The wine yeast Saccharomyces cerevisiae experiences a range of stress conditions during wine fermentation. These stresses include osmotic stress, hypoxia, nutrient starvation, cold stress and increasing ethanol stress as fermentable sugars are converted to ethanol. These various stresses affect the functionality of the plasma membrane, cell wall and subsequently the yeast’s efficiency during fermentation. Etp1, a poorly characterized protein has been shown to have several different fermentation related phenotypes; it is needed for the turnover of the hexose transporter Hxt3 upon a shift from glucose to ethanol, and the transcriptional activation of the stress response genes HSP12 and HSP26 under ethanol stress. The molecular function of Etp1 during fermentation is not understood. This research aims to understand the molecular mechanism of Etp1 function and its involvement in Chardonnay fermentation using the S. cerevisiae M2 wine yeast strain. / OMAFRA, Genome Canada

L'intégrité de paroi cellulaire est cruciale pour la survie du champignon pendant son cycle de développement ou en réaction à des conditions de stress. Chez la levure, les voies de signalisation de MAP kinase, Slt2, et calcineurin, régulent la réparation de paroi cellulaire. MPS1, l'orthologue de SLT2, chez Magnaporthe grisea est essentiel pour la réparation de la paroi cellulaire et pour la pénétration de l'appressorium (Xu, et al., 1998). Chez la levure, Slt2 active les facteurs de transcription Rlm1, Swi4 et Swi6, alors que le calcineurin active Crz1. Par ailleurs, PaIdc1 a un rôle dans la localisation nucléaire de PaMpk1 (orthologue de Slt2 et Mps1). (Corinne Jamet-Vierny, et al., 2007). MgIDC1, Le gène orthologue de PaIDC1 a été, de même, identifié chez M. grisea. ScAGS1 (α-glucan synthase), est un composant principal de la paroi principal des champignons. CaCAS5, est un régulateur transcriptionel, régule plusieurs gènes de la paroi cellulaire et ScKnr4 est impliqué dans la régulation de l'activité de 1,3--glucan synthase et la formation de la paroi cellulaire Ces gènes ont été identifiés chez M. grisea et des mutants de délétion ont été construits par le remplacement de gène chez M. grisea. Les mutants Guy11ΔKU80Δmps1 et Guy11ΔKU80Δidc1 montrent une forte réduction de mycélium aérien. Guy11ΔKU80Δmps1, Guy11ΔKU80Δrlm1 et Guy11ΔKU80Δswi4 ont une très forte réduction de sporulation. Guy11ΔKU80Δmps1, Guy11ΔKU80Δrlm1 et Guy11ΔKU80Δcrz1 ont une forte réduction de pouvoir pathogène. De plus, les mutants Guy11ΔKU80Δmps1 et Guy11ΔKU80Δswi4 sont inhibé, de 100% en présence d'un mélange de l'Aculéacine et Nikkomycine à faible dose (DI20). Les résultats montrent que chez M. grisea, il existe deux voies impliquées dans l'intégrité de la paroi cellulaire. La voie MAPK MPS1, qui régule les facteurs de transcription Rlm1, Swi4, Swi6 et la voie de Calcineurine, qui régule Crz1. D'après les analyses, SWI4 est impliquée dans la régulation des gènes de glucan synthases et chitine synthase, quand RLM1 n'est impliqué que dans la régulation des gènes de chitine synthase. Dans la voie de Calcineurine, CRZ1 contrôle les gènes de chitine synthase aussi. Ces études suggèrent que les facteurs de transcription qui sont régulés par Mps1 et Calcineurine sont spécialisés dans la régulation des gènes de cible spécifiques à l'intégrité et la réparation de la paroi cellulaire. / The cell wall integrity is crucial for the survival of fungi during its development or in reaction in stress conditions. In yeast, the MAP kinase pathway Slt2, and the calcineurin pathway are responsible of the cell wall repair. MPS1, the orthologous of SLT2, in Magnaporthe grisea is essential for the repair of the cell wall and the penetration of the appressorium (Xu, and Al, 1998). In yeast, Slt2 activates the transcription factors Rlm1, Swi4 and Swi6, whereas the calcineurin activates Crz1. In addition, PaIdc1 has a role in the nuclear localization of PaMpk1 (orthologous of Slt2 and Mps1). (Corinne Jamet-Vierny, and Al, 2007), in Podospora anserina. MgIDC1, the gene orthologous of PaIDC1 , likewise, was identified in M. grisea. ScAGS1 (α- glucan synthase), is the principal component of the wall of fungi. CaCAS5, is a transcriptional regulator, controls several genes of the cell wall and ScKnr4 is implied in the regulation of the activity of 1,3-- glucan synthase and the formation of the cell wall These genes was identified at M. grisea and deletion mutants were obtained by the gene replacement in M. grisea. Mutants Guy11ΔKU80Δmps1 and Guy11ΔKU80Δidc1 show a strong reduction of mycelium. Guy11ΔKU80Δmps1, Guy11ΔKU80Δrlm1 and Guy11ΔKU80Δswi4 have a very strong reduction of sporulation. Guy11ΔKU80Δmps1, Guy11ΔKU80Δrlm1 and Guy11ΔKU80Δcrz1 have a strong reduction of pathogenicity. Moreover, mutants Guy11ΔKU80Δmps1 and Guy11ΔKU80Δswi4 are 100% inhibited, in presence of a mixture of Aculéacine and Nikkomycine with low dose (DI20). The results show that in M. grisea, there are two pathways implied in the cell wall integrity. The MAPK pathway Mps1, which controls the tr anscription factors Rlm1, Swi4, Swi6 and the calcineurin pathway, which controls the transcription factor, Crz1. According to this study, SWI4 is implied in the regulation of glucan synthases and chitin synthase genes, when RLM1 is implied only in the regulation of chitin synthase genes. In the calcineurin pathway, CRZ1 controls chitin synthase genes. These studies suggest that the factors of transcription which are controlled by Mps1 and Calcineurin are specialized in the regulation of target genes, specific to the cell wall integrity and cell wall repair.

L'intégrité de paroi cellulaire est cruciale pour la survie du champignon pendant son cycle de développement ou en réaction à des conditions de stress. Chez la levure, les voies de signalisation de MAP kinase, Slt2, et calcineurin, régulent la réparation de paroi cellulaire. MPS1, l'orthologue de SLT2, chez Magnaporthe grisea est essentiel pour la réparation de la paroi cellulaire et pour la pénétration de l'appressorium (Xu, et al., 1998). Chez la levure, Slt2 active les facteurs de transcription Rlm1, Swi4 et Swi6, alors que le calcineurin active Crz1. Par ailleurs, PaIdc1 a un rôle dans la localisation nucléaire de PaMpk1 (orthologue de Slt2 et Mps1). (Corinne Jamet-Vierny, et al., 2007). MgIDC1, Le gène orthologue de PaIDC1 a été, de même, identifié chez M. grisea. ScAGS1 (α-glucan synthase), est un composant principal de la paroi principal des champignons. CaCAS5, est un régulateur transcriptionel, régule plusieurs gènes de la paroi cellulaire et ScKnr4 est impliqué dans la régulation de l'activité de 1,3--glucan synthase et la formation de la paroi cellulaire Ces gènes ont été identifiés chez M. grisea et des mutants de délétion ont été construits par le remplacement de gène chez M. grisea. Les mutants Guy11ΔKU80Δmps1 et Guy11ΔKU80Δidc1 montrent une forte réduction de mycélium aérien. Guy11ΔKU80Δmps1, Guy11ΔKU80Δrlm1 et Guy11ΔKU80Δswi4 ont une très forte réduction de sporulation. Guy11ΔKU80Δmps1, Guy11ΔKU80Δrlm1 et Guy11ΔKU80Δcrz1 ont une forte réduction de pouvoir pathogène. De plus, les mutants Guy11ΔKU80Δmps1 et Guy11ΔKU80Δswi4 sont inhibé, de 100% en présence d'un mélange de l'Aculéacine et Nikkomycine à faible dose (DI20). Les résultats montrent que chez M. grisea, il existe deux voies impliquées dans l'intégrité de la paroi cellulaire. La voie MAPK MPS1, qui régule les facteurs de transcription Rlm1, Swi4, Swi6 et la voie de Calcineurine, qui régule Crz1. D'après les analyses, SWI4 est impliquée dans la régulation des gènes de glucan synthases et chitine synthase, quand RLM1 n'est impliqué que dans la régulation des gènes de chitine synthase. Dans la voie de Calcineurine, CRZ1 contrôle les gènes de chitine synthase aussi. Ces études suggèrent que les facteurs de transcription qui sont régulés par Mps1 et Calcineurine sont spécialisés dans la régulation des gènes de cible spécifiques à l'intégrité et la réparation de la paroi cellulaire.

In the present work we study the metabolic adaptation in response to stress in the yeast model, and more specifically we investigate the regulation of peroxisomal activity and the metabolism of sphingolipids. Peroxisomes are dynamic organelles and the sole location for fatty acid ß-oxidation in yeast cells. Here we find that peroxisomal function is crucial for the adaptation to salt stress, especially upon sugar limitation. Multiple layers of control regulate both peroxisomal activity and number upon stress. Activated Hog1 MAP kinase triggers the induction of genes encoding enzymes for fatty acid activation, peroxisomal import and ß-oxidation through the Adr1 transcriptional activator, which transiently associates with genes encoding fatty acid metabolic enzymes in a stress- and Hog1-dependent manner. Moreover, Na+ and Li+ stress induces an increase in peroxisomal number per cell in a Hog1-independent manner, which depends instead of the retrograde pathway and the dynamin related GTPases Dnm1 and Vps1. The strong activation of the Faa1 fatty acyl-CoA synthetase, which specifically localizes to lipid particles and peroxisomes, indicates that adaptation to salt stress requires the enhanced mobilization of fatty acids from internal lipid stores. Taken together, these results suggest that stress-induced peroxisomal ß-oxidation triggers enhanced respiration upon salt shock. Sphingolipids are regulators of mitochondria-mediated cell death in higher eukaryotes. However, how changes in sphingolipid metabolism and downstream intermediates impinge on mitochondrial function is unknown. Here we found in yeast that within the sphingolipid degradation pathway, the production via Dpl1 and degradation via Hfd1 of hexadecenal is critical for mitochondrial function and cell death. Genetic interventions, which favor hexadecenal accumulation, diminish oxygen consumption rates and increase ROS production and mitochondrial fragmentation and viceversa. The location of the hexadecenal degrading enzyme Hfd1 in punctuate structures all along the mitochondrial network depends on a functional ERMES complex, indicating that modulation of hexadecenal levels at specific ER-mitochondria contact sites might be an important trigger of cell death. This is further supported by the finding that externally added hexadecenal or the absence of Hfd1 enhance cell death caused by human Bax protein. Finally, the induction of the sphingolipid degradation pathway upon stress is controlled by the Hog1 MAP kinase. Therefore the stressregulated modulation of sphingolipid degradation might be a conserved way to induce cell death in eukaryotic organisms. / En el presente trabajo se estudia la adaptación metabólica en respuesta a estrés en el modelo de levadura, y de forma más concreta se investiga la regulación de la actividad peroxisomal y el metabolismo de esfingolípidos. Los peroxisomas son orgánulos dinámicos, encargados de forma específica de la ß-oxidación de ácidos grasos en células de levadura. Aquí se muestra cómo la función peroxisomal es crucial para la adaptación al estrés salino, especialmente en condiciones de ayuno de glucosa. Se regula a múltiples niveles tanto la actividad peroxisomal como su número ante condiciones de estrés. La activación de la MAP quinasa Hog1 desencadena la inducción de genes que codifican enzimas para la activación, importación peroxisomal y ß-oxidación de los ácidos grasos. Esta regulación génica ocurre a través del activador transcripcional Adr1, que se asocia transitoriamente con los genes que codifican enzimas metabólicas de ácidos grasos de una manera dependiente del estrés y de Hog1. Además, el estrés causado por Na+ y Li+, provoca un aumento en el número de peroxisomas por célula de manera independiente de Hog1, que depende a su vez de la ruta retrógrada y de las dinaminas GTPasas Dnm1 y Vps1. La fuerte activación de la acil-CoA sintetasa Faa1, que se localiza específicamente en las partículas lipídicas y los peroxisomas, indica que la adaptación a estrés salino requiere una mayor movilización de ácidos grasos de los almacenes de lípidos internos. Estos resultados indican que la ß-oxidación peroxisomal inducida por estrés desencadena un aumento de la respiración ante el choque salino. Los esfingolípidos son reguladores de la muerte celular mediada por la mitocondria en eucariotas superiores. Sin embargo, se desconoce cómo, cambios en el metabolismo de los esfingolípidos y en intermediarios aguas abajo, afectan a las funciones mitocondriales. En este trabajo se describe cómo en la ruta de degradación de esfingolípidos de levadura, la producción de hexadecenal a través de Dpl1 y su degradación a través de Hfd1, es crítica para la función mitocondrial y la muerte celular. Intervenciones genéticas que favorecen la acumulación de hexadecenal, disminuyen el consumo de oxígeno de las células e incrementan la producción de ROS y la fragmentación mitocondrial, y a la inversa. La localización de Hfd1, que es la enzima que degrada el hexadecenal, es puntual en lugares cercanos a la red mitocondrial. Y esta localización depende de un complejo ERMES funcional, lo que indica que la modulación de los niveles de hexadecenal en lugares específicos de contacto entre el retículo endoplasmático y la mitocondria, podría ser un importante desencadenante de la muerte celular. Estos datos son apoyados por el hecho de que el hexadecenal añadido de forma externa o la ausencia de Hfd1, promueve la muerte celular inducida por la proteína Bax humana. Finalmente, la inducción de la ruta de degradación de esfingolípidos en condiciones de estrés, está controlada por la MAP quinasa Hog1. Por lo tanto, la modulación de la degradación de esfingolípidos regulada por estrés, podría ser una vía conservada para inducir la muerte celular en organismos eucariotas. / Al present treball s'estudia l'adaptació metabòlica en resposta a estrés al model de llevat, i de forma més concreta s'investiga la regulació de l'activitat peroxisomal i el metabolisme d'esfingolípids. Els peroxisomes són orgànuls dinàmics, encarregats de forma específica de la ß-oxidació dels àcids grassos en cèl·lules de llevat. Ací es mostra com la funció peroxisomal es crucial per a l'adaptació a l'estrés salí, especialment en condicions de dejuni de glucosa. Es regula a múltiples nivells tant l'activitat peroxisomal com el seu número, davant de condicions d'estrés. L'activació de la MAP quinasa Hog1 desencadena la inducció de gens que codifiquen enzims per a l'activació, importació peroxisomal i ß-oxidació dels àcids grassos. Aquesta regulació génica té lloc mitjançant l'activador transcripcional Adr1, que s'assòcia transitoriamente amb els gens que codifiquen enzims metabòliques d'àcids grassos d'una manera dependent de l'estrés i de Hog1. A més, l'estrés causat per Na+ i Li+, provoca un augment en el número de peroxisomes per cèl·lula de manera independent de Hog1, que depén a la vegada de la ruta retrògrada i de les dinamines GTPases Dnm1 i Vps1. La forta activació de la acil-CoA sintetasa Faa1, que es localitza específicament a les partícules lipídiques i als peroxisomes, indica que l'adaptació a estrés salí necesita d'una major movilització d'àcids grassos dels magatzems de lípids interns. Estos resultats indiquen que la ß-oxidació peroxisomal induïda per estrés desencadena un augment de la respiració davant el xoc salí. Els esfingolípids són reguladors de la mort cel·lular mitjada per la mitocóndria en eucariotes superiors. No obstant, es desconeix cóm, canvis al metabolisme dels esfingolípids i en intermediaris aigües baix, afecten a les funcions mitocondrials. En aquest treball es descriu cóm en la ruta de degradació de esfingolípids de llevat, la producció d'hexadecenal mitjançant Dpl1 i la seua degradació mitjançant Hfd1, és crítica per a la funció mitocondrial i la mort cel·lular. Intervencions genètiques que afavorixen l'acumulació d'hexadecenal, disminuixen el consum d'oxigen de les cèl·lules i incrementen la producció de ROS i la fragmentació mitocondrial, i a la inversa. La localització de Hfd1, que es l'enzim que degrada l'hexadecenal, és puntual en llocs propers a la red mitocondrial. I esta localització depén d'un complex ERMES funcional, el que indica que la modulació dels nivells d'hexadecenal en llocs específics de contacte entre el reticle endoplasmàtic i la mitocòndria, podria ser un important desencadenant de la mort cel·lular. Estes dades son recolzades pel fet de que l'hexadecenal afegit de forma externa o l'absència de Hfd1, promou la mort celul¿lar induïda per la proteïna Bax humana. Finalment, la inducció de la ruta de degradació d'esfingolípids en condicions d'estrés, está controlada por la MAP quinasa Hog1. Por tant, la modulació de la degradació d'esfingolípids regulada per estrés, podria ser una via conservada per a induïr la mort cel·lular en organismes eucariotes. / Manzanares Estreder, S. (2017). Estudio de la adaptación metabólica en respuesta a estrés: Regulación de la actividad peroxisomal y del metabolismo de esfingolípidos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/79083 / TESIS

En la levadura S. cerevisiae, un incremento de la osmolaridad extracelular activa la vía de Hog1, lo que produce una compleja respuesta adaptativa. Entre las respuestas adaptativas que Hog1 coordina, está un importante cambio en el partón de expresión génica. La tesis presentada se centra en la respuesta a nivel de regulación génica, y en ella se ponen de manifiesto nuevos mecanismos por los cuales Hog1 regula la transcripción para inducir genes necesarios para la adaptación celular en respuesta a estrés osmótico. Este trabajo demuestra que Hog1 controla la iniciación y la elongación de la transcripción, interacciona con la RNA polimerasa elongando, y es reclutado en toda la región codificante de los genes que se inducen por estrés osmótico a traves del 3'UTR. Asimismo, Hog1 recluta el complejo remodelador de cromatina RSC para promover un dramático cambio en el posicionamiento de nucleosomas, permitiendo una correcta inducción de la expresión génica. / In the yeast S.cerevisiae, an increase in extra cellular osmolarity activates the Hog1 Pathway, which produces a very complex adaptive response. Among these adaptive responses coordinated by Hog1, there is an important change in the gene expression pattern. The presented Thesis focuses on the response triggered at the genomic level, showing novel mechanisms by which Hog1 regulates transcription to efficiently and properly induce a subset of genes critical for the cellular adaptation to osmotic stress. This work demonstrates that Hog1 promotes and regulates transcription not only at the initiation level, as was previously described, but it also interacts with the RNA Polymerase while elongating, and travels along the coding regions of genes induced upon osmotic stress through recognition of the 3'UTR. Furthermore, Hog1 recruits a chromatin-remodeling complex known as RSC to promote a dramatic change in nucleosome positioning of target genes, allowing a proper induction of the transcription

The ability of yeasts to grow and adapt under extreme environmental conditions including within the presence of weak organic acid preservatives has led to substantial economic losses through manufactured food and beverage spoilage. The food industry has employed the use of various weak organic acids such as sorbic, benzoic and acetic acid as preservatives to help prevent spoilage by yeasts and moulds. The mechanisms by which S. cerevisiae is able to adapt to these weak organic acids have been extensively studied. A lesser studied weak organic acid preservative is citric acid. The aim of this study was to gain further information on the mechanisms of citric acid adaptation and through this identify potential targets for new preservation strategies. Current knowledge indicates the involvement of the HOG pathway in citric acid adaptation. A citric acid sensitivity screen from a previous study also isolated a SR protein kinase Sky1p, involved in polyamine metabolism, which has been connected with other crucial cellular processes including modulation of ion homeostasis and osmotic shock. In this study we have undertaken a systematic screen for genes that confer increased sensitivity to citric acid paying particular attention to those involved in polyamine metabolism and those known to encode proteins which have evidence of interactions with Sky1p. Many of the deletion strains tested exhibited hypersensitivity to citric acid including Δsky1. Protein-protein interaction maps for Sky1p highlighted an interesting secondary interacting protein Nmd5p, an importin crucial for the nuclear localization of Hog1p. This information suggested there may be the possibility of linkage between Sky1p and Hog1p and their roles in citric acid tolerance, perhaps through Nmd5p. This provided an incentive to perform a range of experiments to test this theory. Proteomic and phosphoproteomic analyses were carried out to study protein expression and phosphorylation changes in response to citric acid stress. Comparative proteomic analyses for Δsky1, Δhog1 and BY4741a with and without citric acid identified four instances of analogous protein expression responses in both Δsky1 and Δhog1, suggesting functional overlap upon exposure to citric acid. Epistasis studies of Δhog1Δsky1 suggested that the two protein kinases do not function on the same pathway. However, overexpression analyses did suggest some functional interaction between Hog1p and Sky1p in mediating citric acid resistance since overexpression of Sky1p in Δhog1 resulted in partial rescue of growth. Further supporting evidence for some functional interaction or linkage was provided by Hog1p phosphorylation and localisation studies. Δsky1 exhibited dual phosphorylation of Hog1p in the absence of citric acid stress; implying that loss of SKY1 results in dual phosphorylation of Hog1p by either prompting phosphorylation or perhaps by interfering with dephosphorylation of Hog1p. Localisation studies of Hog1p proved that like osmotic stress, citric acid stress results in nuclear translocation of Hog1p and deletion of SKY1 seemed to interfere with this localisation to some extent. In light of the results attained in this study we believe we have evidence to propose a novel role for Sky1p in mediating resistance to citric acid and that there is also substantial evidence to suggest that Sky1p shares some functional redundancy and perhaps functional linkage with Hog1p in citric acid adaptation.

Plant hormones are responsible for plant growth and adaptation to the environment. Among them the most important are cytokinins. Plants undergo gene silencing processes called homology-dependent gene silencing processes. In Arabidopsis there are two homology-dependent gene silencing genes that were chosen for further study, namely AtHOG1 and AtHOG2. Transgenic plants were generated previously with ten different constructs containing AtHOG1 or AtHOG2 genes and were used in this study. Some of the constructs had GFP attached so that the protein expressed could be visualised in a confocal microscope. Transgenic plants generated were T1 and T2 generations. Their DNA was extracted from leaves. By means of PCR transgenic plants were identified. There were 147 samples. Among them there were 39 positiveswith BAR primers and 32 positives with construct specific primers. The localisation of the HOG2 protein was observed in a confocal microscope. Seeds used were T3 generation and were obtained from the lab. HOG2 protein was found to be localised in cell membrane, root tip and chloroplasts.

In response to osmotic shock in Saccharomyces cerevisiae the MAP kinase Hog1 coordinates a large-scale transcriptional stress response, rapidly producing hundreds of copies of specified transcripts. Many of the most highly induced genes are bound and regulated by a transcription factor, Sko1, but lack the canonical binding site for this factor. We use ChIP-seq to demonstrate a stress-specific binding mode of Sko1. In stress, Sko1 binds to promoters in close proximity to Hog1, and another Hog1-regulated transcription factor, Hot1. This mode of Sko1 binding requires the physical presence of Hog1, but not Hog1 phosphorylation of Sko1. We identify candidate Sko1 and Hot1 binding motifs that predict co-localization of Sko1, Hot1, and Hog1 at promoters. We then demonstrate a role for Sko1 and Hot1 in directing Hog1-associated RNA Pol II to target genes, where Hog1 is present with the elongating polymerase. We suggest a possible model for Hog1 reprogramming of transcription in the early stages of the osmotic stress response. We then determine the extent and structure of the Hog1 controlled transcriptional program in a related stress, damage to the cell wall. We find that Sko1 and Hot1 have different apparent thresholds for activation by Hog1. In addition, in cell wall damage, Hog1 regulates an additional transcription factor, Rlm1, that is not involved in other Hog1 regulated stress responses. This factor is activated by the coincidence of a signal from Hog1 with that of another MAP kinase, Slt2.

[EN] Cells respond to environmental stimuli by fine tuned regulation of gene expression. In this thesis we investigate the dose dependent modulation of the genetic response upon nutrient and stress signals in yeast. A destabilized version of firefly luciferase was used in living yeast cells as a real-time reporter for gene expression. This highly sensitive and non-invasive system can be simultaneously used upon many different experimental conditions in small culture aliquots. This allows the dose-response behaviour of gene expression driven by any yeast promoter to be reported and can be used to quantify important parameters, such as the threshold, sensitivity, response time, maximal activity and synthesis rate for a given stimulus. We applied the luciferase assay to the nutrient-regulated GAL1 promoter and the stress-responsive GRE2 promoter. We find that luciferase expression driven by the GAL1 promoter responds dynamically to growing galactose concentrations, with increasing synthesis rates determined by the light increment in the initial linear phase of activation. The GAL1 gene is activated with continuously increasing synthesis rates in a well defined range of galactose concentrations, correlating with a dynamic increase of histone remodeling and subsequent association of the RNAPII complex. Dose dependent chromatin remodeling appears to be the basis for the dynamic GAL1 expression since mutants with impaired histone dynamics show severely truncated dose response profiles. In the case of the GRE2 promoter, we demonstrate that the very short-lived version of luciferase used here is an excellent tool to quantitatively describe transient transcriptional activation. The luciferase expression controlled by the GRE2 promoter responds dynamically to a gradual increase of osmotic or oxidative stress stimuli, which is mainly based on the progressive increase of the time the promoter remains active. In contrast, the GRE2 promoter operates like an off/on switch in response to increasing osmotic stress with almost constant synthesis rates and exclusively temporal regulation of histone remodeling and RNAPII occupancy. The Gal3 inducer and the Hog1 MAP kinase seem to determine the different dose response strategies at the two promoters. Our analysis reveals important differences in the way dynamic signals create dose sensitive gene expression outputs. Taken together, the luciferase assay described here is an attractive tool to rapidly and precisely determine and compare kinetic parameters of gene expression. Additionally, the function of the specific transcriptor factor Smp1 involved in the yeast osmostress response was investigated. Location analyses upon osmotic stress reveal that Smp1 associates preferentially with the whole transcribed regions (ORFs) upon stress as opposed to other transcriptional activators involved in the osmostress response. However, Smp1 seems to be important for stress-activated gene expression only in the presence of the natural induced gene and not of artificial promoter fusions. This highlights the possible role of Smp1 in regulating gene expression from ORF sequences rather than promoter regions. / [ES] Las células responden a los estímulos ambientales a través de una regulación precisa de la expresión génica. En este trabajo se investigó la modulación dosis dependiente de la expresión de genes activados en respuesta a estrés y por nutrientes. Se utilizó una versión desestabilizada de luciferasa de luciérnaga en células vivas de levadura como reportero para la detección de la expresión génica en tiempo real. Este sistema altamente sensible y no invasivo puede ser utilizado simultáneamente en diferentes condiciones experimentales a través de pequeñas alícuotas de cultivo. Esto permite la caracterización dosis-respuesta de la regulación de los promotores de levadura y puede ser utilizado para cuantificar parámetros importantes como el umbral, la sensibilidad, el tiempo de respuesta, la actividad máxima y el ratio de síntesis provocado por un determinado estímulo. Se aplicó el ensayo luciferasa al promotor GAL1 regulado por nutrientes y al promotor GRE2 activado en respuesta a estrés. Se observó que la expresión de la luciferasa activada por el promotor GAL1 responde de forma dinámica a las crecientes concentraciones de galactosa, con un incremento del ratio de síntesis determinado por el aumento de luz en la fase lineal inicial de la activación, en función de una gama de concentraciones de galactosa bien definidas. Este mecanismo de regulación depende de un aumento en la remodelación de las histonas y la consecuente asociación del complejo ARN pol II. La remodelación de la cromatina dosis dependiente parece ser la base de la expresión dinámica de GAL1, pues los mutantes relacionados con la dinámica de las histonas muestran perfiles dosis respuesta severamente afectados. En el caso del promotor GRE2, se demostró que una versión de una luciferasa desestabilizada es una herramienta excelente para describir de forma cuantitativa la activación transcipcional transitoria. La expresión de la luciferasa controlada por el promotor GRE2 responde de forma dinámica al aumento gradual de estímulo de estrés osmótico u oxidativo. La activación se observa principalmente en el incremento progresivo del tiempo en que el promotor permanece activo. Diferentemente de GAL1, el promotor GRE2 opera a través de un cambio apagado/encendido en respuesta a un aumento de estrés osmótico a través de ratios de síntesis prácticamente constantes y cuya regulación solamente depende de la remodelación de la cromatina y de la permanencia de la ARN pol II. Finalmente, se puede especular que el inductor Gal3 y la MAPK Hog1 son las moléculas determinantes para las diferentes estrategias de respuesta dinámica para los dos promotores. En este trabajo se identifican importantes diferencias en la señalización dinámica determinada por la dosis de estímulo en la expresión génica. En conjunto, el ensayo de luciferasa presentado en este trabajo puede ser una herramienta interesante para determinar y comparar de forma rápida y precisa los parámetros de la expresión génica. Adicionalmente se investigó la función del factor de transcripción Smp1 involucrado en la respuesta a osmoestrés en levadura. Un análisis de la asociación a la cromatina in vivo bajo estrés osmótico demostró que Smp1 se une preferentemente a regiones transcritas (ORFs) lo que refleja un comportamiento diferente comparando con otros activadores transcripcionales de la respuesta a estrés osmótico. Sin embargo, Smp1 parece ser importante para la expresión génica activada por estrés osmótico sólo en la presencia del gen natural inducido y no de fusiones artificiales del promotor. Esto evidencia el posible papel de Smp1 en la regulación de la expresión génica desde secuencias ORF y no en las regiones promotoras. / [CA] Les cèl·lules responen als estímuls ambientals a través d'una regulació precisa de l'expressió gènica. A aquest treball es va investigar la modulació dosi dependent de l'expressió de gens activats en resposta a estrès i per nutrients. Es va utilitzar una versió desestabilitzada de luciferasa de cuca de llum en cèl·lules vives de llevat com a reporter per a la detecció de l'expressió gènica a temps real. Aquest sistema altament sensible i no invasiu pot ser utilitzat simultàniament en diferents condicions experimentals a través de xicotetes alíquotes de cultiu. Això permet la caracterització dosi-resposta de la regulació dels promotors de llevat i pot ser utilitzat per a quantificar paràmetres importants com el llindar, la sensibilitat, el temps de resposta, l'activitat màxima i el rati de síntesi provocat per un determinat estímul. L'assaig luciferasa es va aplicar al promotor GAL1 regulat per nutrients i al promotor GRE2 activat en resposta a estrès. Es va observar que l'expressió de la luciferasa activada pel promotor GAL1 respon de forma dinàmica a les creixents concentracions de galactosa, amb un increment del rati de síntesi determinat per l'augment de llum en la fase lineal inicial de l'activació, en funció d'una gama de concentracions de galactosa ben definides. Aquest mecanisme de regulació depèn d'un augment en la remodelació de les histones i la conseqüent associació del complex ARN pol II. La remodelació de la cromatina dosi dependent sembla ser la base de l'expressió dinàmica de GAL1, ja què els mutants relacionats amb la dinàmica de les histones mostren perfils dosi-resposta severament afectats. En el cas del promotor GRE2, es va demostrar que una versió d'una luciferasa desestabilitzada és una eina excel·lent per a descriure de forma quantitativa l'activació transcripcional transitòria. L'expressió de la luciferasa controlada pel promotor GRE2 respon de forma dinàmica a l'augment gradual d'estímul d'estrès osmòtic o oxidatiu. L'activació s'observa principalment a l'increment progressiu del temps al qual el promotor roman actiu. De forma diferent de GAL1, el promotor GRE2 opera a través d'un canvi apagat/encès en resposta a un augment d'estrès osmòtic a través de ratis de síntesi pràcticament constants i als quals la seua regulació només depèn de la remodelació de la cromatina i de la permanència de l'ARN pol II. Finalment, es pot especular que l'inductor Gal3 i la MAPK Hog1 són les molècules determinants per a les diferents estratègies de resposta dinàmica per als dos promotors. A aquest treball s'identifiquen importants diferències a la senyalització dinàmica determinada per la dosi d'estímul a l'expressió gènica. En conjunt, l'assaig luciferasa presentat a aquest treball pot ser una eina interesant per a determinar i comparar de forma ràpida i precisa els paràmetres de l'expressió gènica. Addicionalment, es va investigar la funció del factor de transcripció Smp1 involucrat en la resposta a osmoestrès en llevat. Una anàlisi de l'associació a la cromatina in vivo sota l'estrès osmòtic va demostrar que Smp1 s'uneix preferentment a regions transcrites (ORFs), el qual reflecteix un comportament diferent comparant amb altres activadors transcripcionals de la resposta a estrès osmòtic. Tot i així, Smp1 sembla ser important per a l'expressió gènica activada per estrès osmòtic només en la presència del gen natural induït i no de fusions artificials del promotor. Això evidencia el possible paper de Smp1 en la regulació de l'expressió gènica des de seqüències ORF i no a les regions promotores. / Rienzo, A. (2016). Estudio de la regulación dinámica de la expresión génica en respuesta a estrés osmótico en levadura [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/62160 / TESIS

A fundamental property of living cells is the ability to sense and respond appropriately to changing environmental conditions. In budding yeast (Sacharomyces cerevisiae), changes in extracellular osmotic conditions are sensed by the HOG SAPK pathway, which orchestrates the cell adaptation program required to maximize cell survival upon stress. Although most of the HOG pathway components have been described, little was known about the dynamics of the response. The aim of this thesis was to analyze the dynamic behavior of the HOG pathway. By using a chemical inhibitor and extensive signal quantification we showed that the HOG pathway is controlled by high basal signaling counteracted by a negative feedback regulatory system. This property determines dynamic signaling in terms of faster response times and higher sensitivity to small variations in extracellular stimuli. This thesis also aimed to implement novel strategies for biological computation that allow increasing complexity of circuits. By engineering signaling pathways in yeast, we have shown that distribution of computation tasks among several wired cells reduces wiring constraints and allows scalability of circuit complexity. Moreover, reusability of cells permits implementation of multiple circuits. Overall, our results define novel dynamic properties of the HOG pathway and have been important to achieve a better view of signal transduction process though MAPK pathways. Moreover, we have developed and implemented novel strategies for biological computation that solved fundamental constrains in the field of synthetic biology. / Una propietat cel•lular fonamental és l’habilitat de detectar estímuls i respondre coherentment a un ambient dinàmic. En cèl•lules de llevat (Saccharomyces cerevisiae), els canvis en l’osmolaritat externa són detectats per la via de senyalització de HOG que organitza tot el programa d’adaptació cel•lular, indispensable per assegurar la supervivència cel•lular en estrès osmòtic. Tot i que la gran majoria dels components de la via de HOG han estat identificats, la dinàmica del procés de senyalització és encara força desconeguda. L’objectiu d’aquest projecte de tesis ha estat analitzar el comportament dinàmic de la via de HOG. Gràcies a la utilització d’un al•lel inhibible de la MAPK Hog1 i a la quantificació sistemàtica del procés de senyalització, hem pogut demostrar que en la via de HOG existeix una intensa senyal basal reprimida constantment per un feedback negatiu depenent de la MAPK Hog1. Aquesta tesi també té com a objectiu la implementació de noves estratègies de computació biològica que permetin un increment de la complexitat dels circuits. Gràcies a la bioenginyeria de les vies de senyalització de llevat, hem demostrat que la distribució de la computació en diferents cèl•lules connectades entre elles disminueix les limitacions de connexió i permet incrementar la complexitat dels circuits a un baix cost. En conjunt, els nostres resultats defineixen noves propietats dinàmiques de la via de HOG i han estat importants per tenir una visió global millorada del procés de senyalització per vies de MAPK. A més, hem dissenyat i implementat noves estratègies de computació biològica que han resolt problemes fonamentals del camp de la biologia sintètica.