La apoptosis es un tipo de muerte celular programada que participa en procesos fisiológicos y fisiopatológicos. Muchas enfermedades neurodegenerativas de la retina involucran la muerte por apoptosis de las neuronales retinales, y tienen una característica en común, la presencia de daño oxidativo. Este estrés activa las vías que conducen a la apoptosis, y por lo tanto el conocimiento de los mecanismos por los cuales induce dicha activación es fundamental en el desarrollo de futuras estrategias terapéuticas. Durante las últimas dos décadas los esfingolípidos han sido intensamente estudiados por su participación en la apoptosis y supervivencia celular. Esfingolípidos simples como la ceramida y el producto de su deacilación, la esfingosina, son segundos mensajeros proapoptóticos en muchos tipos celulares, mientras que la esfingosina-1-fosfato (S1P, por sphingosine-1-phosphate), que se sintetiza por fosforilación de esfingosina, tiene importantes funciones como promotor de la proliferación y supervivencia. Por lo tanto, la regulación del metabolismo de los esfingolípidos podría ser una herramienta importante para controlar la apoptosis durante las enfermedades neurodegenerativas. Trabajos anteriores del laboratorio demuestran que el daño oxidativo induce apoptosis en cultivos primarios de neuronas retinales, fotorreceptoras y amacrinas, de rata. Además establecimos que la ceramida es un mediador de la apoptosis por estrés oxidativo en fotorreceptores in vitro. La inducción de daño oxidativo con paraquat (PQ) incrementa los niveles de ceramida, a través de su síntesis de novo, y la inhibición de esta síntesis evita la apoptosis. Puesto que la ceramida puede degradarse a esfingosina, en esta tesis nos propusimos determinar si la esfingosina también es un mediador de la apoptosis en los fotorreceptores in vitro. Realizando experimentos metabólicos en cultivos neuronales puros de retina de rata, tratados con [3H]palmitato, determinamos que el daño oxidativo aumenta los niveles de esfingosina en los fotorreceptores, antes de la activación de la apoptosis. Además, mediante el método de TUNEL y marcación con Anexina/ioduro de propidio establecimos que el agregado exógeno de esfingosina también indujo apoptosis en las neuronas de la retina in vitro, asociada a la pérdida del potencial de membrana mitocondrial y la translocación del citocromo c de las mitocondrias al citosol. En diversos tipos celulares, la degradación de la ceramida a esfingosina, catalizada por ceramidasas, es necesaria para desencadenar la apoptosis. Para determinar si la apoptosis de los fotorreceptores, inducida por ceramida o por daño oxidativo, requiere de la síntesis de esfingosina, utilizamos un inhibidor de la ceramidasa alcalina. Demostramos que la inhibición de la ceramidasa alcalina bloquea la apoptosis activada por PQ o por ceramida exógena en los fotorreceptores. Muchos factores tróficos modulan el metabolismo de los esfingolípidos. En nuestro laboratorio demostramos que el ácido docosahexaenoico (DHA, por docosahexaenoic acid), un factor trófico para los fotorreceptores, los protege del daño oxidativo y dicha protección requiere de la formación de glucosilceramida. Uno de los objetivos de esta tesis fue estudiar si el DHA regula otros pasos del metabolismo de los esfingolípidos. Investigamos si el DHA controla la síntesis de S1P que como ya mencionamos, es un esfingolípido con importantes propiedades anti-apoptóticas. La S1P es sintetizada por la fosforilación de esfingosina a través de la actividad de esfingosinas quinasas, de las cuales se conocen dos isoformas, SphK1 y SphK2. Con diversas técnicas citoquímicas, determinamos que DHA protege a los fotorreceptores de la apoptosis por daño oxidativo o por agregado de ceramida o esfingosina, y que la inhibición de la formación de S1P, catalizada por la SphK1 bloquea el efecto protector del DHA. Además, incubando a cultivos neuronales con [3H]esfingosina, establecimos que el DHA promueve la metabolización de la esfingosina a S1P. Por lo tanto, uno de los mecanismos por los cuales el DHA tiene un efecto antiapoptótico en los fotorreceptores sería a través del incremento de la síntesis de S1P, un esfingolípido antiapoptótico, disminuyendo los niveles de esfingosina, uno antiapoptótico. S1P también puede actuar extracelularmente a través de sus receptores de membrana. Existen 5 subtipos de estos últimos, denominados S1P1-5. En esta tesis, demostramos que la S1P exógena protege a los fotorreceptores de retina del daño oxidativo o de la apoptosis inducida por esfingosina a través de su receptor de membrana S1P3, puesto que el uso de un antagonista para éste bloquea el efecto protector de S1P. Debido a que luego de la síntesis de S1P, ésta puede ser transportada al medio extracelular, decidimos evaluar si DHA actúa a través de este mecanismo y la posterior activación del receptor S1P3. Demostramos que el bloqueo del receptor S1P3 no inhibe el efecto protector del DHA sobre los fotorreceptores de la apoptosis por daño oxidativo o esfingosina exógena. Por lo tanto, sugerimos que el DHA no requiere de la activación de S1P3 para proteger a los fotorreceptores del daño oxidativo; el DHA promovería la síntesis de S1P, que luego actuaría como mensajero intracelular o activaría a otros receptores distintos de S1P3. Las células gliales de Müller tienen importantes funciones de sostén metabólico y trófico para las neuronas de retina.Además, las células gliales podrían ser una fuente potencial de células madre. Por eso, el estudio de su capacidad para proteger a las neuronas así como de regenerarlas, podría hacer aportes al desarrollo de terapias para las enfermedades neurodegenerativas. Investigamos si las células de Müller son capaces de posponer la apoptosis neuronal por daño oxidativo en cocultivos neurogliales. Utilizando técnicas citoquímicas demostramos que los oxidantes PQ y peróxido de hidrógeno no activan la apoptosis glial ni la neuronal en cultivos gliales puros y cocultivos neurogliales, respectivamente. Mediante técnicas inmunocitoquímicas y Western blot establecimos que el estrés oxidativo indujo la proliferación glial, la disminución de la expresión de marcadores de diferenciación glial in vitro y un incremento de aquellos que indican dediferenciación. Por esto, proponemos que el estrés oxidativo promueve la proliferación y dediferenciación de las células de Müller in vitro sugiriendo su capacidad para regenerar neuronas. A su vez, las células gliales protegen a las neuronas fotorreceptoras y amacrinas de la apoptosis inducida por estrés oxidativo. Diversos factores tróficos y diferentes vías de transducción de señales participan en la interacción neurona-glía de Müller, pero no se conoce si los esfingolípidos están involucrados en dicha interacción. Cuando estudiamos el efecto de S1P sobre las células gliales de Müller de retina de rata, por captación de Br-deoxiuiridna y de [3H]timidina, determinamos que este esfingolípido es un potente mitógeno,ya que estimula notablemente la proliferación glial. Investigamos también si S1P participa en los mecanismos desencadenados por las células de Müller para proteger a las neuronas retinales del daño oxidativo. Utilizando un inhibidor de la síntesis de S1P y un antagonista del receptor S1P3, determinamos que la formación de S1P y la activación de S1P3 son necesarias para que las células gliales de Müller promuevan la supervivencia de las neuronas de retina. Los resultados más importantes de esta tesis son: El estrés oxidativo induce la síntesis de esfingosina en fotorreceptores de retina de rata in vitro. El estrés oxidativo requiere de la formación de esfingosina, catalizada por la ceramidasa alcalina, para activar la apoptosis en las neuronas de la retina. La esfingosina, junto con la ceramida, sería un mediador esencial para la activación de la apoptosis debida al daño oxidativo. El DHA estimula la fosforilación de esfingosina a S1P en fotorreceptores. El DHA requiere la formación de S1P para retrasar la apoptosis de las neuronas retinales por estrés oxidativo y el agregado de ceramida o esfingosina. La S1P protege a los fotorreceptores de la apoptosis inducida por daño oxidativo y por agregado de ceramida y esfingosina. La S1P protege a los fotorreceptores de la apoptosis inducida por daño oxidativo y esfingosina exógena a través de la activación del receptor de membrana S1P3. El DHA no requiere de la activación de S1P3 para posponer la apoptosis de los fotorreceptores por estrés oxidativo. La S1P sería un segundo mensajero cuya síntesis sería promovida por el DHA para ejercer sus efectos antiapoptóticos sobre los fotorreceptores de retina. El estrés oxidativo promueve la proliferación y dediferenciación de las células de Müller de rata in vitro, pero no su apoptosis. Las células gliales posponen la apoptosis de las neuronas por daño oxidativo. S1P es un potente inductor de la proliferación de las células de Müller. Las células de Müller requieren de la síntesis de S1P y la activación de S1P3 para proteger a las neuronas de la retina del daño oxidativo. / Role of the sphingolipids on the processes activated by oxidative stress in retinal neurons and glial cells. Apoptosis is a form of programmed cell death involved in many physiological and physiopathological processes. It is involved in retinal neuron death in many retinal neurodegenerative diseases. Oxidative damage is a common factor in these diseases and activates the pathways leading to apoptosis so dilucidating the mechanisms that activate apoptotic death is crucial for developing therapeutic strategies for these diseases. During the last two decades, sphingolipids have been intensively studied due to their participation in cell death and survival. Simple sphingolipids as ceramide and its deacylation product, sphingosine, are well-know second messengers of apoptosis in several cell types, whereas sphingosine-1-phosphate (S1P), synthesized by phosphorylation of sphingosine, has important functions as a positive modulator of proliferation and survival. Therefore, the regulation of sphingolipid metabolism may be an important tool to control apoptosis during neurodegenerative diseases. Previous studies from our lab have shown that oxidative damage induces apoptosis in primary cultures of rat retinal neuron, mainly constituted by photoreceptors and amacrine neurons. We also established that ceramide is a mediator of apoptosis induced by oxidative stress in photoreceptors in vitro. Oxidative damage induced by the oxidant paraquat (PQ) increases ceramide levels by stimulating its de novo biosynthesis. Since ceramide can be deacylated to sphingosine, in this thesis work we have investigated whether sphingosine is also a mediator of apoptosis in photoreceptors in vitro. Incubating neuronal cultures with [3H]palmitate, we have demonstrated that oxidative stress augments sphingosine levels before the onset of apoptosis. Moreover, using TUNEL and Anexin/propidium iodide labeling, we established that addition of exogenous sphingosine induced apoptosis in retinal neurons in vitro. In several cell types, the metabolization of ceramide to sphingosine, catalysed by ceramidases, is necessary to trigger apoptosis. To determine whether ceramide or oxidative stress-induced apoptosis of photoreceptors requires sphingosine synthesis, we used an alkaline ceramidase inhibitor. By a combination of immunochemical techniques, we showed that the inhibition of alkaline ceramidase prevented ceramide or PQ-induced apoptosis in photoreceptors. Many trophic factors modulate sphingolipid metabolism. We have established that docosahexaenoic acid (DHA), a trophic factor for photoreceptors, protects these cells from apoptosis induced by oxidative damage, and the synthesis of glucosylceramide is required for this protection. One of the purposes of this thesis work was to study whether DHA regulates other pathways of sphingolipid metabolism. We investigated whether DHA controls the synthesis of S1P, a sphingolipid with well-known anti-apoptotic properties. S1P is formed by phosphorylation of sphingosine through the activity of sphingosine kinases, of which two isoforms, SphK1 and SphK2, have been identified. We determined that DHA delayed photoreceptor apoptosis induced by oxidative damage and addition of ceramide or sphingosine. Furthermore, inhibition of S1P formation by SphK1 blocked the anti-apoptotic effect of DHA. Incubating neuronal cultures with [3H]sphingosine, we demonstrated that the addition of DHA promoted the synthesis of S1P. Therefore, we suggest that the anti-apoptotic effect of DHA on photoreceptors is achieved through an increase of S1P synthesis, which simultaneously lowers sphingosine levels. S1P can act extracellularly by activating its membrane receptors, which are constituted by 5 different subtypes called S1P1-5. By a combination of cytochemical techniques, we first showed that exogenous S1P protected photoreceptors apoptosis induced by oxidative damage or by addition of sphingosine and ceramide. Using an antagonist of S1P3 receptor, we demonstrated that S1P protection required the activation of S1P3. S1P might be released to the extracellular medium after its synthesis, to act in an autocrine/paracrine manner on its membrane receptors. Hence, we evaluated whether DHA acted through this mechanism, promoting S1P synthesis and its later release and activation of S1P3, to protect photoreceptors. We showed that an antagonist of S1P3 did not affect DHA prevention of photoreceptor apoptosis by oxidative damage or exogenous sphingosine. Therefore, we suggest that DHA does not need S1P3 activation to prevent photoreceptor apoptosis; DHA might promote intracellular S1P synthesis, and S1P would then act as a second messenger or activate S1P receptors other than S1P3. Müller glial cells have important functions in metabolic and trophic support for retina neurons. Moreover, glial has been proposed as a potencial source of stem cells. Therefore, they might be a useful tool to develop therapies for neurodegenerative diseases. We investigated whether Müller glial cells were able to protect neuronal apoptosis induced by oxidative damage in rat neuroglial cocultures. The incubation with oxidants PQ and hydrogen peroxide during twelve hours of incubation did not trigger apoptosis in glial cells or neurons in pure glial cultures and neuroglial cocultures, respectively. Instead, using immunocytochemistry and Western blot, we showed that oxidative stress induced glial proliferation, decrease of expression of glial markers and an increase of dedifferentiation markers. So, we propose that oxidative stress activated proliferation and dedifferentiation of Müller cells in vitro suggesting their capacity to be stem cells. Glial cells also protected amacrine and photoreceptors from oxidative stress-induced apoptosis. Many trophic factors and different signal transduction pathways are involved in Müller glial-neuron crosstalk but little is known concerning a role for sphingolipids in this interaction. We first investigated the effect of S1P in pure glial cultures and demonstrated, by Br-deoxyuridine and [3H]thymidine uptake that S1P is a potent mitogen for Müller cells, which markedly increased their proliferation. We also evaluated whether S1P participated in the mechanisms activated by Müller cells to protect neuronal apoptosis induced by oxidative stress. Using an inhibitor of SphK1 and an antagonist for S1P3 we showed that the synthesis of S1P and the activation of S1P3 are essential for Müller cells to promote the survival of retina neurons. The major findings of this thesis work are: Oxidative stress induces synthesis of sphingosine in rat retina photoreceptors in vitro. Oxidative stress requires the synthesis of sphingosine, catalyzed by alkaline ceramidase, to activate apoptosis in photoreceptors. Sphingosine, together with ceramide, is a key mediator involved in the triggering of apoptosis induced by oxidative stress. DHA stimulates the synthesis of S1P. DHA requires of the synthesis of S1P to prevent neuronal apoptosis induced by oxidative stress and addition of ceramide or sphingosine. S1P protects photoreceptor from oxidative damage and exogenous sphingosine addition through activation of the S1P3 membrane receptor. DHA does not require S1P3 activation to delay apoptosis of photoreceptor by oxidative damage. S1P might be a second messenger, whose intracellular levels are increased by DHA, to promote photoreceptor survival upon oxidative stress, ceramide and sphingosine-induced apoptosis. Oxidative stress promotes the proliferation and dedifferentiation of rat Müller cells in vitro, but not their apoptosis. Müller glia prevents the apoptosis of retinal neurons by oxidative stress. S1P is a potent inductor of proliferation in Müller cells. Müller cells require S1P synthesis and S1P3 activation to protect retina neurons from oxidative damage.

El objetivo general de esta tesis fue contribuir al conocimiento de la fisiología del sistema reproductor masculino a través del estudio de cómo esfingolípidos que son específicos de las células espermatogénicas (o células germinales, CG) cambian con el avance de la maduración sexual y la diferenciación celular. El foco estuvo sobre las especies moleculares de esfingomielina (SM) y de ceramida (Cer) con ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) de muy larga cadena (VLCPUFA), que se presentan como VLCPUFA no hidroxilados (n-V) y 2-hidroxilados (h-V) de hasta 32 átomos de carbono en las CG de rata. Los objetivos específicos fueron i) investigar cómo se distribuyen estas especies moleculares entre las membranas de las CG, ii) determinar cómo cambia con el desarrollo testicular y la diferenciación celular la expresión de los genes que codifican a las enzimas responsables de la biosíntesis de los n-V y los h-V, iii) establecer si las CG aisladas son capaces de biosintetizar por sí mismas estas especies de Cer y de SM entre otras a través de la vía de novo y de expresar las correspondientes sintasas, y iv) inquirir sobre factores endocrinos y/o paracrinos capaces de modular dicha actividad y/o expresión. Los efectos del desarrollo se estudiaron en testículos de animales de distintas edades postnatales (P), y los de la diferenciación en poblaciones de CG en los estadios de espermatocitos en paquiteno (EP), espermátidas redondas (ER), y espermátidas elongadas o tardías (ET), aisladas a partir de las células totales (CT) del epitelio seminífero de ratas adultas. En algunas mediciones se incluyeron a los cuerpos residuales (CR) y a las células de Sertoli (SC). Las poblaciones de CG se aislaron utilizando gradientes continuos de albúmina. Los estudios que requirieron separación, aislamiento e identificación de clases de lípidos y especies moleculares se hicieron por técnicas cromatográficas de alta resolución y sensibilidad. Las investigaciones sobre biosíntesis de n-V o de esfingolípidos (SL) se hicieron en CG mantenidas en cultivo primario, siguiendo las transformaciones biológicas de sustratos radioactivos. La expresión de genes a nivel ARNm se comparó aplicando PCR cuantitativa, y a nivel proteína se evaluó utilizando técnicas de Western blot seguida de inmunomarcación con anticuerpos, y en cortes de tejido por microscopía de inmunofluorescencia. En la primera parte de la tesis se compararon la localización y la distribución de glicerofosfolípidos (GPL), colesterol y SM entre fracciones de membrana obtenidas de EP, ER y ET. El foco estuvo puesto en la distribución lateral de las especies moleculares de SM y Cer con VLCPUFA entre fracciones de membrana conteniendo dominios tipo raft y no-raft, partiendo de la hipótesis de que estas especies se verían excluidas de los primeros. Utilizando preparaciones de CT, inicialmente comparamos dos métodos, originalmente diseñados para estudiar la separación lateral de proteínas en membranas, para decidir cuál sería más apropiado para evaluar la distribución lateral de los lípidos. El método clásico, que utiliza detergente en frío para obtener fracciones de membrana ricas en dominios tipo raft, mostró bajas recuperaciones de lípido y proteína, separación incompleta de los lípidos entre dominios, interferencia del detergente en los análisis, e hidrólisis parcial de GPL y SM. Se encontró preferible un método que usa gradientes de sacarosa para separar fracciones de membrana sobre la base de su densidad a partir de homogenados totales (HT), pues permitió separar fracciones de membrana livianas, pesadas, y extra-pesadas (ML, MP y MEP, respectivamente) además de una fracción aún más pesada en el pellet o sedimento de la homogenización. La recuperación, tanto del fósforo lipídico como de la proteína, alcanzó, en promedio, un 85% del originalmente presente en los HT. Proteínas marcadoras mostraron que las pequeñas ML contenían dominios tipo-raft/caveolas, y las abundantes MP dominios no-raft, principalmente derivados de la membrana plasmática, mientras las MEP eran ricas en membranas intracelulares. Consistente con su rol como precursoras de esfingolípidos con VLCPUFA, especies de Cer con n-V y h-V se hallaron más concentradas en las MEP. Como se esperaba, las ML contenían GPL y SM con AG saturados, mientras las MP eran ricas en GPL con PUFA y SM con VLCPUFA. Llamativamente, tal vez debido a la alta insaturación de esos ácidos grasos, la relación colesterol/fosfolípidos fue más alta en las MP que en las ML. Con el avance de la diferenciación, el contenido de Cer con VLCPUFA, especialmente h-V Cer, tendió a aumentar en las MP de las CG en el sentido EP→ER→ET. En el mismo sentido, mientras los ácidos grasos de los lípidos de ML no variaron, en los de las MP las relaciones 22:5n-6/20:4n-6 en GPL y h-V/n-V en SM y en Cer aumentaron en forma altamente significativa. En la segunda parte, se determinó la expresión de enzimas que se espera jueguen un papel en la biosíntesis de los n-V y los h-V de SM y Cer. El foco estuvo puesto en la Elovl4 y la Fa2h, con la hipótesis, basada en lo que habían mostrado los lípidos, de que sus expresiones aumentarían con el desarrollo postnatal en el testículo y que, en las CG de animales adultos, variarían en sentidos opuestos, la primera disminuyendo y la segunda aumentando con la diferenciación. Seis de los 7 miembros de la familia de genes Elovl, se expresaron a nivel ARNm en CG. Los genes Elovl5 y Elovl2 se incluyeron en el estudio por codificar elongasas cuya actividad parcialmente se superpone, colaborando en la biosíntesis de PUFA, y porque Elovl2 es esencial en la formación de PUFA de 24 carbonos que sirven de sustrato a la Elovl4. Contrario a lo esperado, el nivel de ARNm de Elovl4 se halló elevado en testículos que virtualmente carecían de CG (y de SM o Cer con n-V), como lo fueron los de animales en edades infantiles (P14) y los de adultos (P90) que habían sido despojados de CG por exposiciones repetidas a episodios de hipertermia. Esta aparente inconsistencia se debió a que el nivel de ARNm de Elovl4 fue inesperadamente alto en las SC. Con la maduración sexual, los niveles de Elovl4-ARNm en el testículo decrecieron hasta la adultez, para permanecer luego relativamente constantes. Entre las células espermatogénicas del adulto, los contenidos más altos de este ARNm aparecieron en las ET y en los CR. En contraste con Elovl4, Fa2h no se expresó como ARNm en el testículo hasta la edad de aparición de las ER (P26), y sus niveles aumentaron con el crecimiento y la diferenciación celular. Como proteínas, ni Elovl4 ni Fa2h se expresaron en las SC. Elovl4 estuvo más concentrada en EP que en ER, en las que mostró una localización perinuclear. En el citoplasma de las ET apareció concentrada en pequeñas estructuras esféricas que podrían ser CR en formación. Como proteína, Fa2h se encontró especialmente concentrada en las ET, asociada a una estructura supranuclear que juega un rol importante en dar la forma definitiva a la cabeza de los futuros espermatozoides. Elovl4 y Fa2h no se detectaron en las gametas liberadas desde el epitelio seminífero. La actividad combinada de las elongasas en estudio (Elovl5, Elovl2 y Elovl4) se evaluó comparando las conversiones sufridas por el [3H]20:4n-6 en cultivos de EP, ER y ET, así como de SC. Este PUFA fue elongado en las cuatro poblaciones celulares a [3H]22:4 y [3H]24:4, y estos productos fueron activamente desaturados a [3H]22:5 y [3H]24:5. Como se esperaba, se encontraron n-V tetraenoicos y pentaenoicos marcados con [3H] de 26 y hasta 32 carbonos sólo en las CG. La actividad de elongación de PUFA decreció en el sentido EP→ER→ET. En la tercera parte, con la hipótesis de que las CG serían capaces de producir sus propios esfingolípidos, investigamos cómo espermatocitos y espermátidas biosintetizan Cer, SM y GlcCer, y cómo dicha actividad, así como la expresión de los genes de las correspondientes sintasas, cambian con la diferenciación. Paralelamente evaluamos la posibilidad de que la biosíntesis y/o la expresión génica estuvieran afectadas por la testosterona (Tes) y por factores solubles liberados desde las SC. Empleando como precursor al [3H]16:0 y dos inhibidores específicos de la ruta biosintética de novo (Lcicloserina y fumonisina B1) hallamos que las CG, aisladas y en cultivo, son capaces de biosintetizar sus propias Cer y SM, incluyendo sus especies moleculares con VLCPUFA, además de GlcCer. Estas actividades biosintéticas fueron máximas en los EP, disminuyendo con la diferenciación (EP>>ER). La Tes estimuló la biosíntesis de [3H]SM sólo en las ER. La suplementación con el medio condicionado obtenido de cultivos de SC (MCS) estimuló significativamente la formación de [3H]Cer tanto en EP como en ER, la de [3H]SM sólo en ER, y la de [3H]GlcCer sólo en EP. La Tes y el MCS incrementaron a todas las especies moleculares de Cer y de SM, incluyendo las n-V. En comparación con el MCS sólo, la combinación Tes+MCS promovió significativamente la biosíntesis de [3H]SM en los EP, mientras la redujo en las ER, en las cuales incrementó la marcación de [3H]Cer y de [3H]GlcCer. El estímulo sobre la marcación de Cer y SM fue específico para las [3H]n-V Cer y [3H]n-V SM. El significativo fomento que sobre la biosíntesis de novo ejerció el MCS indica que factores solubles (o transportados en microvesículas) provenientes de las SC (incluyendo tal vez distintas formas de ARN), juegan un rol en promover, en las CG, la biosíntesis de esfingolípidos destinados a sus membranas. En esta tercera parte de la tesis también se investigó la expresión a nivel ARNm de genes que codifican para cuatro sintasas (S) clave implicadas en la biosíntesis de SL (CerS3, SMS1, SMS2, y GlcCerS), de tres elongasas de ácidos grasos (Elovl5, Elovl2 y Elovl4), y de Fa2h. Se encontró que los niveles de ARNm de CerS3 fueron máximos en EP y los de SMS2 máximos en ER, ambos disminuyendo en las ET. Los de GlcCerS disminuyeron menos que éstos con la diferenciación, y los de SMS1 no variaron. Los cuatro ARNm también aparecieron en los CR. Mientras CerS3 no se expresó en las SC, los ARNm de las demás sintasas se encontraron en ellas, aunque en cantidades menores que en las CG. En la última parte de esta sección se estudiaron, en las células espermatogénicas totales, los efectos de la Tes, del MCS, y de Tes+MCS sobre los niveles de ARNm de las enzimas mencionadas. Las expresiones como ARNm de Elovl2 y Elovl4 mostraron ser reguladas por el MCS, las de SMS2 y Elovl5 por MCS y Tes, y la de Fa2h sólo por Tes. La Tes y el MCS, tanto por separado como combinados, no afectaron los niveles de ARNm de CerS3, SMS1, o GlcCerS, mientras tendieron a reducir los de SMS2. La presencia de Tes no afectó el ARNm de Elovl2 ni el de Elovl4, mientras tendió a aumentar el de Elovl5. El MCS, por su parte, redujo significativamente los ARNm de las tres elongasas. Cuando Tes y MCS se combinaron, el ARNm de Elovl5 aumentó, y los de Elovl2 y Elovl4 continuaron bajos, recapitulando la influencia de Tes y del MCS, respectivamente. El efecto más significativo de la Tes, tanto sola como combinada con el MCS, fue el de estimular la expresión de Fa2h. Tomados en conjunto, estos resultados muestran por primera vez que factores que juegan roles fisiológicos en la espermatogénesis, como lo son la testosterona y moléculas liberadas desde las células de Sertoli, son capaces de estimular la biosíntesis de novo de esfingolípidos en las células espermatogénicas y de regular, en algunos casos a la alta y en otros a la baja, la expresión génica de algunas de las enzimas responsables de dicha biosíntesis. / The overall objective of this work was to contribute to the knowledge of the physiology of the male reproductive system by examining how molecular species of sphingolipids that are specific of spermatogenic cells (or germ cells, GC) change with the progress of sexual maturation and cell differentiation. The focus was on the sphingomyelins (SM) and ceramides (Cer) having polyunsaturated fatty acids (PUFA) with very long chains (VLCPUFA), which occur in their non-hydroxy (n-V) and 2-hydroxy (h-V) forms and have up to 32 carbon atoms in rat GC. The specific aims were i) to investigate how these molecular species distribute among the GC membranes, ii) to determine how the expression of genes that code for the enzymes responsible for the biosynthesis of n-V and h-V changes with testis maturation and GC differentiation; iii) to ascertain whether isolated GC are able to biosynthesize these species of Cer and SM among others through the de novo pathway and to express the corresponding synthases, and iv) to inquire into endocrine and/or paracrine factors that are capable of modulating such an activity and/or expression. The effects of development were studied in testes at specific postnatal ages, and those of differentiation in GC populations at the stages of pachytene spermatocytes (PtS), round spermatids (RS), and elongated or late spermatids (LS) that were isolated from the total cells (TC) of the seminiferous epithelium of adult rats. In some analyses the residual bodies (RB) and the Sertoli cells (SC) were included. The GC populations were isolated using continuous gradients of albumin. The studies that required separation, isolation, and identification of lipid classes and molecular species were performed using chromatographic techniques of high resolution and sensitivity. The investigations about biosynthesis of n-V and of sphingolipids (SL) were done in GC maintained in primary culture by following the biological transformations of radioactive substrates. Gene expression at the mRNA level was compared by applying quantitative PCR, and at the protein level it was evaluated using Western blot followed by immunolabeling with antibodies, and in tissue sections by immunofluorescence microscopy. In the first part of the thesis the localization and distribution of glycerophospholipids (GPL), cholesterol, and SM among membrane fractions obtained from PtS, RS, and LS were compared. The focus was on the lateral distribution of the molecular species of SM and Cer with VLCPUFA between membrane fractions containing raft-like and non-raft domains, with the hypothesis that these species would be excluded from the former. Using TC preparations, initially we compared two methods, originally designed to study the lateral separation of proteins in membranes, in order to decide which one would be most suitable to evaluate the lateral distribution of lipids. The classic method that uses detergent at low temperature to obtain fractions rich in raft-like domains showed poor recuperation of lipid and protein, incomplete separation of lipids between membrane fractions, interference of the detergent in lipid analyses, and partial hydrolysis of GPL and SM. A method that employs sucrose gradients to separate membrane fractions from total homogenates (TH) on the basis of their densities was preferred, as it allows separation of light, heavy, and extra-heavy membrane fractions (LM, HM, and EHM, respectively) and an even heavier fraction in the pellet or sediment of homogenization. The recovery of lipid phosphorus and protein amounted, in average, to an 85% of that originally present in the TH. Protein markers showed that the small LM fractions contained raft-like/caveolae domains, and that the abundant HM had non-raft domains, mostly derived from cell plasma membranes, whereas the EHM were rich in intracellular membranes. Consistent with their role as precursors of sphingolipids with VLCPUFA, Cer species with n-V and h-V were found most concentrated in EHM. As expected, the LH contained GPL and SM with saturated fatty acids, whereas the HM fractions were rich in GPL with PUFA and SM with VLCPUFA. Interestingly, perhaps because of the high unsaturation of these fatty acids, the cholesterol/phospholipid ratio was higher in HM than in LH. The content of Cer with VLCPUFA, especially h-V Cer, tended to increase in the MP of GC with the progress of differentiation in the direction PtS→RS→LS. In the same direction, the fatty acids of LH lipids did not vary, while in those of MP the 22:5n-6/20:4n-6 ratio in GPL and the h-V/n-V ratio in SM and Cer increased in a highly significant form. In the second part, the expression of enzymes that are expected to play a role in the biosynthesis of the n-V and h-V of SM and Cer was determined. The focus was placed on Elovl4 and Fa2h, on the hypothesis, based on what lipids had shown, that their expressions would increase in testes with postnatal development and that, in adult animal GC, their expressions would vary in opposite directions, the former decreasing and the latter increasing with cell differentiation. Six of the 7 members of the Elovl gene family were expressed at the mRNA level in GC. The Elovl5 and Elovl2 genes were included in the survey as they code for elongases with partially overlapping activities, collaborating in the biosynthesis of PUFA, and because Elovl2 is essential in the formation of the 24 carbons PUFA that serve as substrates to Elovl4. Against our expectations, the Elovl4 mRNA level was found high in testes virtually lacking GC (and SM or Cer with n-V), as were those of animals in infantile ages (P14) and those of adults that had been deprived of their GC by repeated exposures to episodes of hyperthermia. This apparent inconsistency was due to the fact that the mRNA level of Elovl4 was unexpectedly high in SC. With sexual maturation, the Elovl4-mRNA levels in testes decreased up to adulthood, then remaining relatively constant. Among adult spermatogenic cells, the highest content of this mRNA appeared in LS and RB. In contrast with Elovl4, Fa2h did not express itself as mRNA in testes until the appearance of RS (P26), and their levels increased with cell growth and differentiation. As proteins, Elovl4 and Fa2h were not expressed in SC. Elovl4 showed a perinuclear localization, was more concentrated in PtS than in RS, and then appeared concentrated in small spherical structures in LS cytoplasm, which could be RB in formation. As a protein, Fa2h was found mainly concentrated in LS, associated to a supranuclear structure that plays an important role in giving the final shape to the heads of the sperm cells to-be. Elovl4 and Fa2h were not detected in the gametes released from the seminiferous epithelium. The combined activity of the elongases under study (Elovl5, Elovl2 and Elovl4) was evaluated by comparing the conversions undergone by [3H]20:4n-6 in cultures of PtS, RS and LS, as well as of SC. In the four cell populations this PUFA was elongated to [3H]22:4 and [3H]24:4, and these products were actively desaturated to [3H]22:5 and [3H]24:5. As expected, [3H]-labeled tetraenoic and pentaenoic n-V having 26 to 32 carbons were found only in GC. The activity of PUFA elongation decreased in the direction PtS→RS→LS. In the third part, with the hypothesis that GC would be able to produce their own SL, we investigated how spermatocytes and spermatids biosynthesize Cer, SM and GlcCer, and how such an activity, as well as the expression of genes of the corresponding synthases, would change with cell differentiation. In parallel we evaluated the possibility that biosynthesis and/or gene expression would be affected by testosterone (Tes) and by soluble factors released from SC. Employing [3H]16:0 as precursor and two specific inhibitors of the de novo biosynthetic pathway (L-cycloserine and fumonisin B1), we found that GC, isolated and in culture, are able to biosynthesize their own Cer and SM, including their molecular species with VLCPUFA, and also GlcCer. These biosynthetic activities were maximal in PtS, decreasing with differentiation (PtS>>RS). Tes stimulated the biosynthesis of [3H]SM, only in RS. Supplementation with the conditioned medium obtained from SC cultures (CMS), significantly stimulated the formation of [3H]Cer in PtS and RS, that of [3H]SM only in RS, and that of [3H]GlcCer only in PtS. All the molecular species of Cer and SM were increased by Tes and CMS, including the n-V. In comparison with CMS, the combination Tes+CMS significantly promoted the biosynthesis of [3H]SM in PtS, while reducing it in ER, in which cells it increased the labeling of [3H]Cer y de [3H]GlcCer. The stimuli on Cer and SM labeling was specific on the [3H]n-V Cer and [3H]n-V SM. The significant enhancement that CMS exerted on the de novo biosynthesis indicates that factors that are soluble (or transported in microvesicles) coming from SC (perhaps including different forms of RNA), play a role in promoting in CG the biosynthesis of SL destined to their membranes. In this third part of the thesis we also evaluated the expression, at the mRNA level, of genes that code for four key sinthases (S) involved in the biosynthesis of SL (CerS3, SMS1, SMS2, and GlcCerS), of three fatty acid elongases (Elovl5, Elovl2 y Elovl4), and of Fa2h. We found that the mRNA levels of CerS3 were maximal in PtS and those of SMS2 maximal in RS, while both decreased in LS. Those of GlcCerS varied less than these with differentiation and those of SMS1 did not vary. The four mRNA also appeared in RB. Whereas CerS3 was not expressed in SC, the mRNA of the other synthases was, although in lesser amounts than in GC. In the last part of this section the effects of Tes, CMS, and Tes+CMS on the mRNA levels of the above-mentioned enzymes were studied in total spermatogenic cells. The expressions as mRNA of Elovl2 and Elovl4 were regulated by CMS, those of SMS2 and Elovl5 by CMS and Tes, and that of Fa2h only by Tes. Tes and CMS, either separately or in combination, did not affect the mRNA levels of CerS3, SMS1, or GlcCerS, while tended to reduce those of SMS2. The presence of Tes did not affect the mRNA of Elovl2 or Elovl4, while tended to increase those of Elovl5. The CMS reduced significantly the mRNA levels of the three elongases. When Tes and CMS were together, the mRNA of Elovl5 increased, and those of Elovl2 and Elovl4 continued low, recapitulating the influence of Tes and CMS, respectively. The most significant effect of Tes, either alone or combined with CMS, was to stimulate the expression of Fa2h. Taken together, these results show for the first time that factors that play physiological roles in spermatogenesis, as testosterone and molecules released from Sertoli cells do, are able to stimulate the de novo biosynthesis of sphingolipids in spermatogenic cells, and to regulate, in some cases positively and in others negatively, the gene expression of some of the enzymes responsible for such biosynthesis.

Desde hace casi tres décadas, los esfingolípidos han entrado a la escena de los lípidos bioactivos. Dentro de esta gran familia, son sus versiones más simples los que han sido relacionados con importantes funciones celulares. La Ceramida (Cer), y su derivado por deacilación, la esfingosina (Sph), han sido reportados como segundos mensajeros de muerte en diversos tipos celulares. Por su parte, sus derivados fosforilados, en especial la esfingosina-1-fosfato (S1P), se han identificado con funciones proliferativas y pro-supervivencia. Diversas señales mitogénicas contribuyen no solo a la proliferación sino también a la migración celular, siendo de especial interés en ciertas patologías como el cáncer. Sin embargo, los procesos celulares invasivos son relevantes también en la retina, el tejido de interés de este trabajo de tesis. Diversas patologías, como la retinopatía diabética, presentan una proliferación exacerbada de las células gliales de Müller (CGM), el principal tipo glial de la retina, proceso conocido como gliosis. En su inicio, esta respuesta es un intento fisiológico por aislar al tejido neuronal de la injuria y reparar el daño. Sin embargo, en un estado patológico, ante la continuidad de la injuria, esta proliferación celular termina convirtiéndose en una cicatriz que afecta el normal funcionamiento del tejido retiniano, llevando en última instancia a la pérdida parcial o total de la visión. Por lo expuesto, resulta relevante investigar estos procesos proliferativos de la retina a fin de encontrar nuevos tratamientos terapéuticos. La información sobre las funciones del esfingolípido mitogénico S1P a nivel de la retina es escasa. Por ejemplo, se ha reportado que la S1P promueve la proliferación y respuestas pro-fibróticas y pro-inflamatorias en células de epitelio pigmentario y que participa en la neo-vascularización retinal y coroidal. Además, los niveles retinales y plasmáticos de S1P aumentan en un modelo inflamatorio inducido por lipopolisacárido. En el primer capítulo de este trabajo de tesis, planteamos la hipótesis de que la S1P podría estar involucrada en los procesos glióticos, participando como una señal clave para inducir la migración glial. Para contrastar nuestra hipótesis, utilizamos un modelo de cultivo primario de células gliales de Müller y analizamos la migración glial mediante el “ensayo de la herida”, un método sencillo y ampliamente utilizado para este propósito. Nuestros experimentos revelaron que la adición exógena de S1P induce modificaciones en el citoesqueleto de las CGM, detectadas en las primeras 8-10 h de tratamiento, que llevan a la formación de lamelipodios y al inicio de la motilidad glial sobre el sustrato. Esta motilidad glial fue claramente superior a la de los cultivos controles luego de 18 h de estímulo. Las CGM expresaron dos de los cinco receptores transmembrana para S1P, los S1PR, específicamente los subtipos S1P1 y S1P3, siendo la activación de este último la que desencadena el proceso migratorio, tal como lo demostraron experimentos utilizando antagonistas selectivos de ambos receptores. Nuestros resultados también mostraron que rio-abajo de la activación del S1P3 se activarían dos importantes vías intracelulares, la vía de ERK/MAPK y la vía de PI3K, ya que el pre-tratamiento con inhibidores de estas vías disminuyó significativamente el estímulo migratorio inducido por S1P. Cabe destacar que esta inducción del proceso migratorio no estuvo acompañada de un incremento significativo en la proliferación glial. Por otra parte, no solo la S1P exógena tuvo un rol en la migración glial. Encontramos que la inhibición de la síntesis endógena de S1P, utilizando un inhibidor selectivo de la enzima esfingosina quinasa 1 (Sphk1) (enzima que cataliza la síntesis de S1P), el inhibidor de SphK1 2 (SphKI2), prácticamente abolió la migración glial basal, es decir aquella observada aun en ausencia de S1P. Estos resultados demuestran que la S1P tiene un rol clave en la inducción de migración glial en la retina, y su bloqueo podría ser utilizado como una estrategia terapéutica para las enfermedades proliferativas de la retina. Otro conjunto de patologías de la retina, de creciente avance y lamentablemente aun sin tratamientos efectivos, son las enfermedades neurodegenerativas. Las mismas son un conjunto de patologías, entre las que destacan la retinitis pigmentosa y la degeneración de la mácula con una variada etiología, con múltiples factores, desde genéticos hasta ambientales como desencadenantes, pero que comparten un denominador común: la muerte de los fotorreceptores (FR). Esta degeneración progresiva de los FR lleva, como consecuencia final, a la pérdida de la visión. Como se describió, Cer y Sph son importantes mediadores de muerte celular y han despertado la atención en el campo de las enfermedades neurodegenerativas. Estudios pioneros encontraron que los niveles de Cer se encontraban aumentados en retinas pos mortem de pacientes con la enfermedad de Faber, y que los niveles de este esfingolípido aumentaban frente a la degeneración neuronal inducida por desprendimiento de retina. Posteriores reportes, incluidos los de nuestro laboratorio, establecieron que la Cer es un mediador clave en la muerte de los FR en cultivo. El daño oxidativo estimula la síntesis de Cer que desencadena la muerte de los FR y este proceso es mimetizado por la adición exógena de un análogo sintético de ceramidas endógenas, la C2-Ceramida (C2Cer). Hallazgos posteriores en diversos modelos animales de neurodegeneración retiniana permiten proponer a la Cer como un mediador central en la activación de la muerte de los FR. Pese a esto, aún no se conoce en profundidad cuáles son los mecanismos moleculares involucrados en este proceso. Esta pregunta resulta relevante, ya que la regulación de los distintos blancos intracelulares de Cer podría emerger como posible terapia para las enfermedades neurodegenerativas de la retina. Ante esto, nos planteamos como objetivo en el 2º capítulo de esta Tesis, estudiar los mecanismos moleculares involucrados en la muerte de los FR mediada por C2Cer, utilizando un modelo de cultivo primario de neuronas de retina de rata. Un trabajo previo de nuestro laboratorio demostró que la C2Cer, en una concentración de 10 μM induce la muerte de los FR y las neuronas amacrinas, los tipos neuronales mayoritarios en los cultivos. Estudiando el proceso de muerte de manera cronológica, encontramos que el tratamiento de cultivos neuronales con C2Cer 10 μM durante 6 h indujo selectivamente la muerte de los FR, disminuyendo el potencial de membrana mitocondrial y aumentando la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS). En contraste, las neuronas amacrinas preservaron su viabilidad. Cabe destacar que la cantidad de células marcadas con TUNEL y de FR que expresaron caspasa-3 clivada, forma activa de la caspasa-3, permanecieron constantes y que el pretratamiento con un pan inhibidor de caspasas no evitó la muerte inducida por C2Cer. C2Cer provocó la sobre activación de la poli-ADP ribosil polimerasa-1 (PARP-1). La inhibición de PARP-1 disminuyó la muerte de los FR inducida por C2Cer. A su vez, C2Cer aumentó los niveles de polímero de poli-ADP ribosa (PAR), cuya síntesis es catalizada por PARP-1, e indujo la translocación del factor inductor de apoptosis (AIF) de las mitocondrias al núcleo de los FR, ya que dicha translocación se previno mediante la inhibición de PARP-1. El pretratamiento con un inhibidor de calpaínas y catepsinas, y con un inhibidor de la calpaína redujo la muerte de los FR, mientras que los inhibidores selectivos de catepsinas no otorgaron protección. El pretratamiento combinado con un inhibidor de PARP-1 y un inhibidor de calpaína evidenció la misma protección que cada inhibidor por sí mismo. Esto sugiere que tanto PARP-1 como calpaínas confluyen en el mismo mecanismo de acción rio-abajo de la C2Cer. Ni la autofagia ni la necroptosis estuvieron involucradas en la muerte inducida por C2Cer; no se observó un aumento en la liberación de LDH después del tratamiento con C2Cer y el pretratamiento con inhibidores de la necroptosis y de la autofagia no rescataron a los FR. Estos resultados sugieren que la C2Cer activa la muerte de los FR por un mecanismo novedoso, independiente de caspasas, que implica la activación de PARP-1, disminución del potencial de membrana mitocondrial, activación de calpaína y translocación de AIF, todas las características bioquímicas del tipo de muerte celular denominada parthanatos. Nuestros resultados, sugieren así nuevos blancos terapéuticos, y contribuyen a los avances en la búsqueda de tratamientos efectivos para las enfermedades neurodegenerativas de la retina. / For almost three decades, sphingolipids have entered the bioactive lipid scenery. Within this large family, simple sphingolipids are the ones that have been related to important cellular functions. Ceramide (Cer), and its deacylation derivative, sphingosine (Sph), have been reported as death second messengers in several cell types. On the other hand, its phosphorylated derivatives, especially sphingosine-1-phosphate (S1P) have been related to proliferative and pro-survival functions. Several mitogenic signals contribute not only to proliferation but also to cell migration, being of special interest in certain pathologies such as cancer. However, invasive cellular processes are also relevant in the retina, the tissue of interest in this thesis work. Diverse pathologies, such as diabetic retinopathy, show an exacerbated proliferation of Müller glial cells (CGM, the main glial type of the retina), a process known as gliosis. Initially, this response is a physiological attempt to isolate neuronal tissue from injury and repair the damage. However, in a pathological state, given the continuity of the injury, this cell proliferation gives rise to a scar that affects the normal functioning of the retinal tissue, ultimately leading to a partial or total vision loss. Therefore, it is relevant to investigate these retinal proliferative processes in order to find new therapeutic treatments. There is scarce information on the functions of the mitogenic sphingolipid S1P in the retina. S1P has been reported to promote proliferation, pro-fibrotic and pro-inflammatory responses in pigment epithelial cells and it also participates in retinal and choroidal neovascularization. In addition, there is an increase in retinal and plasma levels of S1P in an inflammatory model induced by lipopolysaccharide. In the first chapter of this thesis we propose the hypothesis that S1P might be involved in gliotic processes, as a key signal in the induction of glial migration. To test our hypothesis, we used a primary culture model of Müller glial cells and evaluated cell migration by the scratch-wound assay, which is a simple and widely used method. Our experiments revealed that the exogenous addition of S1P modified the CGM cytoskeleton, in the first 8-10 hours of treatment. This addition led to the formation of lamelipodia and to the onset of glial motility. This motility was markedly enhanced compared to control conditions after 18 h of S1P addition. CGM expressed two of the five transmembrane receptors for S1P (S1PR), specifically the S1P1 and S1P3 subtypes. However, only activation of S1P3 was required to induce S1P-induced CGM migration, as evidenced by experiments performed with S1P1 and S1P3 antagonists. Analysis of the signaling pathways activated downstream of S1P3 evidenced that two well-known pathways, the ERK/MAPK and PI3K pathways were activated, since pre-treatment with specific inhibitors, significant reduced S1P-induced glial migration. Of note, this induction of the migratory process was not accompanied by a significant increase in glial proliferation. On the other hand, not only exogenous S1P played a role in glial migration. Inhibition of the endogenous synthesis of S1P, using a selective inhibitor of the enzyme sphingosine kinase 1 (Sphk1) (the enzyme that catalyzes the synthesis of S1P), the SphK1 inhibitor number 2 (SphKI2), virtually blocked the basal glial migration, i.e. the migration level observed in the absence of exogenous S1P. These results demonstrated that the S1P-S1P3 axis has a key role in the induction of migration in the retina, and its targeting might provide an interesting approach in the search of new therapeutical treatments for proliferative diseases of the retina. Among retinal pathologies, neurodegenerative diseases are a set of diseases of the retina that progressively lead to vision loss and still lack effective treatments. Pathologies such as retinitis pigmentosa and macula degeneration have very diverse etiologies, varying from genetic to environmental triggers, but which share a common hallmark: the death of photoreceptors (PhRs). This progressive degeneration of PhR leads, as a final consequence, to visual disability and blindness. As described, Cer and Sph are important mediators of cell death and have attracted special attention in the field of neurodegenerative diseases. Pioneering studies found that Cer levels were increased in post-mortem retinas of patients with Faber's disease; furthermore, the levels of this sphingolipid are increased in neuronal degeneration induced by retinal detachment. Subsequent reports, including those from our laboratory, established that Cer is a key mediator in the death of PhRs in culture. Oxidative damage stimulates the synthesis of Cer, which triggers the death of photoreceptors and this process is mimicked by the exogenous addition of a synthetic analogue of an endogenous ceramide, C2-Ceramide (C2Cer). Further work using animal models of retina degeneration support a role for Cer as a crucial signal involved in the induction of PhR death. However, the molecular mechanisms involved in this process are still unknown. Uncovering them is very relevant, since regulating the different intracellular targets of Cer might provide new therapies for neurodegenerative diseases of the retina. The purpose of the second chapter of this thesis was to study the molecular mechanisms involved in the death of PhRs induced by C2Cer, using as a model primary cultures of rat retinal neurons. Previous work from our laboratory showed that 10 μM C2Cer induces the death of PhRs and amacrine neurons, the two major neuronal types in our cultures. A chronological analysis of the death process showed that treatment with 10 μM C2Cer for 6 h selectively induced the death of photoreceptors, decreasing mitochondrial membrane potential and increasing the formation of Reactive Oxygen Species (ROS). In contrast, amacrine neurons preserved their viability. Of note, the number of cells labeled with TUNEL and of photoreceptors expressing cleaved caspase-3 remained constant and a pretreatment with a pan caspase inhibitor did not prevent C2Cer-induced neuronal death. C2Cer caused over-activation of poly-ADP ribosyl polymerase-1 (PARP-1). The inhibition of PARP-1 decreased photoreceptor death induced by C2Cer. In turn, C2Cer increased poly-ADP ribose (PAR) polymer levels, the synthesis of which is catalyzed by PARP-1, and induced the translocation of apoptosis-inducing factor (AIF) from mitochondria to the nuclei, which was prevented by PARP-1 inhibition. Pretreatment with a calpain and cathepsin inhibitor, and with a selective calpain inhibitor, reduced photoreceptor death, whereas selective cathepsins inhibitors did not provide any protection. The combined pretreatment with a PARP-1 inhibitor and a calpain inhibitor showed the same extent of protection as each inhibitor by itself. This suggests that both PARP-1 and calpains converge downstream in the same mechanism. Neither autophagy nor necroptosis were involved in C2Cer-induced cell death; no increase in LDH release was observed after C2Cer treatment and pretreatment with necroptosis and autophagy inhibitors did not rescue photoreceptors. These results suggest that the C2Cer-induced photoreceptor death signaling by a novel caspase-independent mechanism, which involves PARP-1 activation, a decrease in mitochondrial membrane potential, activation of calpain and translocation of AIF, all of which are biochemical characteristics of the cell death type named parthanatos. In conclusion, our results identify a new therapeutic target, thus contributing to the advances in the search for effective treatments for neurodegenerative diseases of the retina.

In the present work we study the metabolic adaptation in response to stress in the yeast model, and more specifically we investigate the regulation of peroxisomal activity and the metabolism of sphingolipids. Peroxisomes are dynamic organelles and the sole location for fatty acid ß-oxidation in yeast cells. Here we find that peroxisomal function is crucial for the adaptation to salt stress, especially upon sugar limitation. Multiple layers of control regulate both peroxisomal activity and number upon stress. Activated Hog1 MAP kinase triggers the induction of genes encoding enzymes for fatty acid activation, peroxisomal import and ß-oxidation through the Adr1 transcriptional activator, which transiently associates with genes encoding fatty acid metabolic enzymes in a stress- and Hog1-dependent manner. Moreover, Na+ and Li+ stress induces an increase in peroxisomal number per cell in a Hog1-independent manner, which depends instead of the retrograde pathway and the dynamin related GTPases Dnm1 and Vps1. The strong activation of the Faa1 fatty acyl-CoA synthetase, which specifically localizes to lipid particles and peroxisomes, indicates that adaptation to salt stress requires the enhanced mobilization of fatty acids from internal lipid stores. Taken together, these results suggest that stress-induced peroxisomal ß-oxidation triggers enhanced respiration upon salt shock. Sphingolipids are regulators of mitochondria-mediated cell death in higher eukaryotes. However, how changes in sphingolipid metabolism and downstream intermediates impinge on mitochondrial function is unknown. Here we found in yeast that within the sphingolipid degradation pathway, the production via Dpl1 and degradation via Hfd1 of hexadecenal is critical for mitochondrial function and cell death. Genetic interventions, which favor hexadecenal accumulation, diminish oxygen consumption rates and increase ROS production and mitochondrial fragmentation and viceversa. The location of the hexadecenal degrading enzyme Hfd1 in punctuate structures all along the mitochondrial network depends on a functional ERMES complex, indicating that modulation of hexadecenal levels at specific ER-mitochondria contact sites might be an important trigger of cell death. This is further supported by the finding that externally added hexadecenal or the absence of Hfd1 enhance cell death caused by human Bax protein. Finally, the induction of the sphingolipid degradation pathway upon stress is controlled by the Hog1 MAP kinase. Therefore the stressregulated modulation of sphingolipid degradation might be a conserved way to induce cell death in eukaryotic organisms. / En el presente trabajo se estudia la adaptación metabólica en respuesta a estrés en el modelo de levadura, y de forma más concreta se investiga la regulación de la actividad peroxisomal y el metabolismo de esfingolípidos. Los peroxisomas son orgánulos dinámicos, encargados de forma específica de la ß-oxidación de ácidos grasos en células de levadura. Aquí se muestra cómo la función peroxisomal es crucial para la adaptación al estrés salino, especialmente en condiciones de ayuno de glucosa. Se regula a múltiples niveles tanto la actividad peroxisomal como su número ante condiciones de estrés. La activación de la MAP quinasa Hog1 desencadena la inducción de genes que codifican enzimas para la activación, importación peroxisomal y ß-oxidación de los ácidos grasos. Esta regulación génica ocurre a través del activador transcripcional Adr1, que se asocia transitoriamente con los genes que codifican enzimas metabólicas de ácidos grasos de una manera dependiente del estrés y de Hog1. Además, el estrés causado por Na+ y Li+, provoca un aumento en el número de peroxisomas por célula de manera independiente de Hog1, que depende a su vez de la ruta retrógrada y de las dinaminas GTPasas Dnm1 y Vps1. La fuerte activación de la acil-CoA sintetasa Faa1, que se localiza específicamente en las partículas lipídicas y los peroxisomas, indica que la adaptación a estrés salino requiere una mayor movilización de ácidos grasos de los almacenes de lípidos internos. Estos resultados indican que la ß-oxidación peroxisomal inducida por estrés desencadena un aumento de la respiración ante el choque salino. Los esfingolípidos son reguladores de la muerte celular mediada por la mitocondria en eucariotas superiores. Sin embargo, se desconoce cómo, cambios en el metabolismo de los esfingolípidos y en intermediarios aguas abajo, afectan a las funciones mitocondriales. En este trabajo se describe cómo en la ruta de degradación de esfingolípidos de levadura, la producción de hexadecenal a través de Dpl1 y su degradación a través de Hfd1, es crítica para la función mitocondrial y la muerte celular. Intervenciones genéticas que favorecen la acumulación de hexadecenal, disminuyen el consumo de oxígeno de las células e incrementan la producción de ROS y la fragmentación mitocondrial, y a la inversa. La localización de Hfd1, que es la enzima que degrada el hexadecenal, es puntual en lugares cercanos a la red mitocondrial. Y esta localización depende de un complejo ERMES funcional, lo que indica que la modulación de los niveles de hexadecenal en lugares específicos de contacto entre el retículo endoplasmático y la mitocondria, podría ser un importante desencadenante de la muerte celular. Estos datos son apoyados por el hecho de que el hexadecenal añadido de forma externa o la ausencia de Hfd1, promueve la muerte celular inducida por la proteína Bax humana. Finalmente, la inducción de la ruta de degradación de esfingolípidos en condiciones de estrés, está controlada por la MAP quinasa Hog1. Por lo tanto, la modulación de la degradación de esfingolípidos regulada por estrés, podría ser una vía conservada para inducir la muerte celular en organismos eucariotas. / Al present treball s'estudia l'adaptació metabòlica en resposta a estrés al model de llevat, i de forma més concreta s'investiga la regulació de l'activitat peroxisomal i el metabolisme d'esfingolípids. Els peroxisomes són orgànuls dinàmics, encarregats de forma específica de la ß-oxidació dels àcids grassos en cèl·lules de llevat. Ací es mostra com la funció peroxisomal es crucial per a l'adaptació a l'estrés salí, especialment en condicions de dejuni de glucosa. Es regula a múltiples nivells tant l'activitat peroxisomal com el seu número, davant de condicions d'estrés. L'activació de la MAP quinasa Hog1 desencadena la inducció de gens que codifiquen enzims per a l'activació, importació peroxisomal i ß-oxidació dels àcids grassos. Aquesta regulació génica té lloc mitjançant l'activador transcripcional Adr1, que s'assòcia transitoriamente amb els gens que codifiquen enzims metabòliques d'àcids grassos d'una manera dependent de l'estrés i de Hog1. A més, l'estrés causat per Na+ i Li+, provoca un augment en el número de peroxisomes per cèl·lula de manera independent de Hog1, que depén a la vegada de la ruta retrògrada i de les dinamines GTPases Dnm1 i Vps1. La forta activació de la acil-CoA sintetasa Faa1, que es localitza específicament a les partícules lipídiques i als peroxisomes, indica que l'adaptació a estrés salí necesita d'una major movilització d'àcids grassos dels magatzems de lípids interns. Estos resultats indiquen que la ß-oxidació peroxisomal induïda per estrés desencadena un augment de la respiració davant el xoc salí. Els esfingolípids són reguladors de la mort cel·lular mitjada per la mitocóndria en eucariotes superiors. No obstant, es desconeix cóm, canvis al metabolisme dels esfingolípids i en intermediaris aigües baix, afecten a les funcions mitocondrials. En aquest treball es descriu cóm en la ruta de degradació de esfingolípids de llevat, la producció d'hexadecenal mitjançant Dpl1 i la seua degradació mitjançant Hfd1, és crítica per a la funció mitocondrial i la mort cel·lular. Intervencions genètiques que afavorixen l'acumulació d'hexadecenal, disminuixen el consum d'oxigen de les cèl·lules i incrementen la producció de ROS i la fragmentació mitocondrial, i a la inversa. La localització de Hfd1, que es l'enzim que degrada l'hexadecenal, és puntual en llocs propers a la red mitocondrial. I esta localització depén d'un complex ERMES funcional, el que indica que la modulació dels nivells d'hexadecenal en llocs específics de contacte entre el reticle endoplasmàtic i la mitocòndria, podria ser un important desencadenant de la mort cel·lular. Estes dades son recolzades pel fet de que l'hexadecenal afegit de forma externa o l'absència de Hfd1, promou la mort celul¿lar induïda per la proteïna Bax humana. Finalment, la inducció de la ruta de degradació d'esfingolípids en condicions d'estrés, está controlada por la MAP quinasa Hog1. Por tant, la modulació de la degradació d'esfingolípids regulada per estrés, podria ser una via conservada per a induïr la mort cel·lular en organismes eucariotes. / Manzanares Estreder, S. (2017). Estudio de la adaptación metabólica en respuesta a estrés: Regulación de la actividad peroxisomal y del metabolismo de esfingolípidos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/79083