Les molécules du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH) jouent un rôle crucial dans la régulation des réponses immunitaires. Il existe trois familles de molécules présentatrices d'Ag : les molécules du CMH de classe I et II et les molécules CD1qui possèdent la particularité de présenter des lipides et des glycolipides. Parmi ces molécules, CD1a est exprimée de façon variable à la surface des cellules dendritiques. L'objectif de mon travail de thèse a été de déterminer les mécanismes de régulation de l'expression de la molécule CD1a sur les cellules dendritiques humaines. Ce travail a donc permis de montrer que la régulation de CD1a par CD99, au sein des cellules dendritiques, implique l'activation de la voie de signalisation de p38 MAPK, ainsi que de la voie de l'AMPc conduisant à la phosphorylation constitutive des facteurs de transcription ATF-2 et CREB-1. La forme courte de CD99 est, quant à elle, requise pour obtenir une inhibition de la voie de signalisation induite par la forme longue de CD99. La différentiation in vitro de monocytes en cellules dendritiques est caractérisée par un " switch " de l'expression de CD99. Son absence conduit à la génération de cellules dendritiques CD1a négatives. Mon travail a également permis de démontrer l'implication des voies de l'AMPc et p38 dans la génération de ces deux sous populations de cellules. Cette étude suggère fortement un rôle pour CD99 dans la régulation de la différenciation des monocytes en différents sous types de cellules dendritiques.

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Introduction. L’encéphalopathie hépatique (HE) est une complication commune mais sévère des insuffisances hépatiques. La physiopathologie de l’HE provient essentiellement de l’ammoniac dérivé du métabolisme des bactéries intestinales. Le traitement standard pour les patients qui subissent des épisodes manifestes d’HE est le lactulose mais son observance est faible du fait d’effets secondaires inconfortables. La rifaximine est un candidat potentiel mais il n’y a pas de données issues d’essais cliniques suffisamment robustes pour supporter sa seule utilisation. Les traitements anti-fibrotiques sont une autre piste de traitement dans le sens où s’il est possible de prévenir l’avancement de la défaillance hépatique il est alors possible de diminuer la probabilité et la sévérité des épisodes. Deux études indépendantes ont été réalisées dans un modèle de ligature de la voie biliaire, la première étude pour évaluer l’efficacité de traitements thérapeutiques de l’HE (lactulose et rifaximine) utilisés seuls ou en combinaison pour réduire le taux d’ammoniac et améliorer le statut de l’HE; et la seconde étude, pour évaluer des traitements utilisés individuellement pour prévenir l’établissement de la fibrose (acide obéticholique, rapamycine, pirfénidone, acide ursodésoxycholique). Matériel et méthodes. Les deux projets utilisent un modèle murin de ligature de la voie biliaire. Pour l’évaluation de la rifaximine, trois semaines après la chirurgie, les animaux sont séparés en cinq groupes en fonction du traitement reçu quotidiennement et du modèle : SHAM-VEH, pour les animaux ayant subi un simulacre de chirurgie de ligature de la voie biliaire (SHAM) et traité par le véhicule (VEH); BDL-VEH, pour les animaux ayant subi la chirurgie de ligature de la voie biliaire et traité par le véhicule; BDL-RIF, pour les animaux traités par la rifaximine (RIF); BDL-LAC, pour les animaux traités par le lactulose (LAC); BDL-LAC+RIF, pour les animaux traités par le lactulose et la rifaximin (LAC+RIF). Pour l’évaluation des composés anti-fibrotiques, une semaine après la chirurgie, les animaux sont séparés en six groupes en fonction du traitement reçu quotidiennement et du modèle : SHAM-VEH; BDL-VEH; BDL-OCA pour les animaux traités par l’obéticholique acide (OCA); BDL-RPM, pour les animaux traités par la rapamycine (RPM); BDL-UDCA, pour les animaux traités par l’acide ursodésoxycholique (UDCA); BDL-PFN pour les animaux traités par la pirfenidone (PFN). Les animaux sont alors évalués au cours du modèle pour leur survie, leur consommation de nourriture et leur poids. Les paramètres biochimiques de la fonction hépatiques sont évalués en fin de modèle. Plus particulièrement, le projet sur les composés anti-fibrotiques comprend une analyse plus approfondie de la fibrose par histologie avec établissement du score MÉTAVIR et par mesure du contenu hépatique en hydroxyproline. Le projet rifaximine comprend des analyses comportementales pour évaluer l’HE mais également une mesure de l’œdème cérébral. Résultats. Pour le projet rifaximine, aucun des deux composés testés (i.e. rifaximin et lactulose) seuls ou combinaison n’ont pas eu d’effets bénéfiques globaux en termes de survie, de croissance, de consommation de nourriture, de tests comportementaux, d’œdème cérébral, de paramètres biochimiques incluant l’ammoniac. Aucun des traitements pris séparément ou en combinaison n’a montré d’efficacité pour le traitement de l’HE. Pour le projet des composés anti-fibrotiques, certains composés ont entrainé une mortalité plus élevée. Aucune différence entre les traitements ne fut observée en termes de croissance, de consommation de nourriture, de paramètres biochimiques, d’histologie et de contenu en hydroxyproline. Conclusions. Globalement, l’étude sur la rifaximine ne présente pas de résultats suffisamment concluants pour recommander l’utilisation de la rifaximine en remplacement ou en concomitance avec le lactulose. L’étude sur les composés anti-fibrotiques ne permet pas de mettre en évidence un composé capable de limiter la progression de la fibrose. / Introduction. Hepatic encephalopathy (HE) is a major but common complication of liver failures diseases. The physiopathology of HE mainly involves intestinal bacteria metabolism derived ammonia. The golden standard for patients who experience overt episodes of HE is lactulose but its observance is poor due to uncomfortable side effects. On the other hand, Rifaximin is a potent candidate but there is a lack of relevant data from clinical trials to support its sole use. Antifibrotic drugs are another category of treatment that can be useful in the setting of HE since it can prevent the onset of cirrhosis and thus of the liver failure, this can decrease the appearance and severity of the episodes. The aim of this study is to evaluate in a murine model of bile duct ligation the efficiency of therapeutic treatments (lactulose and rifaximin) alone or in combination to decrease blood ammonia and ameliorate HE status; and of prophylactic treatments (obeticholic acid, rapamycin, pirfenidone, ursodeoxycholic acid) individually to prevent the onset of fibrosis. Materials and methods. The two projects used a murine model of bile duct ligation. For the evaluation of the efficiency of rifaximin, three weeks after surgery, the animals were sorted into five groups according to the treatment they received daily and according to the model : SHAM-VEH, for animals that underwent a mock surgery (SHAM) and were treated with vehicle (VEH); BDL-VEH, for animals that underwent a bile duct ligation surgery (BDL) and were treated with vehicle; BDL-RIF, for animals that were treated with rifaximin (RIF); BDLLAC, for animals that were treated with lactulose (LAC); BDL-LAC+RIF for animals that were treated with lactulose and rifaximin (LAC+RIF);. For the evaluation of the effect of antifibrotic drugs, one week after surgery, the animals were sorted into six groups according to the treatment they received daily and according to the model : SHAM-VEH, BDL-VEH, BDL-OCA for animals that were treated with obeticholic acid (OCA); BDL-RPM, for animals that were treated with rapamycine (RPM); BDL-UDCA, for animals that were treated with ursodeoxycholic acid (UDCA); BDL-PFN, for animals that were treated with pirfenidone (PFN). All animals were evaluated during the model for survival, food consumption and growth. The biological parameters of the liver function were evaluated at the end of the model. More specifically, this project includes a deeper analysis on fibrosis through histological analysis with establishment of the METAVIR score and measure of the content on hydroxyproline. The rifaximin project includes behavioural analysis to evaluate the HE status and measurement of cerebral edema. Results. Concerning the rifaximin project, no difference can be established between the treatments in term of survival, growth, food consumption, behavioural tests, cerebral edema, biochemistry parameters including ammonia. No treatment, taken alone or in combination, showed efficacy to treat HE. Concerning the antifibrotic drug study, some compounds have shown an increase in mortality, although no difference can be observed on growth, food consumption, biochemistry parameters, histology or hydroxyproline content. Conclusions. Overall, the study on rifaximin does not present strong and conclusive results on the sole use of rifaximin. According to the study on the antifibrotic drugs, no compounds show evidence of prevention of the onset of the fibrosis.

Contexte: L'encéphalopathie hépatique (EH) est une complication majeure de la maladie hépatique chronique (MHC) caractérisée par des symptômes débilitants, notamment des troubles cognitifs, psychiatriques et moteurs. Il est cru que l’EH, définie comme étant un syndrome métabolique, disparaît après une transplantation hépatique (TH). Cependant, des complications neurologiques persistantes ont été signalées chez jusqu'à 47 % des receveurs de TH. Plusieurs études rétrospectives ont démontré une association entre des antécédents d'épisodes d'EH pré-TH et une mauvaise condition neurologique après la TH. D’autre part, l’alcool est un facteur étiologique fréquent à l’origine de la MHC. Cependant, une consommation excessive d’alcool a également un impact sur le cerveau. À ce jour, l’impact des épisodes d’EH ainsi que de l’alcool sur le développement de l’EH et l’intégrité cérébrale reste indéfini. Par conséquent, nos objectifs étaient 1) d’évaluer l'impact de plusieurs épisodes d’EH (induits par l'ammoniac) et 2) d'évaluer l'effet d'une consommation constante d'alcool sur le déclin neurologique, l'intégrité et les lésions cérébrales chez les rats atteints de MHC induite par la ligature des voies biliaires (LVB). Méthodes: Pour le premier objectif, des rats LVB ont reçu une injection (s.c.) d'acétate d'ammonium (LVB-Ammoniac), précipitant un épisode sévère d'EH réversible (perte du réflexe de redressement) tous les 4 jours à partir de la semaine 3 post-chirurgie LVB ( total ; 4 épisodes). Des rats SHAM ont également reçu une injection d'ammoniaque et des rats témoins BDL/SHAM ont reçu une injection de solution saline. La coordination motrice (rotarod) et la mémoire à court et à long-terme (test de reconnaissance d'objets nouveaux) ont été évaluées une semaine après la dernière injection. Pour évaluer l'intégrité neuronale, une analyse d’immunobuvardage de type Western et d’immunofluorescence a été réalisée dans le cortex frontal, le cervelet et l'hippocampe. Pour le deuxième objectif, des rats LVB ont reçu de l'alcool (LVB-Alcool) deux fois par jour (51 % v/v, dose de 3 g/kg, par gavage) pendant 4 semaines. Les rats SHAM ont également reçu de l'alcool et les rats LVB/SHAM servant de contrôles ont reçu une solution saline. La coordination motrice (rotarod) et le comportement anxieux (champ ouvert et labyrinthe surélevé) ont été évalués une semaine après la dernière administration d'alcool. Des analyses d’immunobuvardage de type Western et d’immunofluorescence ont été effectuées pour étudier l'intégrité neuronale du cortex frontal et du cervelet. Résultats: Chez les LVB-Ammoniac, des niveaux protéiques plus élevés d’un marqueur astrocytaire (GFAP) et apoptotique (caspase-3 et Bax/Bcl2) ont été trouvés dans l'hippocampe, alors que les niveaux de marqueurs neuronaux (NeuN et SMI311) ont été réduits par rapport à tous les autres groupes expérimentaux. Les rats LVB-Ammoniac ont présenté des niveaux accrus de stress oxydatif plasmatique par rapport aux rats SHAM/BDL respectifs. Une diminution des niveaux de capacité antioxydante totale (CAT) et une augmentation des protéines modifiées par le 4-HNE ont été observées dans l'hippocampe (et non dans le cortex frontal ou le cervelet) du groupe LVB-Ammoniac par rapport aux rats SHAM/BDL respectifs. Les résultats d'immunofluorescence ont révélé la colocalisation du marqueur apoptotique (caspase-3 clivée) avec un marqueur neuronal (NeuN) dans la région CA1 de l'hippocampe des rats LVB-Ammoniac. Chez les rats LVB-alcool, il a été démontré une altération de la coordination motrice aux semaines 2, 3, 4 et 5 ainsi qu'une augmentation du comportement anxieux par rapport aux rats SHAM respectifs. Chez les rats BDL-alcool, il a été démontré une diminution des marqueurs neuronaux (NeuN et SMI311), une augmentation de l'activité enzymatique apoptotique (caspase-3 clivée), une augmentation des marqueurs de nécroptose (pRIP3 et pMLKL), une diminution de la CAT et une augmentation des protéines modifiées par 4-HNE dans le cervelet par rapport à tous les groupes. Les résultats d'immunofluorescence ont révélé la colocalisation du marqueur apoptotique (caspase-3 clivée) et du marqueur de nécroptose (pMLKL) dans les neurones de la couche granulaire du cervelet de rats LVB-alcool. Conclusion: De multiples épisodes d'EH sévère ont entraîné une perte de cellules neuronales dans l'hippocampe des rats LVB et qui est associée à une augmentation du stress oxydatif, à l'apoptose et à une diminution des cellules neuronales. Des niveaux élevés du marqueur astrocytaire (GFAP) dans l'hippocampe insinuent une gliose, pouvant être le résultat d'une perte neuronale. De plus, l'administration d'alcool aggrave les troubles de la coordination chez les rats LVB et qui ont été associés à une augmentation du stress oxydatif, à une diminution des marqueurs neuronaux (NeuN et SMI311) avec l’apoptose et la nécroptose dans le cervelet des rats LVB-alcool. Globalement, de multiples épisodes d’EH sévère ainsi qu'une consommation constante d'alcool, via le stress oxydatif, déclenchent une perte/lésion neuronale qui entraînera par conséquent une mauvaise condition neurologique après la TH. / Background: Hepatic encephalopathy (HE) is a major complication of chronic liver disease (CLD) characterized by debilitating symptoms, including cognitive, psychiatric, and motor disturbances. HE, defined as a metabolic syndrome, is believed to resolve following liver transplantation (LT). However, persisting neurological complications have been reported in up to 47% of LT recipients. Several retrospective studies have demonstrated an association between a history of HE episodes pre-LT and poor neurological outcome following LT. Furthermore, alcohol is a common etiological factor which causes CLD. However, excessive alcohol consumption also impacts the brain. To date, the impact of HE episodes as well as of alcohol on the development of HE and brain integrity remains undefined. Therefore, our aims were to 1) evaluate the impact of multiple episodes (induced by ammonia) and 2) evaluate the effect of constant alcohol consumption on neurological decline, brain integrity and injury in rats with CLD induced via bile-duct ligation (BDL). Methods: In the first aim, BDL rats were injected (s.c.) with ammonium acetate (BDLAmmonia), precipitating a reversible overt episode of HE (loss of righting reflex) every 4 days from week 3 post-BDL surgery (total; 4 episodes). SHAM rats were also injected with ammonia and BDL/SHAM rats were injected with saline as controls. To assess the neuronal integrity, western blot and immunofluorescence analysis were performed for frontal cortex, cerebellum, and hippocampus. Motor coordination (rotarod) and short- and long-memory (novel object recognition test) were assessed one week following last injection. In the second aim, BDL rats were administered alcohol (BDL-Alcohol) twice a day (51% v/v, dose of 3g/kg, via gavage) for 4 weeks. SHAM rats also received alcohol and BDL/SHAM rats received saline as controls. Motor coordination (rotarod) and anxiety-like behavior (open field and elevated plus maze) were assessed one week following last alcohol administration. Western blot and immunofluorescence analyses were performed to investigate neuronal integrity in frontal cortex and cerebellum. Results: In BDL-Ammonia, higher protein levels of astrocytic marker (GFAP) and apoptotic markers (caspase-3 and Bax/Bcl2) were found in the hippocampus, whereas neuronal markers (NeuN and SMI311) levels were reduced compared to all other experimental groups. BDLAmmonia rats showed increased levels of plasma oxidative stress compared to respective SHAM/BDL rats. Decreased levels of total antioxidant capacity (TAC) and increased 4-HNE modified proteins were found in the hippocampus (not in frontal cortex or cerebellum) of the BDL-Ammonia group compared to respective SHAM/BDL rats. Immunofluorescence results revealed the colocalization of apoptotic marker (cleaved caspase-3) with neuronal marker (NeuN) in the CA1 region of the hippocampus of BDL-Ammonia rats. BDL-Alcohol rats demonstrated impaired motor coordination at weeks 2, 3, 4, and 5 as well as an increase in anxiety-like behavior compared to respective SHAM rats. BDL-Alcohol rats showed a decrease in neuronal markers (NeuN and SMI311), an increase in apoptotic enzyme activity (cleaved caspase-3), an increase in necroptosis markers (pRIP3 and pMLKL), a decrease in TAC and an increase in 4-HNE modified proteins in the cerebellum compared to all groups. Immunofluorescence results revealed the colocalization of apoptotic marker (cleaved caspase3) and necroptosis marker (pMLKL) in granular layer neurons of the cerebellum of BDLAlcohol rats. Conclusion: Multiple episodes of overt HE led to neuronal cell loss in the hippocampus of BDL rats which was associated with increased oxidative stress, apoptosis and decreased neuronal count. Elevated levels of astrocytic marker (GFAP) in the hippocampus insinuate gliosis, possibly a result of neuronal loss. Moreover, alcohol administration worsens coordination impairments in BDL rats which were associated with increased oxidative stress, decreased neuronal markers (NeuN and SMI311) with apoptosis and necroptosis in the cerebellum of BDL-Alcohol rats. Overall, both multiple episodes of overt HE as well as continuous alcohol consumption, via oxidative stress, triggers neuronal loss/injury which consequently will lead to poor neurological outcome post-LT.

La génomique d'association cherche à déterminer des liens entre le génome et des traits ou phénotypes, notamment dans le contexte de maladies. Aujourd'hui, les études les plus fréquentes en génomique d’association sont les études génome entier, qui analysent autant de variants du génomes (SNPs) que possible, sans avoir de préjugé a priori sur leur fonction biologique. Cependant, les méthodes de génotypage utilisées pour ces études ne permettent pas toujours d'obtenir des informations précises dans une région hypervariable comme la région HLA, qui joue un rôle crucial dans l'immunité, et les variants génétiques de ces régions sont souvent prédits par des approches bioinformatiques. J'ai durant ma thèse créé un nouvel outil, HLA-Check, permettant d'évaluer, à partir des génotypes obtenus par puce de génotypage, la plausibilité de données d'allèles HLA d'un même individu, et démontré que cette technique permettait d'identifier plus précisément les individus dont les allèles HLA avaient été mal caractérisés afin de les retyper ou de les écarter de l'étude. Un article documentant cet outil a été publié dans BMC Bioinformatics. J'ai également effectué une étude d'association génome entier sur le déclenchement de la cirrhose chez les patients co-infectés par le VIH (virus de l'immunodéficience humaine) et le VHC (virus de l'hépatite C). La coinfection par ces deux maladies est fréquente en raison de modes d’infection similaires, et l'infection par le VIH stimule l'activité du VHC et accélère la fibrose du foie puis sa cirrhose, causant la mort des patients co-infectés. Mon étude porte sur 306 patients co-infectés issus de la cohorte ANRS CO-13 HEPAVIH. J'ai ainsi pu mettre en évidence trois signaux associés avec le déclenchement de la cirrhose, dont deux ont un lien pertinent avec les maladies hépatiques (gene CTNND2 et gene MIR7-3HG). L'identification de ces nouveaux variants devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la cirrhose, et contribuer au développement de nouvelles stratégies diagnostiques ou thérapeutiques. L’article documentant cette étude est en cours de publication. / Association genomics aims at finding links between the genome and some traits or illnesses. Today, the most frequent studies in this field are genome wide association studies (GWAS), which analyze as many genome variants (mainly Single Nucleotide Polymorphisms) as possible, without any a priori on their biological function. However, genotyping methods used in these studies may be insufficient to get reliable information in higly variable regions such as the HLA which plays a crucial role in immunity, and the genetic variants of such regions are often predicted using bioinformatics approaches. During my PhD, I have created a new tool, HLA-Check, that allows to rate the plausibility of HLA alleles from the genotypes obtained from genotyping chips. I also assesses its performances and showed that it was able to point out individuals with a wrong HLA typing, in order to retype them or remove them from the study. An article documenting this tool was published in BMC Bioinformatics. I have also performed a genome-wide association study on cirrhosis outbreak in individuals coinfected with HIV (human immunodeficiency virus) and HCV (hepatitis C virus). Because of similar infection routes (blood-related), co-infection with those two viruses are frequent, and the infection by HIV enhances HCV activity and increases liver fibrosis leading to cirrhosis and death of co-infected patients. Our study has dealt with 306 co-infected patients from the ANRS CO-13 HEPAVIH cohort. I could point out three statistically significant signals, two of them being highly relevant for their involvement in liver diseases (gene CTNND2 and gene MIR7-3HG). The identification of these new variants should lead to a better understanding of the molecular mechanisms involved in cirrhosis, and should contribute to the rational developement of new diagnostic or therapeutic strategies. A publication is under way.

La maladie alcoolique du foie (MAF) et l’hépatite C chronique (HCC) sont les causes les plus fréquentes de cirrhose, carcinome hépatocellulaire (CHC) et transplantation hépatique dans les pays industrialisés. La fibrose hépatique est le stigmate lésionnel de la progression de la maladie vers la cirrhose comme dans toutes les hépatopathies chroniques. Certains facteurs de risque cliniques environnementaux ont été identifiés. Toutefois, ils n’expliquent pas l’extrême variabilité individuelle de la progression de la fibrose. L’influence ethnique à développer une maladie plus sévère ainsi que les études de concordance des jumeaux mono- et di-zygotiques sur la prévalence de la cirrhose alcoolique ont suggéré l’existence de facteurs génétiques associés. Les nombreuses études de gènes candidats réalisées n’ont identifié que très peu de variants associés de manière reproductible. Pour l’HCC par exemple, le score de risque de cirrhose ou « CRS » a montré sa capacité à prédire une fibrose avancée dans diverses cohortes caucasiennes. Récemment, une étude d’association pangénomique (GWAS) dans la stéatohépatopathie non-alcoolique (NAFLD) a mis en évidence un singleton (single nucleotide polymorphism [SNP]) particulier (rs738409 C>G) dans le gène PNPLA3. Ce dernier s’est révélé être, dans diverses études, le SNP ayant l’impact le plus robuste et le plus reproductible dans cette maladie. Par ailleurs, ce même variant a également été significativement associé à la cirrhose alcoolique chez les hispaniques.<p><p>Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse ont permis de montrer que :<p><p>1) Le CRS avait la capacité de prédire la progression de la fibrose chez des patients caucasiens ayant une HCC dans 2 cohortes européennes indépendantes.<p><p>2) Par ailleurs, dans la MAF, nous avons répliqué chez des patients caucasiens l’association entre le SNP rs738409 dans le gène PNPLA3 et la cirrhose. Nous avons également montré pour la première fois, que l’expression de PNPLA3 était significativement diminuée chez les patients avec une fibrose plus avancée. De plus, nous avons observé dans 2 cohortes européennes que rs738409 était également associé à la prévalence du CHC.<p><p>3) Enfin, nous avons également mis en évidence l’impact de ce même SNP sur la stéatose hépatique et la fibrose dans l’HCC sans toutefois qu’il influence la réponse à la thérapie antivirale dans 3 cohortes caucasiennes indépendantes.<p><p>Ainsi de manière remarquable, un même SNP (rs738409) apparait associé à des lésions hépatiques sévères dans les trois pathologies hépatiques chroniques les plus fréquentes (la MAF, l’HCC et la NAFLD). Ceci suggère des voies pathogéniques communes de la fibrogénèse hépatique. Par ailleurs, ces travaux soulignent indirectement que les GWAS ont la capacité d’ouvrir de nouvelles voies physiopathologiques et d’identifier de nouveaux variants, gènes ou région génétiques capables de constituer de nouveaux biomarqueurs et cibles thérapeutiques dans l’HCC et la MAF. / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished