1 processing, termed C-cleavage that eliminates OPA1 activity by breaking off the GTPase. Importantly, we show that C-cleavage requires the presence of Mitofusin-2 (MFN2), a key regulator of mitochondria fusion and MERCs biogenesis, but not that of its homolog Mitofusin-1 (MFN1), thereby linking cristae remodeling to MERCs assembly.

La cholestase intrahépatique représente environ 40% des lésions hépatiques induites par les médicaments et se caractérise par une accumulation intracellulaire des acides biliaires (AB). Les mécanismes impliqués sont encore mal connus et sa prédiction reste difficile. Le but de ce travail était de caractériser dans la cholestase d’origine médicamenteuse et de développer des méthodes de screening pour sa prédiction précoce, en utilisant la lignée humaine hépatique HepaRG et les hépatocytes humains. Tout d’abord, nous avons démontré que la motilité des canalicules biliaires (CB) est indispensable à la clairance des AB et requiert une alternance de phosphorylation/déphosphorylation de la chaine légère de la myosine (MLC), contrôlé par la voie Rho-kinase/Myosin Light Chain Kinase (ROCK/MLCK). Nous avons ensuite montré pour la première fois que les médicaments cholestatiques altèrent la voie ROCK/MLCK/MLC et la dynamique des CB. En utilisant la famille des antibiotiques résistant à la pénicillinase, dont fait partie la flucloxacilline, responsable de nombreux cas de cholestase, nous avons observé que la dérégulation de ROCK pouvait se faire par activation de HSP27, associée aux voies de signalisation PKC/P38 et PI3K/AKT. Enfin, nous avons montré une capacité variable des médicaments cholestatiques à moduler les profils des AB. En effet, les médicaments cholestatiques majeurs induisent une accumulation préférentielle des AB hydrophobes toxiques, in vitro, dans les premières 24h, qui résulte d’une inhibition de leur amidation. Au total, l’ensemble du travail a permis de progresser dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la cholestase d’origine médicamenteuse et de mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs utiles pour sa prédiction. / Intrahepatic cholestasis represents around 40% of drug-induced liver injuries and is characterized by intracellular accumulation of bile acids (BA); mechanisms involved and its accurate prediction remains challenging. The aim of the current work was to characterize the mechanisms involved in drug-induced cholestasis and to develop screening methods for its early prediction, using human differentiated HepaRG and primary human hepatocytes. First, we demonstrated that bile canaliculi (BC) motility is essential for BA clearance and requires alternating phosphorylation/dephosphorylation of myosin light chain (MLC) that is controlled by the Rho-kinase/Myosin Light Chain Kinase (ROCK/MLCK) signaling pathway. Then, we showed, for the first time that cholestatic drugs could alter the ROCK/MLCK/MLC pathway and BC dynamics. Using the penicillinase-resistant antibiotics family, including flucloxacillin that is responsible for many cases of cholestasis, we found that deregulation of ROCK could be modulated by HSP27, associated with PKC/P38 and PI3K/AKT signaling pathways. Finally, we evidenced variable potency of cholestatic drugs to modulate BA profiles. Indeed, the well-known cholestatic drugs induced a preferential accumulation of unconjugated toxic hydrophobic BA in vitro within the first 24h that resulted from inhibition of their amidation. Altogether, these data bring new information on the understanding of the mechanisms involved in drug-induced cholestasis and highlight new morphological and molecular predictive biomarkers of drug-induced cholestasis.

Les polyesters aliphatiques, comme le poly(acide malique) et ses dérivés, sont une famille de polymères aux propriétés de bio(comptabilité) et de bio(dégradabilité) remarquables, qui en font des candidats de choix pour l'élaboration de systèmes de vectorisation de principes actifs. Généralement, ces polymères sont synthétisés via des réactions de polymérisation utilisant des amorceurs, voir des catalyseurs, organiques, organométalliques ou métalliques. La présence de ces molécules, même à l'état de traces, peut être à l'origine d'une toxicité non souhaitée. Par conséquent, l'utilisation de biocatalyseurs, comme les lipases, se développe pour apporter une solution à cet inconvénient. Cependant, cette voie de synthèse enzymatique fait face à d'autres problèmes, tels qu'une polymérisation moins bien maîtrisée et des polymères de masses molaires faibles. Cette thèse a donc pour objectif de mettre au point une voie de polymérisation du malolactonate de benzyle utilisant la lipase de pancréas de porc (PPL) comme amorceur. Dans un premier temps, nous avons optimisé certains paramètres réactionnels permettant d'obtenir des poly(malate de benzyle) , PMLABe, de masses molaires suffisamment élevées pour que ces polymères puissent être utilisés dans la formulation de vecteurs de principes actifs, grâce à l'utilisation et l'extrapolation d'un plan d'expérience. Nous nous sommes ensuite intéressés à la compréhension du mécanisme réactionnel de la polymérisation enzymatique du malolactonate de benzyle, une β-lactone β-substituée. Les différentes études menées ont permis d'approfondir notre connaissance dans ce domaine. Deux mécanismes ont été proposés et des expériences sont en cours pour confirmer l'un d'entre eux. Finalement, comme l'objectif initial est de proposer une méthode de synthèse de dérivés du PMLA plus biocompatibles conduisant à des polymères sans résidus d'amorceurs chimiques toxiques, nous avons comparé les activités biologiques de nanoparticules préparées à partir de PMLABe synthétisés par voie chimique et par voie enzymatique. Pour cela, nous avons mesuré la captation de ces nanoparticules, encapsulant une sonde de fluorescence, par des cellules hépatiques HepaRG. Puis, nous avons évalué la toxicité aiguë et la toxicité chronique de ces nanoparticules vis-à-vis des cellules HepaRG. Ces études ont permis de mettre en évidence certaines propriétés des nanoparticules ayant une influence sur la survie cellulaire et le métabolisme des cellules HepaRG. De la compréhension théorique aux applications potentielles, cette thèse apporte des connaissances sur la polymérisation enzymatique des lactones substituées, un domaine peu décrit dans la littérature. / Aliphatic polyesters, like poly(malic acid)and its derivatives, are a family of polymers with outstanding properties, such as bio(degradability) and bio(compatibility). Therefore, these polyesters can be considered as excellent candidates for the design of drug carriers. These kinds of polymers are usually synthesized thanks to polymerization reactions using organic, organometallic or metallic initiators or catalysts. The presence of such molecules, even in trace amounts, can cause undesired toxicities. Therefore, the use of biocatalysts, like lipases, is attracting more and more interest and research work to circumvent this problem. However, this enzymatic polymerization method has to face to other issues, such as a lower controlled of the polymerization process and polymers with lower molar masses. Therefore, this PhD research work aimed at setting up the enzymatic polymerization of benzyl malolactonate, using porcine pancreatic lipase (PPL). Firstly, we have optimized some reactional parameters allowing to obtain poly(benzyl malate), PMLABe, with molar masses adapted to their uses for the design of drug carriers, thanks to a Design of Experiments (DoE) and its extrapolation. We were then interested by the comprehension of the enzymatic polymerization mechanism of the benzyl malolactonate. The different studies we carried out allowed us to deepen our knowledges of such enzymatic polymerization. Two non-canonical mechanisms were proposed and further experiments are in progress to confirm the one which is the more probable. Finally, because our initial goal was to propose a more biocompatible polymerization method to obtain PMLABe free of traces of chemical initiator, we compared biologic activities of different nanoparticles prepared from PMLABe synthesized using chemical or enzymatic pathway. For that, we have first measured the uptake of these nanoparticles encapsulating a fluorescent dye, by the hepatic cells HepaRG. Then, we have studied the acute and chronic toxicity of the nanoparticles on the HepaRG cells. Results of these studies have highlighted that certain properties of the nanoparticles and/or of the polymers which constituted them have an influence on the cells viability and on the cells metabolism. From the theoretical mechanism to the probable applications, this thesis brings knowledge about the enzymatic polymerization of substituted lactone, a field poorly described in the literature.