Pour produire des ferments lactiques contenant des bifidobactéries par des cellules immobilisées, des fermentations ont été réalisées avec une culture pure de bifidobactéries ou en culture mixte avec une souche de lactocoques. Une méthode a été développée pour localiser et quantifier par immunofluorescence les deux souches dans des billes de gel. L'utilisation de cette méthode a permis d'observer une croissance bactérienne préférentielle à la périphérie des billes. La production continue de culture mixte a été étudiée avec un système composé d'un premier réacteur (R1) contenant les deux souches immobilisées séparément dans des billes de gel et d'un second réacteur (R2) opéré avec les cellules libres relarguées de R1. Une culture mixte concentrée de composition stable a été produite à 35ʻC dans l'effluent de R2. La redistribution des souches dans les billes fut observée en microscopie confocale. La résistance à différents stress des cellules libres produites dans l'effluent des deux réacteurs a augmenté avec le temps de fermentation.

Les sols agricoles sont depuis de nombreuses années contaminés directement par apports d'intrants (pesticides, fertilisants) mais également de façon indirecte en raison de la proximité de certaines installations industrielles. Notre étude porte sur des sols agricoles à l'aval de la vallée de la Thur (Haut-Rhin), polycontaminés par du chrome (488 mg/kg), du mercure (13 mg/kg) et du plomb (381 mg/kg). La phytoextraction est une méthode innovante, employée pour ses propriétés respectueuses de la vie biologique du sol et son faible coût. La faible disponibilité des métaux dans le sol (notamment Cr, Hg et Pb), et par conséquent le temps de décontamination, constitue la principale limite de cette technique. La bioaugmentation couplée à la phytoremédiation (rhizoremédiation) est une technique récente qui a été testée pour cette étude de façon à accroître la vitesse de phytoextraction. Les résultats ont montré que les microorganismes producteurs de sidérophores, notamment les Pseudomonas, étaient potentiellement intéressants pour augmenter la mobilité du chrome et du plomb dans le sol. La production de sidérophores par des cellules libres ou immobilisées de Pseudomonas cultivées en présence de divers substrats carbonés a été optimisée. L'immobilisation des microorganismes dans des billes d'alginate de calcium enrichies en lait écrémé a montré que les microorganismes étudiés produisaient plus de sidérophores en présence de métaux et que leur survie dans le sol était accrue. Les billes de Ca-alginate adsorbent plus de 90% de Cr, Fe et Pb ainsi que plus de 40% de Hg, ce qui diminue la toxicité métallique pour les cellules libres ou immobilisées, et crée également un déficit en Fe dans les billes, stimulant ainsi la production de sidérophores par les microorganismes. Les microorganismes sélectionnés ont ensuite été inoculés dans le sol contaminé, cultivé avec du maïs comme plante modèle. La bioaugmentation des pots de sol avec Pseudomonas aeruginosa co-immobilisé dans des billes de Ca-alginate avec du lait écrémé a permis de multiplier le prélèvement de Cr par les feuilles de maïs par 5,4 et celui du Pb par 3,8 par rapport aux pots non bioaugmentés. L'inoculation du sol enrichi en lait écrémé avec des cellules libres de R. metallidurans a permis d'augmenter le rélèvement foliaire de Cr par 5,2.

Le principal objectif de ce projet était d'étudier un système d'inoculation et préfermentation en continu du lait par une culture mixte avec cellules immobilisées et contenant une souche forte productrice de nisine Z, Lc. diacetylactis UL719, et deux souches sensibles à la bactériocine, un Lb. rhamnosus, producteur d’exopolysaccharides, et un Lc. cremoris, sélectionné pour ses capacités d’acidification. Des fermentations du lait inoculé de façon traditionnelle par la culture mixte en cellules libres ont également été réalisées. Durant ces fermentations en batch, la croissance de Lc. diacetylactis est stimulée par la présence des deux autres souches, entraînant une augmentation de la production de nisine. Le système d'inoculation et préfermentation en continu du lait avec cellules immobilisées, conduit sur une période de trois semaines, a permis d'inoculer massivement le lait par Lc. diacetylactis et Lb. rhamnosus. Le lait fermenté obtenu après une étape d'incubation additionnelle contenait également une population élevée de ces deux souches conduisant à une production élevée de nisine et une augmentation de la concentration d'exopolysaccharides comparativement à des fermentations en batch du lait par la culture mixte en cellules libres et inoculé de façon traditionnelle. La méthode de PCR en temps réel développée durant ce projet a permis de quantifier les faibles niveaux de populations de Lc. cremoris dans les laits fermentés et préfermentés. Une augmentation avec le temps de préfermentation de la tolérance à la nisine des cellules de Lb. rhamnosus ainsi que de la capacité acidifiante pour les deux souches majoritairement retrouvées dans le lait préfermenté fut également observée. / The objective of this work was to study an immobilized-cell system for continuous inoculation and prefermentation of milk by a mixed culture containing a nisin Z producer (Lc. diacetylactis UL719) and two nisin-sensitive strains for acidification (Lc. cremoris) and exopolysaccharide production (Lb. rhamnosus RW-9595M). Batch fermentations of milk traditionally inoculated with free-cell mixed culture of the three strains were also performed at different temperatures. In these conditions, we showed that growth of Lc. diacetylactis was stimulated by commensalism, leading to an increase of nisin Z production. Continuous prefermentation of milk with immobilized cells carried out over 3 weeks leads to high inoculation of milk with Lc. diacetylactis and Lb. rhamnosus . In fermented milk, obtained after an additional batch incubation, populations of these two strains remained at high concentrations leading to high nisin production and higher exopolysaccharide concentration compared to traditional batch fermentation of milk. The real-time PCR method, developed in this project, was successfully used to quantify very low cell concentrations of Lc. cremoris in prefermented and fermented milks. Immobilization and continuous culture also lead to important cell physiological adaptations for Lb. rhamnosus and Lc. diacetylactis. Lb. rhamnosus became much more tolerant to nisin Z, and both strains exhibited a large increase in milk acidification capacity.

Le microbiote intestinal est un écosystème complexe jouant un rôle très important dans la santé humaine. L’établissement du microbiote intestinal s’effectue dans la première année de vie. Afin de stimuler chez les enfants nourris avec des préparations infantiles les bifidobactéries et lactobacilles, les laits infantiles pourraient être supplémentés avec des probiotiques ou des prébiotiques. Cette supplémentation pourrait leur apporter une protection renforcée contre les troubles intestinaux, les infections et les risques allergiques. Les études in vivo chez les enfants étant difficiles à réaliser à cause de problèmes d’accessibilité et d’éthique, des outils permettant de faire des études in vitro ont été développés. Les systèmes de fermentation continu sont ceux qui se rapprochent le plus des conditions in vivo. Différents modèles ont été proposés, tous utilisent des bactéries fécales libres alors que la microflore bactérienne est présente à l’état planctonique et sessile dans le côlon. Peu de modèles in vitro ont été proposés pour simuler l’écosystème colique chez l’enfant. Le but de cette étude était donc de développer un nouveau modèle de fermentation colique avec cellules immobilisées pour simuler l’écosystème intestinal chez l’enfant. Nous avons montré qu’une microflore fécale pouvait être immobilisée et que sa diversité bactérienne était conservée au cours de la fermentation en continu. La composition et l’activité métabolique de la microflore bactérienne s’équilibraient en fonction des conditions de fermentation à des niveaux voisins de ceux observés in vivo chez l’enfant. Ensuite un modèle de fermentation en continu à trois réacteurs pour simuler le côlon proximal, distal et transverse chez l’enfant a été développé et validé. Ce nouveau modèle a ensuite permis de comparer les effets d’un prébiotique connu (fructooligosaccharide) et d’un exopolysaccharide produit par L. rhamnosus RW-9595M sur l’écosystème intestinal chez l’enfant. Le fructooligosaccharide testé influençait favorablement l’écosystème intestinal alors que l’exopolysaccharide n’était pas métabolisé par le microbiote intestinal chez les enfants. Ce nouveau modèle avec cellules immobilisées possède l’avantage d’obtenir une grande stabilité à la fois de la composition bactérienne et de l’activité métabolique de la microflore, faisant de ce nouveau modèle de fermentation colique un outil de travail pratique, fiable et facile à opérer. / The intestinal microbiota is a complex ecosystem playing a key role in human health. The intestinal microbiota establishment occurred during the first year of life. To stimulate bifidobacteria and lactobacilli in formula fed infants, infant formula could be supplemented with probiotics or prebiotics, food ingredient able to improve human health. This supplementation could provide to them a better protection against gastro-intestinal disorders, infections and allergic risks. In vivo studies are difficult to carry out in infants due to accessibility and ethic problems, then in vitro studies become important. Continuous fermentation systems display the closest conditions to those encountered in vivo. Different fermentation systems have been proposed, all are using free-cell cultures whereas in vivo bacteria are present in colon at planktonic and sessile states. To our knowledge only one in vitro model has been proposed to simulate infant colonic fermentation. The aim of this study was to develop a new in vitro system with immobilized cells to simulate infant colonic ecosystem. First a feasibility study was done, we showed that a complex fecal microflora could be immobilized and the inoculum bacterial diversity was conserved in the ecosystem established in the fermentation system. The bacterial composition and metabolic activities of the microbiota reached an equilibrium specific to the fermentation conditions tested. These equilibriums were closed to those detected in vivo in infant colon. Then a three-stage chemostat using immobilized fecal bacteria was developed and validate to simulate simultaneously, proximal, transverse and distal infant colon conditions. This last in vitro colonic fermentation model was used to compared the effect of a well-known prebiotic (fructooligosaccharide) with an exopolysaccharide produced by L. rhamnosus RW-9595M on the infant colonic microbiota. The fructooligosaccharide used beneficially influenced the bacterial ecosystem whereas exopolysaccharide substrate did not seem to be metabolized by infant colonic microbiota. The main advantage of this system with immobilized cells is the great stability of the bacterial composition and metabolic activities of the microflora established in the model. For this, the in vitro colonic fermentation system with immobilized cells is a very efficient tool, easy to operate and reliable.