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Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-11-28T13:09:20Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Madson S. Nascimento.pdf: 4077795 bytes, checksum: 135529b568a9d27139f560fa3b93646b (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-11-28T13:09:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Madson S. Nascimento.pdf: 4077795 bytes, checksum: 135529b568a9d27139f560fa3b93646b (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-11-28T13:09:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Madson S. Nascimento.pdf: 4077795 bytes, checksum: 135529b568a9d27139f560fa3b93646b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-28T13:09:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Madson S. Nascimento.pdf: 4077795 bytes, checksum: 135529b568a9d27139f560fa3b93646b (MD5) Previous issue date: 2014-04-18 / Não informada / Tuberculosis is an ancient infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis. With 9.2 million cases worldwide each year by 2008, According to WHO and the gradual loss of effectiveness of existing drugs through the resistance of microorganisms, deserves special attention from our country's authorities and encourages research in discovering new drugs that may be successful in treating this disease. For this, a widely used approach is to search for the pathogens metabolism inhibitors. The shikimic acid pathway is a biosynthetic pathway critical to maintaining the bacteria, and thus the enzymes belonging to the shikimate pathway are a prime target in the design of new antibacterial agents. The enzyme chorismate synthase catalyzes the seventh and final step of this route, converting the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) in chorismate, this is an important precursor in other metabolic pathways, such as aromatic amino acids, folate, ubiquinone, vitamin K and other products. Understanding the chorismate synthesis reaction is controversial because there is no unanimity regarding the mechanism or the role of amino acids involved. The elucidation of it will bring a significant scientific advance, helping to understand the complexity involved in this biochemical step, and also contribute to the development of new enzyme inhibitors. The study of the synthesis reaction in question was developed employing the use of quantum chemistry computational in DFT level using the functional B3LYP and 6-31 + G (d, p) basis set. From the orbital Homo-Lumo orbitals and optimization of transition state between reactant and reaction product (QST2), it was possible to clarify some important points about the reaction . It was possible to propose a reaction mechanism in the light of this theoretical chemical study . / A tuberculose é uma doença infecciosa muito antiga causada pelo Mycobacterium tubrculosis. Com 9,2 milhões de casos no mundo a cada ano até 2008, segundo a OMS e a gradual perda de eficácia dos fármacos existentes frente à resistência dos microorganismos, merece especial atenção das autoridades de nosso país e motiva pesquisas na descoberta de novos fármacos que venham a ser bem-sucedidos no tratamento dessa enfermidade. Para isso, uma abordagem muito usada é a busca de inibidores do metabolismo dos agentes patogênicos. A via do ácido chiquímico é uma rota biossintética fundamental para a manutenção da bactéria e, assim, as enzimas pertencentes à via do chiquimato constituem um excelente alvo no desenho de novos agentes antibacterianos. A enzima corismato sintase catalisa a sétima e última etapa dessa rota, convertendo o 5- enolpiruvilchiquimato-3-fostato(EPSP) em corismato, este é um importante precursor em outras rotas metabólicas, como as de aminoácidos aromáticos, folato, ubiquinona, vitamina K e outros produtos. A compreensão da reação de síntese do corismato é controversa, pois não há unanimidade com relação ao mecanismo nem quanto ao papel dos aminoácidos envolvidos. A elucidação da mesma trará um significativo avanço científico, ajudando a entender toda a complexidade envolvida nessa etapa bioquímica, e também contribuirá para o desenvolvimento de novos inibidores da enzima. O estudo da reação de síntese em questão foi desenvolvido empregando o uso da química quântica computacional em nível DFT utilizando o funcional B3LYP e a base 6-31+G(d,p). A partir dos orbitais Homo-Lumo e da otimização do estado de transição entre reagente e produto da reação (QST2), foi possível esclarecer alguns pontos importantes sobre a reação. Foi possível propor um mecanismo de reação à luz deste estudo químico teórico.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-04-24T13:45:43Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Andrea Leite Camargo Santana - 2017.pdf: 3114758 bytes, checksum: 4fa4c3e9a2e7062f2940b053f1250619 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-04-24T13:46:06Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Andrea Leite Camargo Santana - 2017.pdf: 3114758 bytes, checksum: 4fa4c3e9a2e7062f2940b053f1250619 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-24T13:46:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Andrea Leite Camargo Santana - 2017.pdf: 3114758 bytes, checksum: 4fa4c3e9a2e7062f2940b053f1250619 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-03-29 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Paracoccidioides fungi are the causative agents of paracoccidioidomycosis, an endemic disease in Latin America with great socioeconomic importance. Inhalation of spores, the infectious particles of the fungus, is a common way to get the infection. Its treatment is slow and generates long-term side effects making it necessary to study new metabolic pathways that can be potential targets for antifungal development. In this context, stands out the chiquimate pathway in Paracoccidioides spp., related to the production of chorismate and production of aromatic amino acids, and the chorismate synthase involved in the last stage of this pathway. The chorismate synthase from Pb18 was cloned into pGEX-4T3 vector, expressed in pLysS cells and purified on a glutathione-sepharose column. Antibodies were produced from the immunization of mice with the recombinant protein obtained and used in Western blot assay to confirm protein expression. For characterization of the enzyme, its modeling was carried out. Pull-down-GST assay was performed to identify interactions between the chorismate synthase and soluble proteins present in total protein extract of Pb18. The interactions found included proteins of different functional categories related to protein synthesis, related with metabolism of common intermediates such as folate and quinolinate or related with the availability of ATP, phosphoenolpyruvate and erythrose-4-phosphate required in the chiquimate pathway. Unexpected interactions with proteins of the cell cycle and also with regulating proteins of the cell division process were observed. / Fungos do gênero Paracoccidioides são os agentes causadores da paracoccidioidomicose, uma doença endêmica na América Latina de grande importância socioeconômica. A inalação de esporos, partículas infecciosas do fungo, é uma forma comum de adquirir a infecção. O seu tratamento é lento e gera efeitos colaterais tornando necessário o estudo de novas vias metabólicas que sejam potenciais alvos para o desenvolvimento de antifúngicos. Nesse contexto, destaca-se a via do chiquimato em Paracoccidioides spp., relacionada à obtenção de corismato e produção de aminoácidos aromáticos, sendo corismato sintase a enzima envolvida na última etapa dessa via. A corismato sintase proveniente de Pb18 foi clonada em vetor pGEX-4T3, expressa em células pLysS e purificada em coluna de glutationa-sefarose. Anticorpos foram produzidos a partir da imunização de camundongos com a proteína recombinante obtida e utilizados em ensaio de Western blot a fim de confirmar a expressão proteica. A modelagem da corismato sintase foi realizada e os aminoácidos envolvidos no sítio ativo foram identificados. Ensaios de pull-down-GST foram realizados a fim de identificar os complexos de interações entre a corismato sintase e proteínas solúveis presentes em extrato proteico total de Pb18. As interações encontradas incluíram proteínas de diferentes categorias funcionais relacionadas à síntese proteica, ao metabolismo de intermediários comuns como folato e quinolinato ou ainda com a disponibilidade de ATP, fosfoenolpiruvato e eritrose-4-fosfato necessários na via do chiquimato. Interações inesperadas com proteínas do ciclo celular e também com proteínas reguladoras do processo de divisão celular foram observadas.