El objetivo del presente estudio fue comparar el régimen de quimioterapia estándar BEP vs el régimen PEI en el tratamiento de pacientes con tumores de células germinales diseminado avanzado de alto riesgo, en cuanto a respuesta completa, respuesta favorable, sobrevida libre de enfermedad, sobrevida global y toxicidad. Pacientes y método: Un total de 35 pacientes con diagnostico de tumor de células germinales diseminado avanzado de mal pronostico (IGCCG)que recibieron quimioterapia con esquema BEP o PEI entre enero 1995 y diciembre 1999 en el Servicio de Oncología Medica del Hospital Rebagliatti fueron evaluados retrospectivamente. Resultados: 14 pacientes con esquema BEP y 21con esquema PEI fueron evaluados. Las tasa de respuesta completa (PEI,26%;BEP,28%), tasas de respuesta favorable (PEI,45%;BEP,42%) y sobrevida global a 3 años (PEI,71%;BEP,65%) no fueron significativamente diferentes entre los 2 tratamientos. La tasa de sobrevida libre de enfermedad a 3 años fue significativamente mayor para el esquema PEI (62 vs 56%). La toxicidad hematológica y genitourinaria fue significativamente mayor en los pacientes que recibieron PEI.

El objetivo del presente estudio fue comparar el régimen de quimioterapia estándar BEP vs el régimen PEI en el tratamiento de pacientes con tumores de células germinales diseminado avanzado de alto riesgo, en cuanto a respuesta completa, respuesta favorable, sobrevida libre de enfermedad, sobrevida global y toxicidad. Pacientes y método: Un total de 35 pacientes con diagnostico de tumor de células germinales diseminado avanzado de mal pronostico (IGCCG)que recibieron quimioterapia con esquema BEP o PEI entre enero 1995 y diciembre 1999 en el Servicio de Oncología Medica del Hospital Rebagliatti fueron evaluados retrospectivamente. Resultados: 14 pacientes con esquema BEP y 21con esquema PEI fueron evaluados. Las tasa de respuesta completa (PEI,26%;BEP,28%), tasas de respuesta favorable (PEI,45%;BEP,42%) y sobrevida global a 3 años (PEI,71%;BEP,65%) no fueron significativamente diferentes entre los 2 tratamientos. La tasa de sobrevida libre de enfermedad a 3 años fue significativamente mayor para el esquema PEI (62 vs 56%). La toxicidad hematológica y genitourinaria fue significativamente mayor en los pacientes que recibieron PEI.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Determina las características epidemiológicas, el tratamiento efectuado y seguimiento de los pacientes que fueron diagnosticados de tumor de células germinales testicular en el Servicio de Oncología Médica del HNERM los años del 2009 al 2010. Dentro de su desarrollo se consideró la recolección de datos de pacientes con diagnostico de tumor de células germinales en el servicio de Anatomía Patológica del Hospital Edgardo Rebagliati Martins de EsSalud, para luego recolectar los datos de las historias clínicas, de manera retrospectiva según formato establecido en el proyecto. Se obtuvieron datos de 42 casos diagnosticados en el periodo 2009 – 2010, de los cuales se determinó que la edad media de presentación de esta patología es de 32 años (25 – 35 años con más frecuencia), no se encontró relación entre trauma testicular o hábitos nocivos y la aparición de esta neoplasia, así como que el tiempo de enfermedad media de presentación fue de 5.4 meses, y la forma de presentación como masa testicular no dolorosa. No se encontraron datos suficientes para recomendar alguna prueba auxiliar para determinar el diagnostico de TCG, la mayor frecuencia de presentación fue como tumores mixtos, siendo la histología más frecuente teratoma, y en el 75% de los casos la enfermedad fue detectada en estadios tempranos. Se concluye y recomienda que se requiere, un registro de nacional de presentación de esta enfermedad, y estudios con mayor población así como de carácter prospectivo para obtener mayores datos sobre la presentación de esta enfermedad, dada la presentación en pacientes jóvenes, en formas tempranas y la alta posibilidad curativa de esta neoplasia. Además es necesario implementar programas de detección precoz a nivel nacional con la intención de detectar más tempranamente esta enfermedad e incrementar las posibilidades de curación. / Trabajo académico

El propósito primario de cualquier organismo superior con reproducción sexual es pasar sus genes a la siguiente generación vía sus células germinales primordiales (PGCs), células troncales del sistema reproductor. Al transplantar intraespecíficamente las células germinales, éstas colonizan la membrana basal de los túbulos seminíferos del animal receptor en busca del nicho donde se desarrollan las células madre. Es así que la técnica de transplante de PGCs permite que las células madres de origen fetal sean conservadas y divididas en su estado multipotente por largos periodos de tiempo en el animal receptor, preservando el material genético. Así, el presente trabajo de tesis tiene por objetivo evaluar la colonización intraluminal de una suspensión cruda de PGCs de fetos de ratón de la cepa Balb C en los túbulos seminíferos de ratones adultos. Para ello se aislaron las PGCs desde las crestas genitales de fetos machos con dos pasos de digestiones enzimáticas (Tripsina 0.25% y colagenasa tipo IV, 1 mg/ml), transplantándose en los túbulos seminíferos del animal receptor vía rete testis, a los ratones receptores previamente se les disminuyó drásticamente su línea germinal con tratamiento químico con Busulfán (40 mg/kg). Los animales receptores fueron mantenidos por 54 días en un bioterio con 14 horas luz y 10 horas oscuridad. Luego de este periodo los animales fueron sacrificados por dislocación cervical, se les extrajo los testículos y se realizó cortes histológicos seriados de 10 _m de espesor, coloreados con hematoxilina y eosina Y. La evaluación evidenció una colonización intraluminal en 1 de cada 100 túbulos seminíferos evaluados. Lo que demostraría que las PGCs de fetos de 14.5 días post coitum (dpc) si tienen la capacidad de colonizar los túbulos seminíferos de individuos adultos de la misma especie. / --- The aim function of a organism with sexual reproduction is to transmit their genes to the next generation throught their primordial germ cell (PGCs), stem cells of the reproductor system, they colonized basal membrane of seminiferous tubule in the receptor animal, search their nich where they can differentiate to sperms. In the Transplant PGCs Technique, we could preserved and multiplicated cells for long time in their multipotent state in the receptor animal, conserved in their multipotent state. The present Thesis objective is to evaluate the intraluminal colonization of a suspension of PGCs of fetus mice Balb C in semiferous tubule of adult mice. In my research, PGCs were isolated from fetus male mice with two enzimatic digestion steps (Tripsin 0.25% and Colagenase Type IV 1 mg/ml), PGCs were transplanted into the rete testis of the receptor animal that previously were injected with Busulfán (40 mg/kg) to decrease their own spermatogenesis. Mice receptor were maintained in bioterio conditions with 14 hours light and 10 hours dark for fifty four days, they were sacrificed by cervical dislocation, their testis were extracted for and histology procedures of 10 _m, colored with hematoxilin and Y eosin. In this research the intraluminal colonization was identified in 1 of 100 seminiferous tubule. In conclusion, transplantation of PGCs of foetus from 14.5 dpc can colonized the seminiferous tubule.

El propósito primario de cualquier organismo superior con reproducción sexual es pasar sus genes a la siguiente generación vía sus células germinales primordiales (PGCs), células troncales del sistema reproductor. Al transplantar intraespecíficamente las células germinales, éstas colonizan la membrana basal de los túbulos seminíferos del animal receptor en busca del nicho donde se desarrollan las células madre. Es así que la técnica de transplante de PGCs permite que las células madres de origen fetal sean conservadas y divididas en su estado multipotente por largos periodos de tiempo en el animal receptor, preservando el material genético. Así, el presente trabajo de tesis tiene por objetivo evaluar la colonización intraluminal de una suspensión cruda de PGCs de fetos de ratón de la cepa Balb C en los túbulos seminíferos de ratones adultos. Para ello se aislaron las PGCs desde las crestas genitales de fetos machos con dos pasos de digestiones enzimáticas (Tripsina 0.25% y colagenasa tipo IV, 1 mg/ml), transplantándose en los túbulos seminíferos del animal receptor vía rete testis, a los ratones receptores previamente se les disminuyó drásticamente su línea germinal con tratamiento químico con Busulfán (40 mg/kg). Los animales receptores fueron mantenidos por 54 días en un bioterio con 14 horas luz y 10 horas oscuridad. Luego de este periodo los animales fueron sacrificados por dislocación cervical, se les extrajo los testículos y se realizó cortes histológicos seriados de 10 _m de espesor, coloreados con hematoxilina y eosina Y. La evaluación evidenció una colonización intraluminal en 1 de cada 100 túbulos seminíferos evaluados. Lo que demostraría que las PGCs de fetos de 14.5 días post coitum (dpc) si tienen la capacidad de colonizar los túbulos seminíferos de individuos adultos de la misma especie. / The aim function of a organism with sexual reproduction is to transmit their genes to the next generation throught their primordial germ cell (PGCs), stem cells of the reproductor system, they colonized basal membrane of seminiferous tubule in the receptor animal, search their nich where they can differentiate to sperms. In the Transplant PGCs Technique, we could preserved and multiplicated cells for long time in their multipotent state in the receptor animal, conserved in their multipotent state. The present Thesis objective is to evaluate the intraluminal colonization of a suspension of PGCs of fetus mice Balb C in semiferous tubule of adult mice. In my research, PGCs were isolated from fetus male mice with two enzimatic digestion steps (Tripsin 0.25% and Colagenase Type IV 1 mg/ml), PGCs were transplanted into the rete testis of the receptor animal that previously were injected with Busulfán (40 mg/kg) to decrease their own spermatogenesis. Mice receptor were maintained in bioterio conditions with 14 hours light and 10 hours dark for fifty four days, they were sacrificed by cervical dislocation, their testis were extracted for and histology procedures of 10 _m, colored with hematoxilin and Y eosin. In this research the intraluminal colonization was identified in 1 of 100 seminiferous tubule. In conclusion, transplantation of PGCs of foetus from 14.5 dpc can colonized the seminiferous tubule.

El objetivo general de esta tesis fue contribuir al conocimiento de la fisiología del sistema reproductor masculino a través del estudio de cómo esfingolípidos que son específicos de las células espermatogénicas (o células germinales, CG) cambian con el avance de la maduración sexual y la diferenciación celular. El foco estuvo sobre las especies moleculares de esfingomielina (SM) y de ceramida (Cer) con ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) de muy larga cadena (VLCPUFA), que se presentan como VLCPUFA no hidroxilados (n-V) y 2-hidroxilados (h-V) de hasta 32 átomos de carbono en las CG de rata. Los objetivos específicos fueron i) investigar cómo se distribuyen estas especies moleculares entre las membranas de las CG, ii) determinar cómo cambia con el desarrollo testicular y la diferenciación celular la expresión de los genes que codifican a las enzimas responsables de la biosíntesis de los n-V y los h-V, iii) establecer si las CG aisladas son capaces de biosintetizar por sí mismas estas especies de Cer y de SM entre otras a través de la vía de novo y de expresar las correspondientes sintasas, y iv) inquirir sobre factores endocrinos y/o paracrinos capaces de modular dicha actividad y/o expresión. Los efectos del desarrollo se estudiaron en testículos de animales de distintas edades postnatales (P), y los de la diferenciación en poblaciones de CG en los estadios de espermatocitos en paquiteno (EP), espermátidas redondas (ER), y espermátidas elongadas o tardías (ET), aisladas a partir de las células totales (CT) del epitelio seminífero de ratas adultas. En algunas mediciones se incluyeron a los cuerpos residuales (CR) y a las células de Sertoli (SC). Las poblaciones de CG se aislaron utilizando gradientes continuos de albúmina. Los estudios que requirieron separación, aislamiento e identificación de clases de lípidos y especies moleculares se hicieron por técnicas cromatográficas de alta resolución y sensibilidad. Las investigaciones sobre biosíntesis de n-V o de esfingolípidos (SL) se hicieron en CG mantenidas en cultivo primario, siguiendo las transformaciones biológicas de sustratos radioactivos. La expresión de genes a nivel ARNm se comparó aplicando PCR cuantitativa, y a nivel proteína se evaluó utilizando técnicas de Western blot seguida de inmunomarcación con anticuerpos, y en cortes de tejido por microscopía de inmunofluorescencia. En la primera parte de la tesis se compararon la localización y la distribución de glicerofosfolípidos (GPL), colesterol y SM entre fracciones de membrana obtenidas de EP, ER y ET. El foco estuvo puesto en la distribución lateral de las especies moleculares de SM y Cer con VLCPUFA entre fracciones de membrana conteniendo dominios tipo raft y no-raft, partiendo de la hipótesis de que estas especies se verían excluidas de los primeros. Utilizando preparaciones de CT, inicialmente comparamos dos métodos, originalmente diseñados para estudiar la separación lateral de proteínas en membranas, para decidir cuál sería más apropiado para evaluar la distribución lateral de los lípidos. El método clásico, que utiliza detergente en frío para obtener fracciones de membrana ricas en dominios tipo raft, mostró bajas recuperaciones de lípido y proteína, separación incompleta de los lípidos entre dominios, interferencia del detergente en los análisis, e hidrólisis parcial de GPL y SM. Se encontró preferible un método que usa gradientes de sacarosa para separar fracciones de membrana sobre la base de su densidad a partir de homogenados totales (HT), pues permitió separar fracciones de membrana livianas, pesadas, y extra-pesadas (ML, MP y MEP, respectivamente) además de una fracción aún más pesada en el pellet o sedimento de la homogenización. La recuperación, tanto del fósforo lipídico como de la proteína, alcanzó, en promedio, un 85% del originalmente presente en los HT. Proteínas marcadoras mostraron que las pequeñas ML contenían dominios tipo-raft/caveolas, y las abundantes MP dominios no-raft, principalmente derivados de la membrana plasmática, mientras las MEP eran ricas en membranas intracelulares. Consistente con su rol como precursoras de esfingolípidos con VLCPUFA, especies de Cer con n-V y h-V se hallaron más concentradas en las MEP. Como se esperaba, las ML contenían GPL y SM con AG saturados, mientras las MP eran ricas en GPL con PUFA y SM con VLCPUFA. Llamativamente, tal vez debido a la alta insaturación de esos ácidos grasos, la relación colesterol/fosfolípidos fue más alta en las MP que en las ML. Con el avance de la diferenciación, el contenido de Cer con VLCPUFA, especialmente h-V Cer, tendió a aumentar en las MP de las CG en el sentido EP→ER→ET. En el mismo sentido, mientras los ácidos grasos de los lípidos de ML no variaron, en los de las MP las relaciones 22:5n-6/20:4n-6 en GPL y h-V/n-V en SM y en Cer aumentaron en forma altamente significativa. En la segunda parte, se determinó la expresión de enzimas que se espera jueguen un papel en la biosíntesis de los n-V y los h-V de SM y Cer. El foco estuvo puesto en la Elovl4 y la Fa2h, con la hipótesis, basada en lo que habían mostrado los lípidos, de que sus expresiones aumentarían con el desarrollo postnatal en el testículo y que, en las CG de animales adultos, variarían en sentidos opuestos, la primera disminuyendo y la segunda aumentando con la diferenciación. Seis de los 7 miembros de la familia de genes Elovl, se expresaron a nivel ARNm en CG. Los genes Elovl5 y Elovl2 se incluyeron en el estudio por codificar elongasas cuya actividad parcialmente se superpone, colaborando en la biosíntesis de PUFA, y porque Elovl2 es esencial en la formación de PUFA de 24 carbonos que sirven de sustrato a la Elovl4. Contrario a lo esperado, el nivel de ARNm de Elovl4 se halló elevado en testículos que virtualmente carecían de CG (y de SM o Cer con n-V), como lo fueron los de animales en edades infantiles (P14) y los de adultos (P90) que habían sido despojados de CG por exposiciones repetidas a episodios de hipertermia. Esta aparente inconsistencia se debió a que el nivel de ARNm de Elovl4 fue inesperadamente alto en las SC. Con la maduración sexual, los niveles de Elovl4-ARNm en el testículo decrecieron hasta la adultez, para permanecer luego relativamente constantes. Entre las células espermatogénicas del adulto, los contenidos más altos de este ARNm aparecieron en las ET y en los CR. En contraste con Elovl4, Fa2h no se expresó como ARNm en el testículo hasta la edad de aparición de las ER (P26), y sus niveles aumentaron con el crecimiento y la diferenciación celular. Como proteínas, ni Elovl4 ni Fa2h se expresaron en las SC. Elovl4 estuvo más concentrada en EP que en ER, en las que mostró una localización perinuclear. En el citoplasma de las ET apareció concentrada en pequeñas estructuras esféricas que podrían ser CR en formación. Como proteína, Fa2h se encontró especialmente concentrada en las ET, asociada a una estructura supranuclear que juega un rol importante en dar la forma definitiva a la cabeza de los futuros espermatozoides. Elovl4 y Fa2h no se detectaron en las gametas liberadas desde el epitelio seminífero. La actividad combinada de las elongasas en estudio (Elovl5, Elovl2 y Elovl4) se evaluó comparando las conversiones sufridas por el [3H]20:4n-6 en cultivos de EP, ER y ET, así como de SC. Este PUFA fue elongado en las cuatro poblaciones celulares a [3H]22:4 y [3H]24:4, y estos productos fueron activamente desaturados a [3H]22:5 y [3H]24:5. Como se esperaba, se encontraron n-V tetraenoicos y pentaenoicos marcados con [3H] de 26 y hasta 32 carbonos sólo en las CG. La actividad de elongación de PUFA decreció en el sentido EP→ER→ET. En la tercera parte, con la hipótesis de que las CG serían capaces de producir sus propios esfingolípidos, investigamos cómo espermatocitos y espermátidas biosintetizan Cer, SM y GlcCer, y cómo dicha actividad, así como la expresión de los genes de las correspondientes sintasas, cambian con la diferenciación. Paralelamente evaluamos la posibilidad de que la biosíntesis y/o la expresión génica estuvieran afectadas por la testosterona (Tes) y por factores solubles liberados desde las SC. Empleando como precursor al [3H]16:0 y dos inhibidores específicos de la ruta biosintética de novo (Lcicloserina y fumonisina B1) hallamos que las CG, aisladas y en cultivo, son capaces de biosintetizar sus propias Cer y SM, incluyendo sus especies moleculares con VLCPUFA, además de GlcCer. Estas actividades biosintéticas fueron máximas en los EP, disminuyendo con la diferenciación (EP>>ER). La Tes estimuló la biosíntesis de [3H]SM sólo en las ER. La suplementación con el medio condicionado obtenido de cultivos de SC (MCS) estimuló significativamente la formación de [3H]Cer tanto en EP como en ER, la de [3H]SM sólo en ER, y la de [3H]GlcCer sólo en EP. La Tes y el MCS incrementaron a todas las especies moleculares de Cer y de SM, incluyendo las n-V. En comparación con el MCS sólo, la combinación Tes+MCS promovió significativamente la biosíntesis de [3H]SM en los EP, mientras la redujo en las ER, en las cuales incrementó la marcación de [3H]Cer y de [3H]GlcCer. El estímulo sobre la marcación de Cer y SM fue específico para las [3H]n-V Cer y [3H]n-V SM. El significativo fomento que sobre la biosíntesis de novo ejerció el MCS indica que factores solubles (o transportados en microvesículas) provenientes de las SC (incluyendo tal vez distintas formas de ARN), juegan un rol en promover, en las CG, la biosíntesis de esfingolípidos destinados a sus membranas. En esta tercera parte de la tesis también se investigó la expresión a nivel ARNm de genes que codifican para cuatro sintasas (S) clave implicadas en la biosíntesis de SL (CerS3, SMS1, SMS2, y GlcCerS), de tres elongasas de ácidos grasos (Elovl5, Elovl2 y Elovl4), y de Fa2h. Se encontró que los niveles de ARNm de CerS3 fueron máximos en EP y los de SMS2 máximos en ER, ambos disminuyendo en las ET. Los de GlcCerS disminuyeron menos que éstos con la diferenciación, y los de SMS1 no variaron. Los cuatro ARNm también aparecieron en los CR. Mientras CerS3 no se expresó en las SC, los ARNm de las demás sintasas se encontraron en ellas, aunque en cantidades menores que en las CG. En la última parte de esta sección se estudiaron, en las células espermatogénicas totales, los efectos de la Tes, del MCS, y de Tes+MCS sobre los niveles de ARNm de las enzimas mencionadas. Las expresiones como ARNm de Elovl2 y Elovl4 mostraron ser reguladas por el MCS, las de SMS2 y Elovl5 por MCS y Tes, y la de Fa2h sólo por Tes. La Tes y el MCS, tanto por separado como combinados, no afectaron los niveles de ARNm de CerS3, SMS1, o GlcCerS, mientras tendieron a reducir los de SMS2. La presencia de Tes no afectó el ARNm de Elovl2 ni el de Elovl4, mientras tendió a aumentar el de Elovl5. El MCS, por su parte, redujo significativamente los ARNm de las tres elongasas. Cuando Tes y MCS se combinaron, el ARNm de Elovl5 aumentó, y los de Elovl2 y Elovl4 continuaron bajos, recapitulando la influencia de Tes y del MCS, respectivamente. El efecto más significativo de la Tes, tanto sola como combinada con el MCS, fue el de estimular la expresión de Fa2h. Tomados en conjunto, estos resultados muestran por primera vez que factores que juegan roles fisiológicos en la espermatogénesis, como lo son la testosterona y moléculas liberadas desde las células de Sertoli, son capaces de estimular la biosíntesis de novo de esfingolípidos en las células espermatogénicas y de regular, en algunos casos a la alta y en otros a la baja, la expresión génica de algunas de las enzimas responsables de dicha biosíntesis. / The overall objective of this work was to contribute to the knowledge of the physiology of the male reproductive system by examining how molecular species of sphingolipids that are specific of spermatogenic cells (or germ cells, GC) change with the progress of sexual maturation and cell differentiation. The focus was on the sphingomyelins (SM) and ceramides (Cer) having polyunsaturated fatty acids (PUFA) with very long chains (VLCPUFA), which occur in their non-hydroxy (n-V) and 2-hydroxy (h-V) forms and have up to 32 carbon atoms in rat GC. The specific aims were i) to investigate how these molecular species distribute among the GC membranes, ii) to determine how the expression of genes that code for the enzymes responsible for the biosynthesis of n-V and h-V changes with testis maturation and GC differentiation; iii) to ascertain whether isolated GC are able to biosynthesize these species of Cer and SM among others through the de novo pathway and to express the corresponding synthases, and iv) to inquire into endocrine and/or paracrine factors that are capable of modulating such an activity and/or expression. The effects of development were studied in testes at specific postnatal ages, and those of differentiation in GC populations at the stages of pachytene spermatocytes (PtS), round spermatids (RS), and elongated or late spermatids (LS) that were isolated from the total cells (TC) of the seminiferous epithelium of adult rats. In some analyses the residual bodies (RB) and the Sertoli cells (SC) were included. The GC populations were isolated using continuous gradients of albumin. The studies that required separation, isolation, and identification of lipid classes and molecular species were performed using chromatographic techniques of high resolution and sensitivity. The investigations about biosynthesis of n-V and of sphingolipids (SL) were done in GC maintained in primary culture by following the biological transformations of radioactive substrates. Gene expression at the mRNA level was compared by applying quantitative PCR, and at the protein level it was evaluated using Western blot followed by immunolabeling with antibodies, and in tissue sections by immunofluorescence microscopy. In the first part of the thesis the localization and distribution of glycerophospholipids (GPL), cholesterol, and SM among membrane fractions obtained from PtS, RS, and LS were compared. The focus was on the lateral distribution of the molecular species of SM and Cer with VLCPUFA between membrane fractions containing raft-like and non-raft domains, with the hypothesis that these species would be excluded from the former. Using TC preparations, initially we compared two methods, originally designed to study the lateral separation of proteins in membranes, in order to decide which one would be most suitable to evaluate the lateral distribution of lipids. The classic method that uses detergent at low temperature to obtain fractions rich in raft-like domains showed poor recuperation of lipid and protein, incomplete separation of lipids between membrane fractions, interference of the detergent in lipid analyses, and partial hydrolysis of GPL and SM. A method that employs sucrose gradients to separate membrane fractions from total homogenates (TH) on the basis of their densities was preferred, as it allows separation of light, heavy, and extra-heavy membrane fractions (LM, HM, and EHM, respectively) and an even heavier fraction in the pellet or sediment of homogenization. The recovery of lipid phosphorus and protein amounted, in average, to an 85% of that originally present in the TH. Protein markers showed that the small LM fractions contained raft-like/caveolae domains, and that the abundant HM had non-raft domains, mostly derived from cell plasma membranes, whereas the EHM were rich in intracellular membranes. Consistent with their role as precursors of sphingolipids with VLCPUFA, Cer species with n-V and h-V were found most concentrated in EHM. As expected, the LH contained GPL and SM with saturated fatty acids, whereas the HM fractions were rich in GPL with PUFA and SM with VLCPUFA. Interestingly, perhaps because of the high unsaturation of these fatty acids, the cholesterol/phospholipid ratio was higher in HM than in LH. The content of Cer with VLCPUFA, especially h-V Cer, tended to increase in the MP of GC with the progress of differentiation in the direction PtS→RS→LS. In the same direction, the fatty acids of LH lipids did not vary, while in those of MP the 22:5n-6/20:4n-6 ratio in GPL and the h-V/n-V ratio in SM and Cer increased in a highly significant form. In the second part, the expression of enzymes that are expected to play a role in the biosynthesis of the n-V and h-V of SM and Cer was determined. The focus was placed on Elovl4 and Fa2h, on the hypothesis, based on what lipids had shown, that their expressions would increase in testes with postnatal development and that, in adult animal GC, their expressions would vary in opposite directions, the former decreasing and the latter increasing with cell differentiation. Six of the 7 members of the Elovl gene family were expressed at the mRNA level in GC. The Elovl5 and Elovl2 genes were included in the survey as they code for elongases with partially overlapping activities, collaborating in the biosynthesis of PUFA, and because Elovl2 is essential in the formation of the 24 carbons PUFA that serve as substrates to Elovl4. Against our expectations, the Elovl4 mRNA level was found high in testes virtually lacking GC (and SM or Cer with n-V), as were those of animals in infantile ages (P14) and those of adults that had been deprived of their GC by repeated exposures to episodes of hyperthermia. This apparent inconsistency was due to the fact that the mRNA level of Elovl4 was unexpectedly high in SC. With sexual maturation, the Elovl4-mRNA levels in testes decreased up to adulthood, then remaining relatively constant. Among adult spermatogenic cells, the highest content of this mRNA appeared in LS and RB. In contrast with Elovl4, Fa2h did not express itself as mRNA in testes until the appearance of RS (P26), and their levels increased with cell growth and differentiation. As proteins, Elovl4 and Fa2h were not expressed in SC. Elovl4 showed a perinuclear localization, was more concentrated in PtS than in RS, and then appeared concentrated in small spherical structures in LS cytoplasm, which could be RB in formation. As a protein, Fa2h was found mainly concentrated in LS, associated to a supranuclear structure that plays an important role in giving the final shape to the heads of the sperm cells to-be. Elovl4 and Fa2h were not detected in the gametes released from the seminiferous epithelium. The combined activity of the elongases under study (Elovl5, Elovl2 and Elovl4) was evaluated by comparing the conversions undergone by [3H]20:4n-6 in cultures of PtS, RS and LS, as well as of SC. In the four cell populations this PUFA was elongated to [3H]22:4 and [3H]24:4, and these products were actively desaturated to [3H]22:5 and [3H]24:5. As expected, [3H]-labeled tetraenoic and pentaenoic n-V having 26 to 32 carbons were found only in GC. The activity of PUFA elongation decreased in the direction PtS→RS→LS. In the third part, with the hypothesis that GC would be able to produce their own SL, we investigated how spermatocytes and spermatids biosynthesize Cer, SM and GlcCer, and how such an activity, as well as the expression of genes of the corresponding synthases, would change with cell differentiation. In parallel we evaluated the possibility that biosynthesis and/or gene expression would be affected by testosterone (Tes) and by soluble factors released from SC. Employing [3H]16:0 as precursor and two specific inhibitors of the de novo biosynthetic pathway (L-cycloserine and fumonisin B1), we found that GC, isolated and in culture, are able to biosynthesize their own Cer and SM, including their molecular species with VLCPUFA, and also GlcCer. These biosynthetic activities were maximal in PtS, decreasing with differentiation (PtS>>RS). Tes stimulated the biosynthesis of [3H]SM, only in RS. Supplementation with the conditioned medium obtained from SC cultures (CMS), significantly stimulated the formation of [3H]Cer in PtS and RS, that of [3H]SM only in RS, and that of [3H]GlcCer only in PtS. All the molecular species of Cer and SM were increased by Tes and CMS, including the n-V. In comparison with CMS, the combination Tes+CMS significantly promoted the biosynthesis of [3H]SM in PtS, while reducing it in ER, in which cells it increased the labeling of [3H]Cer y de [3H]GlcCer. The stimuli on Cer and SM labeling was specific on the [3H]n-V Cer and [3H]n-V SM. The significant enhancement that CMS exerted on the de novo biosynthesis indicates that factors that are soluble (or transported in microvesicles) coming from SC (perhaps including different forms of RNA), play a role in promoting in CG the biosynthesis of SL destined to their membranes. In this third part of the thesis we also evaluated the expression, at the mRNA level, of genes that code for four key sinthases (S) involved in the biosynthesis of SL (CerS3, SMS1, SMS2, and GlcCerS), of three fatty acid elongases (Elovl5, Elovl2 y Elovl4), and of Fa2h. We found that the mRNA levels of CerS3 were maximal in PtS and those of SMS2 maximal in RS, while both decreased in LS. Those of GlcCerS varied less than these with differentiation and those of SMS1 did not vary. The four mRNA also appeared in RB. Whereas CerS3 was not expressed in SC, the mRNA of the other synthases was, although in lesser amounts than in GC. In the last part of this section the effects of Tes, CMS, and Tes+CMS on the mRNA levels of the above-mentioned enzymes were studied in total spermatogenic cells. The expressions as mRNA of Elovl2 and Elovl4 were regulated by CMS, those of SMS2 and Elovl5 by CMS and Tes, and that of Fa2h only by Tes. Tes and CMS, either separately or in combination, did not affect the mRNA levels of CerS3, SMS1, or GlcCerS, while tended to reduce those of SMS2. The presence of Tes did not affect the mRNA of Elovl2 or Elovl4, while tended to increase those of Elovl5. The CMS reduced significantly the mRNA levels of the three elongases. When Tes and CMS were together, the mRNA of Elovl5 increased, and those of Elovl2 and Elovl4 continued low, recapitulating the influence of Tes and CMS, respectively. The most significant effect of Tes, either alone or combined with CMS, was to stimulate the expression of Fa2h. Taken together, these results show for the first time that factors that play physiological roles in spermatogenesis, as testosterone and molecules released from Sertoli cells do, are able to stimulate the de novo biosynthesis of sphingolipids in spermatogenic cells, and to regulate, in some cases positively and in others negatively, the gene expression of some of the enzymes responsible for such biosynthesis.

En los tejidos de mamífero los glicerofosfolípidos (GPL) se presentan en tres subclases dependiendo de si la cadena hidrofóbica que se une a la posición sn-1 del esqueleto de glicerol es un ácido graso, un alcohol graso, o un aldehído graso unidos a través de una unión éster, 1-O-alquil-éter, o 1-alc-1’enil-éter, respectivamente, estando la posición sn-2 ocupada por un ácido graso (las subclases fosfatidil-, plasmanil- o plasmenil- de GPL respectivamente). En la clase triglicéridos (TG) es posible encontrar subclases similares: los bien conocidos triacilgliceroles (TAG), con tres ácidos grasos esterificados al glicerol, y los TG con una unión éter (TUE), esto es, un alcohol graso o un aldehído graso en la posición sn-1 del glicerol y ácidos grasos en las posiciones sn-2 y sn-3 del glicerol (1-O-alquil- y 1-O-alc-1’-enil-, 2,3-diacil-sngliceroles, aquí abreviados como alquil-DAG y alquenil-DAG, respectivamente). En general es escaso y fragmentario el conocimiento actual sobre las características de las subclases individuales de GPL y de TG, y cómo se relacionan entre sí en células y tejidos animales, especialmente en lo que concierne a los TUE. El objetivo de este trabajo de tesis fue el de reunir información sobre la bioquímica de estas subclases, abarcando aspectos de su contenido y composición en distintas áreas del sistema reproductor masculino. Tomando a la rata como modelo, en el testículo y en el epidídimo se estudiaron los cambios de estas subclases durante el desarrollo postnatal y, en el adulto, los efectos que sobre ellas produce el estrés térmico. En espermatozoides se determinó la distribución entre la cabeza y la cola de las subclases de GPL, y los efectos que sobre estas últimas ejercen la capacitación y la reacción acrosomal inducidas in vitro. Durante el desarrollo postnatal, en el testículo aumentaron los contenidos de todas las subclases de GPL de colina y de etanolamina (CGP y EGP, respectivamente), que se enriquecieron en ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) de 20 y 24 carbonos. En función de la edad postnatal, en ellas disminuyó la proporción de ácido araquidónico (20:4n-6) y aumentó notoriamente la de ácido docosapentaenoico (22:5n-6). En el adulto los dos plasmalógenos, en especial la plasmeniletanolamina, fueron muy ricos en 22:5n-6. Un cambio en el mismo sentido se produjo durante la diferenciación celular desde espermatocitos en paquiteno a espermátidas redondas, con una relación entre 22:5n-6 y 20:4n-6 cercana a 1 en fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina, y muy superior a 1 en los correspondientes plasmalógenos, en especial plasmeniletanolamina. Ambas células espermatogénicas contuvieron los 1-O-alquil GPL plasmanilcolina y plasmaniletanolamina, la primera potencial precursora del lípido bioactivo PAF y la segunda precursora de la abundante plasmeniletanolamina. Los TUE sufrieron incrementos en su concentración por gramo de tejido en dos etapas clave de la primera onda de espermatogénesis: los días postnatales 21 y 45 (PN 21 y PN45), en los que se sabe que un número importante de los primeros espermatocitos primarios y de las primeras espermátidas, respectivamente, mueren por apoptosis. La exposición transitoria e intermitente de los testículos a la hipertermia (15 min a 43 ºC, una vez por día durante 5 días consecutivos) llevó a la pérdida selectiva de espermatocitos primarios y espermátidas jóvenes durante las primeras 1-2 semanas después del tratamiento, recomenzando luego la espermatogénesis a partir de las espermatogonias supervivientes. En este lapso, disminuyeron tanto las células como sus subclases lipídicas características, recuperándose ambas luego con la recuperación de la espermatogénesis. Las especies de los GPL de colina y de etanolamina ricas en 20:4n-6 reaparecieron antes que las ricas en 22:5n-6, a semejanza de lo que ocurrió en el desarrollo normal, pues primero reaparecieron los espermatocitos y luego las espermátidas. Durante las primeras semanas posttratamiento, cuando los túbulos seminíferos exhibieron una gran pérdida de células germinales con supervivencia de las células de Sertoli, sobre todo en la primera y segunda semanas, los niveles de TAG y de TUE, así como de ésteres de colesterol, aumentaron varias veces, para volver a disminuir luego. Atribuimos este aumento transitorio a la actividad fagocítica de las células de Sertoli. En el tejido epididimal normal del animal adulto estuvieron presentes las tres subclases de GPL. Con respecto a los lípidos neutros, además de grandes cantidades de TAG, se hallaron las dos subclases de TUE, alquil-DAG y alquenil-DAG, en cantidades mayores que el tejido testicular. En ambos tejidos los primeros predominaron sobre los segundos. Otra diferencia notable fue que en los lípidos del tejido epididimal coexistieron PUFA de 20 y 22 carbonos de las series n-6 (20:4n-6, 22:5n-6) y n-9 (22:3n-9, 22:4n-9). Al día postnatal 30, aún con escasa diferenciación y sin espermatozoides en sus conductos, el epidídimo contenía niveles de plasmeniletanolamina con niveles de PUFA n-9 más altos que las demás subclases. Con el avance del desarrollo, estos PUFA se incrementaron en las demás subclases, primero en la fosfatidilcolina (P49- P55) y luego en la plasmanil y en la plasmenicolina (P55-adultez). Por su parte los TUE epididimales se incrementaron notablemente el día posnatal 49, en coincidencia con el hecho de que poco antes (P45) había llegado a su lumen una oleada transitoria de células germinales desde el testículo, que en pocos días fueron reemplazadas por los primeros espermatozoides. Dado que los espermatozoides de rata se enriquecen progresivamente en plasmenilcolina con 22:4n-9 a medida que maduran en el epidídimo, esperábamos encontrarla en mayor concentración en alguno de los segmentos epididimales. Sin embargo, en las tres regiones epididimales el porcentaje de plasmeniletanolamina fue mayor que el de plasmenilcolina. La pequeña región del corpus fue la que exhibió la más alta concentración (μg por gramo de tejido) de plasmeniletanolamina y de su precursora la plasmaniletanolamina, además de alquil-DAG y alquenil-DAG, todos ellos ricos en PUFA n-9. La plasmeniletanolamina del corpus podría ser la precursora de la plasmenilcolina y ésta ser transferida a los espermatozoides en tránsito. Los mecanismos involucrados deben aún establecerse. Los efectos de la hipertermia sobre el epidídimo fueron muy distintos de los descritos en el testículo. Los conductos epididimales se vaciaron progresivamente de los espermatozoides que contenían inicialmente en el lapso de unas seis semanas posttratamiento, lo que concordó con el hecho de que los lípidos epididimales se empobrecieron en 22:5n-6 y que la plasmenicolina con 22:4n-9 de la cauda disminuyó. Sin embargo, los niveles de fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina, y los correspondientes plasmalógenos, sobre todo en el caput se incrementaron sobre los niveles de los controles no tratados durante el mismo período. Llamativamente, los contenidos por gramo de tejido, tanto alquenil-DAG como alquil- DAG, se incrementaron agudamente en las tres regiones del epidídimo (caput, corpus, cauda) durante la primera semana post-hipertermia, y habían bajado nuevamente a la semana 2, con una divergencia interesante: en el caso de las especies con PUFA n-6, continuaron bajando, pero en el caso de las especies con 18:1n-9 y PUFA n-9 del caput, volvieron a incrementarse hacia la semana 6. Dado que el tejido testicular en este momento (día 42 post-hipertermia) estaba en vías de recuperación, este incremento podría reflejar una reacción celular específica de las células epididimales. Entre estas, merecen investigarse algunas células del sistema mononuclear fagocítico (células dendríticas, macrófagos), que están normalmente presentes en el compartimiento basal del epitelio epididimal, especialmente en el segmento inicial del caput. En el animal adulto en condiciones fisiológicas, la expresión (mRNA) de la alquilgliceronafosfato sintasa (AGPS), una enzima peroxisomal clave involucrada en la síntesis de lípidos con uniones éteres, fue significativamente menor en el testículo que en el epidídimo. En este último, la AGPS se expresó más activamente en el corpus que en caput y en éste más que en la cauda. Esto demostró la importancia de los dos primeros segmentos del epidídimo en la biosíntesis de lípidos con uniones éteres. Inmediatamente después del último de los 5 episodios de hipertermia aplicados, en el testículo se detuvo temporariamente la expresión de AGPS, mientras que en el epidídimo no. En contraste, a la semana 2 post-hipertermia el nivel de mRNA de la enzima en el testículo se había recuperado, mientras en el epidídimo se había reducido, tanto en el caput como en el corpus. Estos resultados sugieren que en el epidídimo la presencia de espermatozoides en el lumen es importante para que las enzimas involucradas en la biosíntesis de lípidos con una unión éter se expresen en las células del epitelio. En la primera parte del tercer capítulo se determinó la distribución entre la cabeza y la cola espermáticas de las subclases de los GPL de colina y de etanolamina. Un hallazgo original fue que la cabeza espermática, pese a su pequeño tamaño, concentró una proporción mayor de la plasmenilcolina total rica en 22:4n-9 que la cola. La cola a su vez contuvo más fosfatidiletanolamina rica en 20:4n-6 y 22:5n-6 y fosfatidilcolina rica en 22:5n-6, que la cabeza. Llamó la atención además que la cola contuviera plasmanilcolina y plasmaniletanolamina muy ricas en PUFA n-6. En la segunda parte de este capítulo se investigó la participación de las cuatro subclases principales de GPL del espermatozoide en la capacitación y la reacción acrosomal. Con respecto a controles no incubados, se produjeron hidrólisis de GPL de intensidad creciente en el siguiente orden: controles incubados sin agregados, gametas capacitadas, y gametas capacitadas que sufrieron la reacción acrosomal. Tal hidrólisis fue selectiva, pues afectó con intensidad creciente, en ese mismo orden, a las subclases fosfatidilcolina y fosfatidietanolamina. Por lo tanto estos eventos, importantes para la función de los espermatozoides, resultaron en un enriquecimiento relativo de las gametas en plasmalógenos. Los resultados de esta tesis abrieron nuevos interrogantes que serán objeto de futuros estudios sobre el rol biológico, propiedades, biosíntesis y catabolismo de los GPL y TG con una unión éter en células del tracto reproductor. / In mammalian tissues, glycerophospholipids (GPL) occur in three subclasses, depending on whether the hydrophobic chain that is linked to the sn-1 position of the glycerol backbone is an ester-bound fatty acid, an ether-bound fatty alcohol, or an alkenyl-ether-bound fatty aldehyde, the sn-2 position being occupied by a fatty acid (the phosphatidyl-, plasmanyl- or plasmenyl- GPL subclasses, respectively). In the class of triglycerides (TG), it is possible to find similar subclasses: the well-known triacylglycerols (TAG), with three fatty acids ester-bound to glycerol, and the etherlinked triglycerides (EL-TG), namely TG with a fatty acohol or a fatty aldehyde at the sn-1 position of glycerol, and fatty acids at the sn-2 and sn-3 positions (1-O-alky- or 1- O-alk-1’-enyl-, 2,3-diacyl-sn-glycerols, here abbreviated as alkyl-DAG and alkenyl- DAG, respectively). The knowledge about the characteristics of GPL and TG subclasses and their possible metabolic relationships in animal tissues and cells is at present scarce and fragmentary, especially regarding the EL-TG. The aim of this work was to gather information about the biochemistry of these subclasses, covering aspects of their levels and composition in different areas of the male reproductive system. Taking the rat as a model, in the testis and the epididymis the changes in these subclasses were studied during the postnatal development and, in the adult, the effects induced by heat stress. In spermatozoa, the distribution between head and tail of GPL subclasses, and the effects on the latter of the in vitro-induced capacitation and acrosome reaction were investigated. During postnatal development, the testicular content of all subclasses of choline and ethanolamine glycerophospholipids (CGP and EGP, respectively) increased, with a concomitant enrichment in 20 to 24 carbon atom polyunsaturated fatty acids (PUFA). As the postnatal age increased, in all of them the proportion of arachidonic acid (20:4n- 6) was reduced while that of docosapentaenoic acid (22:5n-6) increased. In adulthood the two plasmalogens, especially plasmenylethanolamine, were very rich in 22:5n-6. Similar increases in the percentage of 22:5n-6 was observed during pachytene spermatocytes differentiation into round spermatids, the 22:5n-6/20:4n-6 ratio being nearly 1:1 in phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine and a significantly higher ratio in the corresponding plasmalogens, especially plasmenylethanolamine. Both spermatogenic cells contained the 1-O-alkyl-GPL, plasmanylcholine and plasmanylethanolamine, the former being the potential precursor of the bioactive lipid PAF and the latter the metabolic precursor of plasmenylethanolamine. The EL-TG showed increases in their concentration per gram of tissue in two key stages of the first wave of spermatogenesis, postnatal days 21 and 45 (PN21 and PN45), when a considerable number of the first pachytene spermatocytes and the first round spermatids, respectively, are known to die by apoptosis. Transient and intermittent exposures of testicular tissue to hyperthermia (15 minutes to 43ºC, once a day during five consequently days) resulted in the selective loss of pachytene spermatocytes and early spermatids during the first 1-2 weeks after treatment, spermatogenesis restarting from the surviving spermatogonia afterwards. During this period, the numbers of germ cells and their characteristic lipids decreased, both increasing again with the recovery of spermatogenesis. The 20:4n-6-rich species of choline and ethanolamine GPL reappeared before those rich in 22:5n-6, just as it occurred during normal development, as spermatocytes reappeared before spermatids. During the first weeks post-treatment, when seminiferous tubules exhibited a profound loss of virtually all germ cell types with survival of Sertoli cells, the levels of TAG and TUE, and also of cholesterol esters, increased several fold, to decrease again afterwards. This transient accumulation was attributed to the phagocytic activity of Sertoli cells. In the epididymal tissue of adult rats, the three GPL subclasses were present. Regarding neutral lipids, in addition to large amounts of TAG, alkyl-DAG and alkenyl- DAG were found in significantly larger amounts than in testes. In both tissues, alkyl- DAG predominated over alkenyl DAG. Another notable difference with testes was that in epididymal lipids PUFA with 20 and 22 carbons of the n-6 series (20:4n-6, 22:5n-6) coexisted with PUFA of the n-9 series (22:3n-9, 22:4n-9). At postnatal day 30, in a scarcely differentiated epithelium and with no spermatozoa in its ducts, the epididymis contained higher levels of n-9 PUFA in plasmenylethanolamine than other subclasses. With the progress of development, these PUFA were increased in other subclasses, first in phosphatidylcholine (PN49 to 55) and then in plasmanyl- and plasmenylcholine (PN55 to adulthood). Regarding epididymal EL-TG, their levels increased significantly at PN49, coinciding with the fact that shortly before (PN45) a transient wave of germ cells from the testes had reached the epididymal tubules, being then replaced by the first spermatozoa. Because rat spermatozoa become progressively rich in plasmenylcholine with 22:4n-9 as they mature during their epididymal transit, we expected to find a greater concentration of this lipid in one of the epididymal segments, caput, corpus or cauda. However, in all the three regions the percentage of plasmenylethanolamine was higher than that of plasmenylcholine. The small corpus region was the one to exhibit the highest concentration (μg per gram of tissue) of plasmenylethanolamine and of its precursor, plasmanylethanolamine, in addition to alkyl-DAG and alkenyl-DAG, all of them rich in PUFA n-9. This suggested that the corpus plasmenyletanolamine could play a role as a precursor of the plasmenylcholine to be transferred to spermatozoa in transit. The possible mechanisms involved in these events are jet to be established. The effects of hyperthermia on the epididymis were very different from those described in the testis. The epididymal ducts progressively lost most of the spermatozoa that were originally present in their lumena in six weeks post-treatment, which agreed with the fact that epididymal lipids were depleted of 22:5n-6 and that 22:4n-6-rich plasmenycholine from cauda also decreased. However, the levels of phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, and the corresponding plasmalogens of the caput region showed a significant buildup during the same period. Interestingly, the content per gram of tissue of alkyl-DAG and alkenyl-DAG increased sharply in the three epididymal regions (caput, corpus, cauda) during the first week post-hyperthermia and had decreased again at week 2, with an interesting divergence: in the case of species with n-6 PUFA, they continued to decline, but in the case of species with 18:1n-9 and n-9 PUFA from the caput region, they increased again by week six post treatment. Since the testicular tissue at this time (day 42 posthyperthermia) was still recovering, this increase could reflect a specific cellular response of the epididymal cells. Among these, the role of some cells of the mononuclear phagocytic system (dendritic cells, macrophages), which are normally present in the basal compartment of the epididymal epithelium, is worth investigating. In the adult animal in physiological conditions, the expression (mRNA) of alkylglycerone phosphate synthase (AGPS), a key peroxisomal enzyme involved in the synthesis of ether-linked lipids, was significantly lower in the testis than the epididymis. In the latter, AGPS was more actively expressed in the corpus than the caput, and in the latter the expression was greater than in the cauda. These findings demonstrated the importance of the first two epididymal segments in the biosynthesis of lipids with an ether linkage. Immediately after the last of the 5 episodes of hyperthermia, the mRNA expression significantly decreased in the testis, whereas in the epididymis remained unchanged. By contrast, at week 2 post-hyperthermia the level of mRNA of the enzyme in the testes had recovered, while in the caput and corpus epididymal segments was reduced. These results suggest that in the epididymis the presence of spermatozoa in the lumen is important for the enzymes involved in ether lipid biosynthesis to be expressed in the epithelial cells. In the first part of the third chapter, distribution between the sperm head and the sperm tail of CGP and EGP was determined. A novel finding was that, despite its small size, the head concentrated more of the total 22:4n-9-rich plasmenylcholine than the tail. The tail, in turn, contained more n-6 PUFA-rich phosphatidylethanolamine and phosphatidylcholine than the head. Remarkably, the sperm tail also contained n-6- PUFA-rich plasmanylcholine and plasmanylethanolamine. In the second part of this chapter, the involvement of the four major subclasses of sperm GPL in sperm capacitation and the acrosomal reaction was investigated. Compared to non-incubated controls, GPL hydrolysis of increasing intensity occurred in the following order: controls incubated with no additions, capacitated sperm, and capacitated sperm that had undergone the acrosomal reaction. Such hydrolysis was selective, as it increasingly affected, in that same order, the phosphatidyldholine and phosphatidylethanolamine subclasses. Thus these events, important for the function of spermatozoa, resulted in a relative enrichment in plasmalogens of the gametes. The results in this thesis opened new questions that will be the subject of future research on the biological role, properties, biosynthesis and catabolism of the GPL and TG with an ether bound in the reproductive tract cells.

Aisla células germinales testiculares de Vicugna pacos, las caracteriza morfológicamente y detecta a nivel transcripcional la expresión de biomarcadores específicos para células madre espermatogoniales en tejido gonadal durante el desarrollo testicular posnatal. Los testículos fueron colectados en estancias alpaqueras de Ayacucho y Huancavelica (Aprox. 4,200 m.s.n.m.) y en el Matadero Municipal de Huancavelica (Aprox. 3,600 m.s.n.m.). La biometría testicular, el aislamiento de espermatogonias y la determinación de viabilidad y rendimiento, así como la citometría de flujo, se hicieron a partir de muestras frescas. Para la extracción de RNA por el método del fenol/cloroformo, los testículos fueron previamente obtenidos por castración del animal vivo, transportados en nitrógeno líquido a -196°C y almacenados en ultracongelación a -80°C.Se diseñaron primers con el Programa Oligo6, a partir de exones rescatados y RNA ensamblados para alpaca, tomando como base los exones codificantes de cada uno de los biomarcadores encontrados en el genoma de Bos taurus, los mismos que fueron sintetizados por Macrogen (Corea del Sur) y utilizados para amplificar el cDNA de alpaca. La viabilidad y el rendimiento fueron superiores enalpacas de 10-12 meses de edad, con valores de 92.15% y 55 x 106 espermatogonias/ml, respectivamente. Las espermatogonias de alpaca tuvieron un diámetro promedio de 16 , las células germinales de alpaca mostraron reactividad frente al conjugado del fluorocromo isotiocianato de fluoresceína con la aglutinina de Dolichos biflorus. A partir de siete biomarcadores positivos para SSC seleccionados (Zbtb16, GFR -1, Stra8, Nanos2, Ngn3, Lin28 y Ecad), tres negativos (Ckit, Sohlh1 y Sohlh2) y tres genes de referencia (Rplp0, Gadph y Actb), se lograron detectar Nanos2, Lin28, Ckit, RPLP0 y Actb en tejido testicular de alpaca. Se concluye que la edad más apropiada para aislar espermatogonias, caracterizarlas morfológicamente y detectar biomarcadores específicos de SSC en alpaca, es de 10-12 meses. / Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Determina la participación de la proteína ADAM17 en la muerte de células germinales masculinas meióticas y post-meióticas inducida por shock térmico y etopósido, la cual cobra mayor importancia en la salud pública de la sociedad moderna debido al incremento a la exposición cotidiana a altas temperaturas en los testículos, así como tratamientos con medicamentos contra el cáncer. Con la finalidad de establecer una relación con los seres humanos y lograr extrapolar los resultados, emplea un modelo animal, el ratón. Para ello se cuenta con individuos machos de ratón de 21 días de edad para cada grupo a evaluar, de los genotipos salvaje, heterocigoto y Knock-out para la metaloproteasa ADAM17 en células germinales meióticas y post-meióticas. Intentado simular una exposición aguda a altas temperaturas como a tratamiento con etopósido. Con los resultados de este trabajo se espera aportar información científica en este problema de salud pública que aún no está resuelto. / Tesis