Orientador: Anete Pereira de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T21:21:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Saraiva_AntonioMarcos_D.pdf: 12032714 bytes, checksum: 1262a05ca10735e855fa138a2093d04b (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A linhagem 9a5c da bactéria Xylella fastidiosa foi o primeiro fitopatógeno a ter seu genoma completamente sequenciado, o qual gerdu diversas informações sobre seu metabolismo e patogenicidade. Das orfs codificadas por esta bactéria, destaca-se; no presente trabalho, a XF0703, cuja proteína correlata (com 28,3 kDa) possui similaridade com proteínas SurE de várias outras bactérias. Proteínas SurEs são nucleotidases que desfosforilam diversos nucleosideos monofosforilados para seus respectivos nucleosideos. Tal função é de fundamental importância para manter o pool balanceado dos quatro (deoxi)ribonucleosideos para síntese de DNA e RNA, respectivamente. Este trabalho descreve a clonagem da orfXF0703 no vetor pET29a, a expressão da proteína recombinante (XfSurE) em Escheríchia coli BL21(DE3) e a purificação da mesma por cromatografia de afinidade ao níquel. A análise da estrutura secundária foi feita por dicroísmo circular e realizou-se a determinação do estado oligomérico por cromatografia de gel filtração e espalhamento de luz a baixo ângulo (SAXS), os quais revelaram que a proteína é um tetrâmero. Dados de caracterização funcional indicam que a proteína possui maior atividade em pH neutro na presença do íon manganês como cofator, com uma maior afinidade pelo substrato 3'-AMP (K0,5=0,16 mM). Além disso, ensaios cinéticos mostram que a proteína possui um comportamento alostérico com alta cooperatividade positiva (coeficiente de Hill em torno de 2,6) com todos os quatro substratos naturais testados (3'-AMP, 5'-dAMP, 5'-AMP e 5-GMP). Experimentos com a técnica de SAXS permitiram calcular o raio de giro (32,7 ± 0.2 A), distância máxima intramolecular (100 A) e a simetria do envelope da molécula (222). A estrutura de diversas SurEs homólogas já cristalizadas foram superpostas ao envelope obtido, sendo que StSurE (SurE de Salmonella com maior idenjidade de aminoácidos) mostrou ter o melhor ajuste. No entanto, notou-se que havia espaços vazios no envelope de XfSurE e tais espaços podiam ser preenchidos a partir do afastamento das alças responsáveis pela tetramerização e pela rotação dos f dímeros. Estes movimentos (translação e rotação) podem explicar o comportamento alostérico da proteína, facilitando a entrada de substrato ao sítio catalítico da molécula. / Abstract: The 9a5c strain from bacterium Xylella fastidiosa was the first phytopathogen to have its genome completely sequenced, which revealed a lot of information about its metabolism and its pathogenicity. 'From a variety of orfs encoded by this bacterium, we highlight, in this work, the XF0703, which correlated protein (with 28.3 kDa) has similarity with SurE proteins from several other bacteria. The SurE proteins *are nucleotidases that dephosphorylate various monophosphorylated nucleosides to their respective nucleosides. This function is critical for maintaining the balanced pool of four (deoxy) ribonucleosides for DNA and RNA synthesis. In this work, we describes the cloning of the XF0703 orf into the vector pET29a, the recombinant protein overexpression (XfSurE) in Escherichia coli BL21(DE3) and the protein purification by nickel affinity chromatography. The secondary structure analysis was done by circular dichroism, while oligomeric state determination was achieved by gel filtration chromatography and small-angle X-ray light scattering (SAXS), which showed that the protein is a tetramer. Functional characterization data indicate that the protein has a highest activity at neutral pH in the presence of manganese as a cofactor, with a highest affinity for the 3-AMP substrate (K0,5 = 0,16 mM). Furthermore, kinetic tests showed that the protein has a allosteric behavior with a high positive cooperativity (Hill coefficient around 2.6) for all natural substrates screened (3-AMP, 5'-dAMP, 5'-AMP and 5'-GMP). Experiments with SAXS technique have allowed to calculate the radius of gyration (32.7 ± 0.2 A), maximum intramolecular distance (100 A) and molecule symmetry. / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-23Bitstream added on 2014-11-10T11:58:01Z : No. of bitstreams: 1 000786749_20150920.pdf: 227688 bytes, checksum: c800c0192a1f81b1c24ac20d93cf4f4c (MD5) Bitstreams deleted on 2015-09-21T13:18:45Z: 000786749_20150920.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-21T13:19:48Z : No. of bitstreams: 1 000786749.pdf: 1032630 bytes, checksum: 9ff7c0ae2515a60572247ae468fd531f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Peptidases são enzimas responsáveis por realizar a clivagem de ligações peptídicas de outras proteínas e peptídeos. Essas enzimas apresentam grande importância, pois são utilizadas em vários segmentos industriais, desde a indústria alimentícia até mesmo no processamento de couro e pele e formulações de medicamentos. Uma das principais aplicações das peptidases é nos laticínios, na produção de queijo, que inicialmente envolve a coagulação das caseínas do leite pela ação de enzimas proteolíticas coagulantes, sendo a renina a principal delas. Enzimas microbianas coagulantes de leite são peptidases aspárticas que catalisam a coagulação do leite, substituindo o coalho de vitelo. Em trabalhos anteriores foi isolado o fungo termofílico Thermomucor indicae-seudaticae N31 que produziu em fermentação em estado sólido (FES), uma peptidase com capacidade de hidrolisar a κ-caseína do leite e produzir coágulo de boa qualidade. Entretanto, sua caracterização funcional e especificidade de ação ainda não estão claras. Assim, neste estudo, deu-se continuidade à investigação de estrutura e ação desta enzima coagulante. Foi realizado o monitoramento da hidrólise enzimática da caseína por cromatografia líquida de alta eficiência, foi feita análise da especificidade primária da peptidase utilizando substrato de fluorescência da série Abz-LSFMAIQ-EDDnp e foi determinada a sequência primária da proteína por espectrometria de massas. O monitoramento da hidrólise enzimática da caseína por cromatografia líquida de alta eficiência mostrou que o perfil do extrato bruto de Thermomucor indicae-seudaticae N31 apresenta alta similaridade com as enzimas comerciais das marcas Bela-Vista e Chr-Hansen obtidas dos fungos Rhizomucor miehei e Aspergillus niger, respectivamente. A análise de especificidade primária da peptidase demonstrou alta especificidade e afinidade pelo substrato sintético. A determinação do ... / Peptidase enzymes are responsible for catalyze the cleavage of peptide bonds of other proteins. These enzymes present great importance, therefore, are used in several industrial segments, since the food industry even in the processing of leather and formulations of medicinal products. One major application of peptidases is in the dairy industry for cheese production, which initially involves clotting of milk caseins by the action of coagulant proteolytic enzymes being rennin the main one. Microbial rennet-like milk-clotting enzymes are aspartic proteinases that catalyze milk coagulation, substituting calf rennet. In previous study it was isolated a thermophilic fungus Thermomucor indicae-seudaticae N31 that produced on Solid State Fermentation (SSF), a peptidase with capacity to hydrolyses the k-casein of milk and produce good quality curd. However its functional characterization and specificity of action is not clear yet. Thus, in this study we continued the investigation of structure and action of this enzyme coagulant. Was carried out the monitoring of enzymatic hydrolysis of casein by high performance liquid chromatography-reverse phase, was analyzed the specificity of primary peptidase using substrate of fluorescence resonance energy transfer (FRET) peptide series Abz-LSFMAIQ-EDDnp and determined the primary sequence of the protein by mass spectrometry. Monitoring the enzymatic hydrolysis of casein by high performance liquid chromatography-reverse phase showed that the crude extract Thermomucor indicae-seudaticae N31 shows high similarity with commercial enzymes brands Bela-Vista and Chr-Hansen obtained from fungi Rhizomucor miehei and Aspergillus niger, respectively. The analysis of primary peptidase specificity demonstrated high specificity and affinity for the synthetic substrate. The determination of the cleavage site showed 46% hydrolysis of the bond between the amino acids phenylalanine and methionine and 54% between alanine ...

Orientador: Roberto da Silva / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Gustavo Orlando Bonilla Rodríguez / Resumo: Peptidases são enzimas responsáveis por realizar a clivagem de ligações peptídicas de outras proteínas e peptídeos. Essas enzimas apresentam grande importância, pois são utilizadas em vários segmentos industriais, desde a indústria alimentícia até mesmo no processamento de couro e pele e formulações de medicamentos. Uma das principais aplicações das peptidases é nos laticínios, na produção de queijo, que inicialmente envolve a coagulação das caseínas do leite pela ação de enzimas proteolíticas coagulantes, sendo a renina a principal delas. Enzimas microbianas coagulantes de leite são peptidases aspárticas que catalisam a coagulação do leite, substituindo o coalho de vitelo. Em trabalhos anteriores foi isolado o fungo termofílico Thermomucor indicae-seudaticae N31 que produziu em fermentação em estado sólido (FES), uma peptidase com capacidade de hidrolisar a κ-caseína do leite e produzir coágulo de boa qualidade. Entretanto, sua caracterização funcional e especificidade de ação ainda não estão claras. Assim, neste estudo, deu-se continuidade à investigação de estrutura e ação desta enzima coagulante. Foi realizado o monitoramento da hidrólise enzimática da caseína por cromatografia líquida de alta eficiência, foi feita análise da especificidade primária da peptidase utilizando substrato de fluorescência da série Abz-LSFMAIQ-EDDnp e foi determinada a sequência primária da proteína por espectrometria de massas. O monitoramento da hidrólise enzimática da caseína por cromatografia líquida de alta eficiência mostrou que o perfil do extrato bruto de Thermomucor indicae-seudaticae N31 apresenta alta similaridade com as enzimas comerciais das marcas Bela-Vista e Chr-Hansen obtidas dos fungos Rhizomucor miehei e Aspergillus niger, respectivamente. A análise de especificidade primária da peptidase demonstrou alta especificidade e afinidade pelo substrato sintético. A determinação do ... / Abstract: Peptidase enzymes are responsible for catalyze the cleavage of peptide bonds of other proteins. These enzymes present great importance, therefore, are used in several industrial segments, since the food industry even in the processing of leather and formulations of medicinal products. One major application of peptidases is in the dairy industry for cheese production, which initially involves clotting of milk caseins by the action of coagulant proteolytic enzymes being rennin the main one. Microbial rennet-like milk-clotting enzymes are aspartic proteinases that catalyze milk coagulation, substituting calf rennet. In previous study it was isolated a thermophilic fungus Thermomucor indicae-seudaticae N31 that produced on Solid State Fermentation (SSF), a peptidase with capacity to hydrolyses the k-casein of milk and produce good quality curd. However its functional characterization and specificity of action is not clear yet. Thus, in this study we continued the investigation of structure and action of this enzyme coagulant. Was carried out the monitoring of enzymatic hydrolysis of casein by high performance liquid chromatography-reverse phase, was analyzed the specificity of primary peptidase using substrate of fluorescence resonance energy transfer (FRET) peptide series Abz-LSFMAIQ-EDDnp and determined the primary sequence of the protein by mass spectrometry. Monitoring the enzymatic hydrolysis of casein by high performance liquid chromatography-reverse phase showed that the crude extract Thermomucor indicae-seudaticae N31 shows high similarity with commercial enzymes brands Bela-Vista and Chr-Hansen obtained from fungi Rhizomucor miehei and Aspergillus niger, respectively. The analysis of primary peptidase specificity demonstrated high specificity and affinity for the synthetic substrate. The determination of the cleavage site showed 46% hydrolysis of the bond between the amino acids phenylalanine and methionine and 54% between alanine ... / Mestre