L’altération génétique et/ou fonctionnelle de p53 est très répondue dans les cancers humains et est répertoriée dans plus d’un cas sur deux. Les traitements et molécules utilisés en chimiothérapie anticancéreuse induisent pour la plupart l’apoptose dépendante de p53 ce qui confère une résistance particulière aux tumeurs p53 déficientes. Nous avons développé des techniques se basant sur la vidéomicroscopie à haut débit et l’utilisation de cellules fluorescentesTP53+/+ et TP53-/- pour mettre en évidence des agents chimiques qui ciblent les cellules p53 déficientes. Nous avons identifié SP600125, un inhibiteur de kinases dont MPS1, Aurora A et Aurora B, et qui tue préférentiellement les cellules tumorales TP53-/- . Cette cytotoxicité sélective a été confirmée sur de nombreux modèles de cellules déficientes en p53 in vitro et in vivo sur des xénogreffes TP53+/+ et TP53-/- injectés à des souris nudes. Nous avons utilisé une autre molécule qui a un spectre d’inhibition semblable à SP600125, la reversine, et nous avons aussi trouvé qu’elle a une cytotoxicité sélective envers les cellules p53 déficientes.L’analyse vidéomicroscopique des cellules traitées nous révèle que la mort préférentielle des cellules P53 déficientes est intimement liée à un mécanisme de polyploïdisation. En effet, les cellules TP53-/- (contrairement à celles TP53+/+) traitées effectuent des mitoses aberrantes sans karyokinèse ni cytokinèse qui ne sont pas contrôlées par un arrêt du cycle cellulaire. Ces cellules succombent par catastrophe mitotique après activation de la voie mitochondriale de l’apoptose.Cette observation concorde avec le fait que l’inhibition des protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 sensibilise les cellules traitées alors que l’inhibition des protéines BAX, APAF-1 et les caspases protège les cellules TP53-/- de l’effet cytotoxique de SP600125 et la reversine.Ces résultats nous permettent d’envisager ces drogues (ou dérivées) dans la prévention des cas de tumeurs pré malignes et/ou dans le traitement des cas de cancers p53 déficients. / The genetic and/or functional alterations of p53 are highly prevalent in cancer and are reported for more than a half of all human cancers. Classic chemotherapy leads p53 mediated apoptosis conferring a drug resistance for p53 deficient cells. We developed in the laboratory a technique based on high-content videomicroscopy and fluorescent TP53+/+ and TP53-/- cells for the screening of molecules that targets p53 deficient cells. We discovered that SP600125, a kinase inhibitor, including MPS1, Aurora A and Aurora B, kills p53-deficient cells more efficiently than their p53-proficient counterparts. This selective cytotoxicity was confirmed in vivo in mice carrying p53-deficient and -proficient human xenografts. Than after we used an another inhibitor with a similar broad-spectrum kinase, reversine, and we found that this molecule have a selective toxicity for TP53-/- cells and this result was confirmed in vitro for both molecule.Videomicroscopy-based cell fate profiling revealed that the p53-deficient cell death is coupled to hyperploïdy mechanism. Indeed, TP53-/- (but not TP53+/+) undergo successive round of abortive mitosis and failed to arrest the cell cycle in response to treatment and cells became polyploidy and progressively succumbed to mitochondrial apoptosis. In line with this notion, the depletion of anti-apoptotic proteins of the BCL-2 family sensitized TP53-/- cells to the toxic effects of SP600125 and reversine. Moreover, the knockdown of BAX or APAF-1, as well as the chemical inhibition of caspases, limited the death of TP53-/- cells.Hence, SP600125 or reversine (and its analogues/derivatives) might be used for cancer chemoprevention (for eliminating pre-malignant cells that have inactivated p53) or chemotherapy of p53-deficient cancers.

L'intégrité de paroi cellulaire est cruciale pour la survie du champignon pendant son cycle de développement ou en réaction à des conditions de stress. Chez la levure, les voies de signalisation de MAP kinase, Slt2, et calcineurin, régulent la réparation de paroi cellulaire. MPS1, l'orthologue de SLT2, chez Magnaporthe grisea est essentiel pour la réparation de la paroi cellulaire et pour la pénétration de l'appressorium (Xu, et al., 1998). Chez la levure, Slt2 active les facteurs de transcription Rlm1, Swi4 et Swi6, alors que le calcineurin active Crz1. Par ailleurs, PaIdc1 a un rôle dans la localisation nucléaire de PaMpk1 (orthologue de Slt2 et Mps1). (Corinne Jamet-Vierny, et al., 2007). MgIDC1, Le gène orthologue de PaIDC1 a été, de même, identifié chez M. grisea. ScAGS1 (α-glucan synthase), est un composant principal de la paroi principal des champignons. CaCAS5, est un régulateur transcriptionel, régule plusieurs gènes de la paroi cellulaire et ScKnr4 est impliqué dans la régulation de l'activité de 1,3--glucan synthase et la formation de la paroi cellulaire Ces gènes ont été identifiés chez M. grisea et des mutants de délétion ont été construits par le remplacement de gène chez M. grisea. Les mutants Guy11ΔKU80Δmps1 et Guy11ΔKU80Δidc1 montrent une forte réduction de mycélium aérien. Guy11ΔKU80Δmps1, Guy11ΔKU80Δrlm1 et Guy11ΔKU80Δswi4 ont une très forte réduction de sporulation. Guy11ΔKU80Δmps1, Guy11ΔKU80Δrlm1 et Guy11ΔKU80Δcrz1 ont une forte réduction de pouvoir pathogène. De plus, les mutants Guy11ΔKU80Δmps1 et Guy11ΔKU80Δswi4 sont inhibé, de 100% en présence d'un mélange de l'Aculéacine et Nikkomycine à faible dose (DI20). Les résultats montrent que chez M. grisea, il existe deux voies impliquées dans l'intégrité de la paroi cellulaire. La voie MAPK MPS1, qui régule les facteurs de transcription Rlm1, Swi4, Swi6 et la voie de Calcineurine, qui régule Crz1. D'après les analyses, SWI4 est impliquée dans la régulation des gènes de glucan synthases et chitine synthase, quand RLM1 n'est impliqué que dans la régulation des gènes de chitine synthase. Dans la voie de Calcineurine, CRZ1 contrôle les gènes de chitine synthase aussi. Ces études suggèrent que les facteurs de transcription qui sont régulés par Mps1 et Calcineurine sont spécialisés dans la régulation des gènes de cible spécifiques à l'intégrité et la réparation de la paroi cellulaire. / The cell wall integrity is crucial for the survival of fungi during its development or in reaction in stress conditions. In yeast, the MAP kinase pathway Slt2, and the calcineurin pathway are responsible of the cell wall repair. MPS1, the orthologous of SLT2, in Magnaporthe grisea is essential for the repair of the cell wall and the penetration of the appressorium (Xu, and Al, 1998). In yeast, Slt2 activates the transcription factors Rlm1, Swi4 and Swi6, whereas the calcineurin activates Crz1. In addition, PaIdc1 has a role in the nuclear localization of PaMpk1 (orthologous of Slt2 and Mps1). (Corinne Jamet-Vierny, and Al, 2007), in Podospora anserina. MgIDC1, the gene orthologous of PaIDC1 , likewise, was identified in M. grisea. ScAGS1 (α- glucan synthase), is the principal component of the wall of fungi. CaCAS5, is a transcriptional regulator, controls several genes of the cell wall and ScKnr4 is implied in the regulation of the activity of 1,3-- glucan synthase and the formation of the cell wall These genes was identified at M. grisea and deletion mutants were obtained by the gene replacement in M. grisea. Mutants Guy11ΔKU80Δmps1 and Guy11ΔKU80Δidc1 show a strong reduction of mycelium. Guy11ΔKU80Δmps1, Guy11ΔKU80Δrlm1 and Guy11ΔKU80Δswi4 have a very strong reduction of sporulation. Guy11ΔKU80Δmps1, Guy11ΔKU80Δrlm1 and Guy11ΔKU80Δcrz1 have a strong reduction of pathogenicity. Moreover, mutants Guy11ΔKU80Δmps1 and Guy11ΔKU80Δswi4 are 100% inhibited, in presence of a mixture of Aculéacine and Nikkomycine with low dose (DI20). The results show that in M. grisea, there are two pathways implied in the cell wall integrity. The MAPK pathway Mps1, which controls the tr anscription factors Rlm1, Swi4, Swi6 and the calcineurin pathway, which controls the transcription factor, Crz1. According to this study, SWI4 is implied in the regulation of glucan synthases and chitin synthase genes, when RLM1 is implied only in the regulation of chitin synthase genes. In the calcineurin pathway, CRZ1 controls chitin synthase genes. These studies suggest that the factors of transcription which are controlled by Mps1 and Calcineurin are specialized in the regulation of target genes, specific to the cell wall integrity and cell wall repair.

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L'intégrité de paroi cellulaire est cruciale pour la survie du champignon pendant son cycle de développement ou en réaction à des conditions de stress. Chez la levure, les voies de signalisation de MAP kinase, Slt2, et calcineurin, régulent la réparation de paroi cellulaire. MPS1, l'orthologue de SLT2, chez Magnaporthe grisea est essentiel pour la réparation de la paroi cellulaire et pour la pénétration de l'appressorium (Xu, et al., 1998). Chez la levure, Slt2 active les facteurs de transcription Rlm1, Swi4 et Swi6, alors que le calcineurin active Crz1. Par ailleurs, PaIdc1 a un rôle dans la localisation nucléaire de PaMpk1 (orthologue de Slt2 et Mps1). (Corinne Jamet-Vierny, et al., 2007). MgIDC1, Le gène orthologue de PaIDC1 a été, de même, identifié chez M. grisea. ScAGS1 (α-glucan synthase), est un composant principal de la paroi principal des champignons. CaCAS5, est un régulateur transcriptionel, régule plusieurs gènes de la paroi cellulaire et ScKnr4 est impliqué dans la régulation de l'activité de 1,3--glucan synthase et la formation de la paroi cellulaire Ces gènes ont été identifiés chez M. grisea et des mutants de délétion ont été construits par le remplacement de gène chez M. grisea. Les mutants Guy11ΔKU80Δmps1 et Guy11ΔKU80Δidc1 montrent une forte réduction de mycélium aérien. Guy11ΔKU80Δmps1, Guy11ΔKU80Δrlm1 et Guy11ΔKU80Δswi4 ont une très forte réduction de sporulation. Guy11ΔKU80Δmps1, Guy11ΔKU80Δrlm1 et Guy11ΔKU80Δcrz1 ont une forte réduction de pouvoir pathogène. De plus, les mutants Guy11ΔKU80Δmps1 et Guy11ΔKU80Δswi4 sont inhibé, de 100% en présence d'un mélange de l'Aculéacine et Nikkomycine à faible dose (DI20). Les résultats montrent que chez M. grisea, il existe deux voies impliquées dans l'intégrité de la paroi cellulaire. La voie MAPK MPS1, qui régule les facteurs de transcription Rlm1, Swi4, Swi6 et la voie de Calcineurine, qui régule Crz1. D'après les analyses, SWI4 est impliquée dans la régulation des gènes de glucan synthases et chitine synthase, quand RLM1 n'est impliqué que dans la régulation des gènes de chitine synthase. Dans la voie de Calcineurine, CRZ1 contrôle les gènes de chitine synthase aussi. Ces études suggèrent que les facteurs de transcription qui sont régulés par Mps1 et Calcineurine sont spécialisés dans la régulation des gènes de cible spécifiques à l'intégrité et la réparation de la paroi cellulaire.

During mitosis, accurate chromosome segregation is essential: gain or loss of genetic information can be detrimental to cell viability, or promote tumourigenesis. The mitotic checkpoint (also known as the spindle assembly checkpoint or SAC) ensures accurate chromosome segregation by delaying cell cycle progression until accuracy can be guaranteed. Mps1 is a protein kinase that is crucial for mitotic checkpoint signalling and also for proper chromosome alignment at metaphase. However, the precise role of Mps1’s catalytic activity is still unclear. Here, I present AZ3146, a novel small molecule inhibitor of Mps1. AZ3146 inhibits recombinant Mps1 in vitro with an IC50 of ~35 nM, and has low activity against a panel of 50 kinases, suggesting a reasonable degree of selectivity. As predicted for an Mps1 inhibitor, AZ1346 treatment led to spindle checkpoint malfunction in cells, accelerated mitotic timing, and perturbed the kinetochore localisation of the checkpoint effector Mad2. AZ3146 has a negative effect on cell viability, suggesting it leads to detrimental missegregations. Thus, the cellular effects of AZ3146 are consistent with Mps1 inhibition, and I was able to use the compound confidently as a tool to further probe the role of Mps1 activity in cells.Strikingly, levels of Mps1 increased at unattached kinetochores following inhibition of its kinase activity, suggesting Mps1’s kinetochore localisation is regulated by its own activity. A kinase-dead GFP-Mps1 fusion protein only accumulated at kinetochores in the absence of endogenous, active Mps1, implicating intra-molecular interactions in regulation of Mps1’s kinetochore localisation. I confirm a role for Mps1 in the mechanism of chromosome alignment, but in contrast to previous reports I did not detect a decrease in Aurora B activity following Mps1 inhibition. On the contrary, both Mps1’s phosphorylation status and its kinetochore localisation were affected by treatment with the Aurora B inhibitor ZM447439, placing Mps1 downstream of Aurora B. As an alternative explanation for the alignment defect in cells with reduced Mps1 activity, I found that levels of the plus-end directed kinesin Cenp-E were markedly decreased at unaligned kinetochores. I propose a model in which catalytically active Mps1’s auto-release from kinetochores simultaneously promotes both mitotic checkpoint signalling and chromosome alignment by facilitating Mad2 dimerisation and Cenp-E binding at unattached kinetochores.

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Mps1 est une protéine kinase à double spécificité impliquée dans le point de contrôle du fuseau mitotique et l'alignement des chromosomes. L'augmentation de l'activité de Mps1 est corrélée avec une augmentation de son niveau de phosphorylation lors de l'entrée en mitose. Cependant, les mécanismes contrôlant cette activation sont inconnus. Nous avons donc cherché à identifier les sites de phosphorylation de Mps1 afin d'étudier leur contribution à la régulation de Mps1. Par spectrométrie de masse, nous avons identifié jusqu'à 27 sites, et nous avons choisi de mutagéniser 11 d'entre eux individuellement en acides aminés non-phosphorylables (alanine), sur la base de leur conservation entre la protéine humaine et de xenope. Nous montrons que trois de ces sites de phosphorylation (S283, T697 et T707) sont essentiels pour l'activité kinase de Mps1, et pour son rôle dans le checkpoint mitotique. Deux de ces sites (T697 et T707) sont localisés dans la boucle d'activation du domaine kinase de Mps1 et sont des sites d'autophosphorylation. La phosphorylation sur le troisième site (S283) requiert une autre kinase. S283 est localisée dans le domaine non-catalytique de Mps1 qui est peu caractérisé et est impliqué dans le recrutement de Mps1 au kinétochore. Nous montrons par immunofluorescence que l'absence de phosphate sur le site S283 ne perturbe pas significativement le recrutement de Mad2 au kinétochore. Enfin, en utilisant des inhibiteurs et l'anticorps spécifique de la phosphorylation du site S283 que nous avons développé, nous montrons que le site S283 est phosphorylé en mitose par CDK, suggérant que les fonctions de Mps1 qui sont spécifiques de la mitose soient régulées par une phosphorylation dépendante des CDKs. / Mps1 is a dual-specificity protein kinase involved in the spindle assembly checkpoint and chromosome alignment. Mps1 phosphorylation state and activity increase in mitosis. However, the regulatory mechanisms underlying these observations are unknown. We therefore sought to identify Mps1 phosphorylation sites and to study their contribution to Mps1 regulation. By mass spectrometry we identified up to 27 phosphorylation sites on Mps1. We chose 11 sites that were conserved between Xenopus and human Mps1, and constructed 11 non-phosphorylatable single point mutants. We show that three phosphorylation sites (S283, T697 and T707) are essential for the kinase activity and the checkpoint signalling function of Mps1. Two of these sites (T697 and T707) are located in the activation loop of Mps1 kinase domain and are autophosphorylation sites. Phosphorylation on the third site (S283) results from the activity of an upstream kinase. S283 is located in the less characterized non-catalytic domain that is responsible for the kinetochore localization of Mps1. By immunofuorescence we show that the absence of the phosphate at S283 does not significantly perturb the kinetochore recruitment of the spindle assembly checkpoint component Mad2. Finally, using inhibitors and our developed phosphospecific antibody we demonstrate that Mps1 is phosphorylated at S283 in mitosis by cyclin-dependent kinase (Cdk), suggesting that mitosis specific functions of Mps1 kinase are regulated by Cdk-dependent phosphorylation.

Nous avons étudié la voie MAPK Mps1/Slt2 du champignon pathogène du riz Magnaporthe Oryzae. Chez la levure, Slt2 active les facteurs de transcription Rlm1, Swi4 et Swi6. Nous avons identifié le gène orthologue de ScSWI4 chez M. oryzae et étudié les rôles de Mps1, Rlm1, Swi4 et Swi6 en comparant les phénotypes de leurs mutants nuls. Δmps1, Δswi4, Δswi6 ont le même défaut de mélanisation, tandis que Δmps1 et Δrlm1 sont déficients pour la sporulation. L'absence d'hyphes aériens et d'hydrophobicité du mycélium sont des phénotypes spécifiques de Δmps1, tandis qu'une réduction de croissance est associée spécifiquement à Δswi4 et Δswi6. Aucun de ces mutants ne présente une hypersensibilité aux enzymes de dégradation de la paroi (EDPs) et aux inhibiteurs de la paroi (aculeacine A, nikkomycin Z, calcofluor white : CFW). La pathogénie de Δswi4 est réduite, tandis que celle de Δswi6 est similaire à la souche sauvage. Δmps1 et Δrlm1 sont non pathogènes. La transcriptomique comparative de la souche sauvage, Δmps1, Δrlm1 et Δswi4 montre qu'il n'existe qu'un petit nombre de gènes sur- ou sous- exprimés chez ces mutants, le nombre maximal étant observée entre Δmps1 et Δswi4. Le gène AGS1 encodant l'alpha-1, 3-glucane synthase, une cible supposée de Mps1, n'est ni sur- ni sous-exprimé chez ces mutants. La souche sauvage et Δmps1 ont la même sensibilité aux EDPs et au CFW à pH6. Cependant, à pH5, la souche sauvage devient résistante aux EDPs et au CFW à pH6. Cependant, à pH5, la souche sauvage devient résistante aux EDPs et au CFW, tandis que Δmps1 perd cette résistance, suggérant qu'elle nécessite Mps1. Notre étude montre que la voie MAPK Mps1 joue un rôle important dans plusieurs processus biologiques de M. oryzae et précise quels sont les cibles / We have studied the Mps1/Slt2 MAPK signalling pathway in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. In yeast, Slt2 activates the transcription factors Rlm1, Swi4 and Swi6. We have identified the M. oryzae gene orthologous to ScSWI4 and studied the roles of Mps1, Rlm1, Swi4 and Swi6 in M. oryzae by comparing the phenotypes of their null mutants. Δmps1, Δswi4, Δswi6 displayed the same defects in melanisation, while Δmps1 and Δrlm1 are defective in sporulation. Loss of aerial hyphae formation and mycelium hydrophobicity are phenotypes specific of Δmps1, while reduced growth is a specific phenotype of Δswi4 and Δswi6. None of these mutants displayed an increased sensitivity against cell wall degrading enzymes (CWDEs) and cell wall inhibitors (aculeacine A, nikkomycin Z, calcofluor white : CFW). Pathogenicity was reduced in Δswi4, while Δswi6 was as pathogenic as WT. Δmps1 and Δrlm1 were non-pathogenic. Comparative transcriptomic of WT, Δmps1, Δrlm1 and Δswi4 highlighted only a limited number of genes up- and down-regulated in these mutants, with the largest number observed between Δmps1 and Δswi4. The alpha-1,3-glucan synthase encoding gene AGS1, a suggested Mps1 target, was not up- nor down-regulated in these mutants. WT and Δmps1 have a similar sensitivity to CWDE and CFW at pH6. However, at pH5, WT displays a resistance to CWDEs and CFW, while Δmps1 loses this pH5 induced resistance, suggesting it requires the Mps1 pathway. This work shows that Mps1 MAPK pathway has an important role in different M. oryzae biological processes and provides new insights on its transcriptional targets