En el llevat de fissió Schizosaccharomyces pombe Cdc25 és inhibida per fosforilació en resposta a una aturada en la replicació o a dany al DNA per les cinases Cds1 i Chk1. En el nostre grup hem vist que la cinasa activada per estrés Srk1 també està involucrada en la regulació de l'entrada en mitosi a través de la fosfatasa Cdc25.Estudis de co-precipitació i de fosforilació van demostrar la interacció entre Srk1 i Cdc25, així com la fosforilació de Cdc25 per Srk1 in vitro i per Srk1 immunoprecipitada a partir d'extractes cel·lulars. D'altra banda, la fosforilació per Srk1 estabilitza Cdc25 de forma depenent de la proteïna 14-3-3, i la manté retinguda al citoplasma.La fosforilació per Srk1 té lloc en la regió N-terminal de Cdc25, en els mateixos residus fosforilats per les cinases Chk1 i Cds1, i la fosforilació en aquests llocs és necessària per tal que proteïna Srk1 provoqui un bloqueig en la fase G2 del cicle cel·lular. Nosaltres demostrem que Srk1 no regula Cdc25 en resposta a estrès genotòxic, sinó en resposta a estrès ambiental no-genotoxic durant la fase G2. L'estrés osmòtic i oxidatiu provoquen un augment en la taxa transcripcional de Srk1 i una activació de la proteïna depenent de la MAPK Sty1. Sty1 fosforila Srk1 en la treonina 463, augmentant 5 vegades la seva activitat. Srk1 és necessària per mantenir els nivells de Cdc25 durant la resposta a estrès i per tal d'induir la seva estabilització a través de la unió a la proteïna 14-3-3. Tots aquests resultats suggereixen un model en el que Srk1 bloqueja en primer lloc el cicle cel·lular en resposta a estrès ambiental, de forma paral·lela a l'activació transcripcional de gens necessaris per protegir la cèl·lula, i en segon lloc, Srk1 estabilitza Cdc25 per tal que la cèl·lula pugui iniciar la divisió un cop s'ha adaptat a l'estrès.

L'aplicació de mètodes de cribatge virtual adquireix cada vegada més importància en el procés de descobriment de fàrmacs, complementant a les tècniques de High-throughput screening per tal de facilitar i contribuir a la comprensió dels mecanismes bioquímics d'actuació dels fàrmacs, donar agilitat i reduir el cost del procés.Pel que fa a la present tesi, l'interès farmacològic és la inhibició de receptors de tirosina cinases. Aquests enzims participen en múltiples processos de senyalització cel·lular, fet que fa que tant la disfunció de les mateixes o el seu paper privilegiat en els mecanismes del cicle cel·lular les converteixin en diana farmacològica de malalties com el càncer i altres relacionades amb desordres hiperproliferatius, migratoris, del desenvolupament embrionari i malalties vasculars. Una de las estratègies d'inhibició més usuals és el bloqueig del lloc d'unió de l'ATP a través de molècules orgàniques com les piridopirimidines, heterocicles especialment interessants per al grup d'investigació en el qual es desenvolupa aquest treball per la seva àmplia experiència sintètica en aquests sistemes.En la present tesi s'exploren i validen gran part de les tècniques de cribatge virtual amb l'objectiu d'establir una seqüència jerarquitzada de filtres que permetin avaluar aquells compostos candidats a ser sintetitzats. Els successius passos de filtrat inclouen la selecció de compostos d'una quimioteca virtual a partir de la diversitat o representativitat de l'espai químic, l'aplicació de recerques de similitud i models farmacofòrics construïts a partir d'inhibidors coneguts, un filtrat mitjançant docking o acoblament dels inhibidors a la cavitat d'unió d'aquestes proteïnes i mètodes de predicció de l'afinitat d'unió d'una sèrie de lligands. La jerarquia d'aquestes etapes s'imposa a partir de la diferència de recursos computacionals que requereix cadascuna d'elles, sent aquests cada vegada superiors. Els mètodes han estat validats retrospectivament en bases de dades formades per compostos actius recopilades de la bibliografia. Una vegada validades, han permès la caracterització prospectiva dels candidats sintètics.S'ha dissenyat un fingerprint d'interacció estructural proteïna-lligand basat en el concepte de parells atòmics (IFbAP) destinat a facilitar el postprocessat dels resultats de docking, aplicant-se com a filtre en un cribatge virtual. La seva capacitat per a discriminar entre compostos actius e inactius s'analitza per a tres dianes: el receptor d'estrogen, el receptor del factor de creixement de fibroblasts i la transcriptasa reversa del HIV.Paral·lelament, s'ha seguit amb el desenvolupament del programa PRALINS (Program for Rational Analysis of Libraries in Silico), programa dirigit al disseny de quimioteques combinatòries virtuals que incorpora els principals criteris de selecció basats en diversitat. En el context de les quimioteques combinatòries focalitzades, es proposa un nou mètode (Direct), la capacitat de focalització del qual s'ha testat front als mètodes tradicionals, també implementats a PRALINS. Així mateix s'incorporen i analitzen mètodes d'avaluació de diversitat, suggerint-se un mètode (cell-integral-diversity criterion) destinat a superar els desavantatges dels mètodes tradicionals. S'incorporen els algoritmes genètics a PRALINS com a tècnica d'optimització, tant d'un únic criteri de diversitat/similitud com per a realitzar optimitzacions multiobjetiu.En l'àmbit d'una altra línia d'investigació del grup dirigida cap al desenvolupament d'inhibidors del procés de fusió del HIV, s'estudia el mode d'unió de dos antagonistes de CXCR4 i CCR5, receptors cel·lulars de la família de les GPCRs implicats en aquesta etapa del cicle del virus. / La aplicación de métodos de cribado virtual cobra cada vez más importancia en el proceso de descubrimiento de fármacos, complementando a las técnicas de High-throughput screening con el fin de facilitar y contribuir a la comprensión de los mecanismos bioquímicos de actuación de los fármacos, agilizar y reducir el coste del proceso.En particular, el interés farmacológico de la presente tesis es la inhibición de receptores de tirosina quinasas. Estos enzimas participan en múltiples procesos de señalización celular, por lo que tanto la disfunción de las mismas o su papel privilegiado en los mecanismos del ciclo celular las convierten en diana farmacológica de enfermedades como el cáncer y otras relacionadas con desórdenes hiperproliferativos, migratorios, del desarrollo embrionario y enfermedades vasculares. Una de las estrategias de inhibición más usuales es el bloqueo del sitio de unión del ATP a través de moléculas orgánicas como las piridopirimidinas, heterociclos especialmente interesantes para el grupo de investigación en el que se desarrolla este trabajo por su amplia experiencia sintética en dichos sistemas.En la presente tesis se exploran y validan gran parte de las técnicas de cribado virtual con el objetivo de establecer una secuencia jerarquizada de filtros que permitan evaluar aquellos compuestos candidatos a ser sintetizados. Los sucesivos pasos de filtrado incluyen la selección de compuestos de una quimioteca virtual a partir de la diversidad o representatividad del espacio químico, la aplicación de búsquedas de similitud y modelos farmacofóricos construidos a partir de inhibidores conocidos, un filtrado mediante docking o acoplamiento de los inhibidores en la cavidad de unión de estas proteínas y métodos de predicción de la afinidad de unión de una serie de ligandos. La jerarquía de estas etapas se impone a partir de la diferencia de recursos computacionales que requiere cada una de ellas, siendo éstos cada vez superiores. Los métodos han sido validados retrospectivamente en bases de datos formadas por compuestos activos recopilados de la bibliografía. Una vez validadas, han permitido la caracterización prospectiva de los candidatos sintéticos.Se ha diseñado un fingerprint de interacción estructural proteína-ligando basado en el concepto de pares atómicos (IFbAP) destinado a facilitar el postprocesado de los resultados de docking, aplicándose como filtro en un cribado virtual. Su capacidad para discriminar entre compuestos activos e inactivos se analiza para tres dianas: el receptor de estrógeno, el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos y la transcriptasa reversa del HIV.Paralelamente, se ha continuado con el desarrollo del programa PRALINS (Program for Rational Analysis of Libraries in Silico), programa dirigido al diseño de quimiotecas combinatorias virtuales que incorpora los principales criterios de selección basados en diversidad. En el contexto de las quimiotecas combinatorias focalizadas, se propone un nuevo método (Direct), cuya capacidad de focalización se ha testado frente a los métodos tradicionales, también implementados en PRALINS. Asimismo se incorporan y analizan métodos de evaluación de diversidad, sugiriéndose un método (cell-integral-diversity criterion) destinado a superar las desventajas de los métodos tradicionales. Se incorporan los algoritmos genéticos en PRALINS como técnica de optimización, tanto de un único criterio de diversidad/similitud como para realizar optimizaciones multiobjetivo.En el ámbito de otra línea de investigación del grupo dirigida hacia el desarrollo de inhibidores del proceso de fusión del HIV, se estudia el modo de unión de dos antagonistas de CXCR4 y CCR5, receptores celulares de la familia de las GPCRs implicados en dicha etapa del ciclo del virus. / Virtual screening is progressively gaining importance in the drug discovery process, complementing high-throughput screening in order to facilitate and contribute to the understanding of the action mechanism of drugs, while expediting and reducing the cost of the process.The pharmacological focus of this thesis lies in the inhibition of tyrosine kinase receptors. These enzymes are the critical components of signalling pathways, so both their dysfunction and their privileged role in the cell cycle pathways make them pharmacological targets in diseases such as cancer and others related to hyperproliferative disorders, migratory disorders, embryonic development and vascular pathologies. One of the most common strategies of inhibition is the blockage of the ATP binding site by small organic molecules such as pyridopyrimidines, which are of particular interest for the research group where this project was carried out due to our wide experience in the synthesis of these heterocycles.In the present thesis, most of the techniques currently employed in virtual screening are explored and validated with the aim of establishing a hierarchical database of screening to be used in the evaluation of drug candidates to be synthesized. The successive filtering steps include compound selection from a combinatorial library based on diversity or representativity of the chemical space, pharmacophore similarity searches, docking and affinity predictions for a series of ligands. The different strategies have been retrospectively validated in databases containing active compounds compiled from literature. After validation, they have been applied in the prospective characterization of the synthetic candidates.A structural interaction fingerprint has been designed, based on the concept of atomic pairs (IFbAP), for the post processing of docking outputs as a filter step in virtual screening. Its ability to discern between active and inactive compounds has been analysed for three targets: estrogen receptor, fibroblast growth factor receptor and HIV reverse transcriptase.We have also continued developing the PRALINS program (Program for Rational Analysis of Libraries in Silico), a program for the design of combinatorial libraries, which incorporates the main diversity selection criteria. In the context of focused combinatorial libraries, we propose a new method (Direct), whose ability to focalise has been compared to the traditional methodologies also implemented in PRALINS. Moreover, different diversity evaluation criteria have been compared, introducing a new method (cell-integral-diversity criterion) aimed at surpassing the disadvantages of traditional techniques. We have implemented genetic algorithms as optimisation techniques, both for unique diversity/similarity criterion and for carrying out multiobjective optimisations.Within another research area of interest for the group, directed towards the development of inhibitors of the HIV fusion process, we study the binding mode for CXCR4 and CCR5 antagonists.

En el llevat Saccharomyces cerevisiae els canvis en les condicions osmòtiques del medi extracel.lular són sensades per la MAP cinasa Hog1, la qual permet dur a terme l'adaptació cel.lular mitjançant la modulació de l'expressió gènica, de la traducció i de la progressió del cicle cel.lular. A l'inici d'aquest projecte de tesi, els mecanismes pels quals Hog1 controla l'expressió gènica no eren del tot coneguts. El nostre objectiu va ser caracteritzar el mecanisme molecular pel qual Hog1 modula la transcripció en resposta a estrès osmòtic. Hem aconseguit demostrar que el reclutament de Hog1 als promotors sensibles a estrès osmòtic per part del factor de transcripció és essencial per al reclutament i activació de la RNA polimerasa II, mecanisme que podria estar conservat en les cèl.lules eucariotes. També hem identificat noves activitats remodeladores de cromatina implicades en la resposta gènica a osmoestrès mediada per Hog1. Vàrem realitzar un cribatge genètic per identificar mutacions que provoquessin osmosensibilitat i una reducció en l'expressió de gens de resposta a estrès osmòtic. Aquest cribatge ens va permetre identificar nous reguladors de la transcripció mediada per osmoestrès: la histona deacetilasa Rpd3 i els complexes SAGA i mediador. Els nostres resultats permeten, doncs, definir un important paper per a Rpd3, SAGA i mediador en la inducció gènica mediada per Hog1, i han estat importants per assolir una millor visió de com les cinases activades per estrès regulen la iniciació de la transcripció. / In Saccharomyces cerevisiae, changes in the extracellular osmotic conditions are sensed by the HOG MAPK pathway, which elicits the program for cell adaptation, including modulation of gene expression, translation and cell-cycle progression. At the beginning of this PhD Project, the mechanisms by which Hog1 was controlling gene transcription were not completely understood. Our main objective was to characterize the molecular mechanisms by which the Hog1 MAPK modulates transcription upon osmostress. We have shown that anchoring of Hog1 to osmoresponsive promoters by the transcription factor is essential for recruitment and activation of RNA polymerase II, a mechanism that might be conserved among eukaryotic cells. In addition, we identified novel chromatin modifying and remodelling activities involved in the Hog1-mediated osmostress gene expression. We performed a genome-wide genetic screening searching for mutations that render cells osmosensitive and displayed reduced expression of osmoresponsive genes. Rpd3 histone deacetylase, SAGA and Mediator complexes were identified as novel regulators of osmostress-mediated transcription. Thus, our results define a major role for Rpd3, SAGA and Mediator in the Hog1-mediated osmostress gene induction, and have been important to achieve a better view of how a SAPK regulates transcription initiation.

Nitric oxide (NO) is a neurotransmitter involved in memory processes. Currently, the only recognized physiological signalling pathway controlled by NO is the activation of guanylyl cyclase. In this thesis, we propose an alternative NO-signalling pathway that involves the Heme-regulated eukaryotic initiation factor-2a kinase (HRI) and eIF2a phosphorylation. We have found that the enzyme BACE1, a key protein in Alzheimer’s disease (AD), is controlled by this novel pathway. This pathway would be involved in the physiology of memory formation and learning processes. We have also studied how an external stress factor, the Herpes Simplex Virus 1, can disrupt this cascade leading to a pathological increase in BACE1 and amyloid ß-peptide (Aß) production. Aß aggregates forming fibrils that generate free radicals. These react with NO producing peroxynitrite, which contribute to AD progression. Since NO turns toxic when produced in a pro-oxidant environment we have also studied the effect of peroxynitrite in Stroke. / L’òxid nítric (NO) és un neurotransmissor involucrat en processos de memòria. Actualment, l’única cascada de senyalització fisiològica controlada per NO consisteix en l’activació de la guanilat ciclasa. En aquesta tesi, en proposem una d’alternativa que inclou la fosforilació de eIF2a per la Heme-regulated eukaryotic initiation factor-2a kinase (HRI). Hem mostrat com l’enzim BACE1, una proteïna clau en la malaltia d’Alzheimer (AD), és controlat per aquesta nova cascada de senyalització, que podria estar involucrada en la fisiologia de l’aprenentatge i la memòria. També hem estudiat com un factor d’estrès extern, l’ Herpes Simplex Virus 1, pot pertorbar aquesta cascada donant lloc a increments patològics en BACE1 i pèptid ß-amiloide (Aß). L’Aß agrega formant fibril·les que generen radicals lliures. Aquests reaccionen químicament amb NO produint peroxinitrit, que contribueix a la progressió de l’AD. Pel fet que l’NO esdevé tòxic quan és produït en un entorn pro-oxidant, hem estudiat també l’impacte que el peroxinitrit té en l’ictus.