Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2254071 bytes, checksum: 5ef1f814625ed46426cc35ec211b8399 (MD5) Previous issue date: 2013-03-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Root bark infusions of the plant Cissampelos sympodialis Eichl (Menispermaceae) are used in folk medicine, in Northeast Brazil, for the treatment of diseases of the respiratory and digestive tracts. Previous studies showed that the hydroalcoholic extract of the leaves (AFL) of the plant and warifteine (W), alkaloid bisbenzylisoquinolinic, presented anti-inflammatory and anti-allergic effects. This study evaluated the effect of the oral treatment of mice with W and methyl warifteine (MW) in the paw edema formation induced by phlogistic agents, vascular leakage and cell migration in acute inflammatory models and the effect of oral treatment with AFL and its alkaloids (W and MW) in chronic inflammation represented by the experimental model of food allergy (BALB / c mice sensitized with ovalbumin - OVA). Oral treatment with W reduced the paw edema induced by carrageenan, histamine and prostaglandin E2, an effect not presented in MW treatment. The warifteine and methyl-warifteine also reduced the vascular leakage, however without inhibiting cell migration associated with inflammation. In the experimental model of food allergy the treatment with W induced weight gain in animals with decreased of diarrhea. Methylation of warifteine did not induce weight gain nor inhibited allergic diarrhea during the allergen challenge. However treatment with AFL did not induce weight gain nor inhibited allergic diarrhea. In contrast, treatment with the AFL or its alkaloids reduced the IgE specific for ovalbumin (OVA) titer, increased the proportion of CD4 + or CD8+ T lymphocytes in mesenteric lymph nodes. The proportion of regulatory T lymphocytes in the mesenteric lymph nodes was also increased by the treatments. In vitro experiments, with cells from mesenteric lymph nodes of sensitized animals, demonstrated that W and MW inhibited the secretion of interleukin (IL-) 12 and IL-10 with no change in the interferon-γ (IFN-γ) and IL- 13 levels. These results demonstrated that the oral treatment with warifteine presented anti-inflammatory activity by inhibiting the action of mediators of inflammation and the methylation of the molecule did not improve this effect. Also, the treatment with AFL, W and MW showed immunomodulatory effects in food allergy with increased of Treg cells and decreased of cytokines derived from cells of the innate immune mechanism independent of that of the adaptive immune mechanism. / Infusões das raízes da planta Cissampelos sympodialis Eichl (Menispermaceae) são utilizadas, pela medicina popular, no Nordeste Brasileiro, para o tratamento de doenças do trato respiratório e digestório. Estudos prévios demonstram que o extrato hidroalcoólico das folhas (AFL) da planta e a warifteina (W), alcaloide bisbenzilisoquinolínico, apresentam efeitos anti-inflamatórios e antialérgicos. Esse estudo avaliou, portanto, o efeito do tratamento oral de camundongos com W e a metil-warifteina (MW) na formação do edema de pata induzido por agentes flogísticos, no extravasamento vascular e na migração celular em modelos de inflamação aguda e o efeito do tratamento oral com a AFL e seus alcaloides (W e MW) na inflamação crônica representada pelo modelo experimental de alergia alimentar (camundongos BALB/c sensibilizados com ovalbumina - OVA). O tratamento com a W reduziu o edema de pata induzido por carragenina, por histamina ou prostaglandina E2, efeito esse não observado com o tratamento com MW. A warifteina e a metil-warifteina também reduziram o extravasamento vascular, contudo sem inibir a migração celular associada à inflamação. No modelo experimental de alergia alimentar o tratamento com W induziu ganho de peso dos animais com diminuição da diarreia. A metilação da warifteina, embora não tenha induzido o ganho de peso diminuiu a diarreia durante os desafios com o alérgeno. Todavia o tratamento com AFL não induziu o ganho de peso e nem inibiu a diarreia alérgica. Diferentemente, os tratamentos com o AFL e com os alcaloides reduziram os títulos de IgE específica para ovalbumina (OVA), aumentaram a proporção de linfócitos T CD4+ e CD8+ no linfonodo mesentérico. A proporção de linfócitos T reguladores foi aumentada no linfonodo mesentérico pelos tratamentos em estudo. Os experimentos in vitro, com células do linfonodo mesentérico de animais sensibilizados, demonstraram que W e MW inibiram a secreção de interleucina (IL-)12 e IL-10, sem alteração nos níveis de interferon-γ (IFN-γ) e IL-13. Esses resultados demonstraram que o tratamento oral com warifteina apresentou atividade anti-inflamatória por inibir a ação de mediadores da inflamação e que a metilação da molécula não potencializou seu efeito. Também, os tratamentos com AFL, W e MW apresentaram efeitos imunomoduladores na alergia alimentar com aumento de células Treg e com diminuição de citocinas oriundas de células do mecanismo imune inato independente das do mecanismo imune adaptativo.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:00:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 4361699 bytes, checksum: e5a69841109235b04a866e4c6017cf05 (MD5) Previous issue date: 2013-08-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The application of preparative high pressure liquid chromatography (PREP-HPLC) in the isolation of natural products is shown as a robust, versatile and fast technique that ensures the purification and isolation of substances in complex matrices, as natural products. This technique is a powerful tool in an area in which purification and obtainment of samples in large amount is somewhat laborious, and often, there is a need for re-isolation of samples; thus, its reproducibility is a great advantage. The combination of HPLC with mass spectrometry allows merging the advantages of chromatography, such as the high selectivity and separation efficiency, with the mass spectrometry advantages, as information related to molecular structure, the molar mass and enhancement of additional selectivity. Cissampelos sympodialis Eichl. is a Brazilian species and the infusion of this plant is traditionally used in the northeast of Brazil to treat asthma, bronchitis and rheumatism, between other inflammatory diseases. The objective of this work to develop a rapid and reproducible method for isolation of established chemical biomarkers of plant and other alkaloids from C. sympodialis Eichl., and use the standard of warifteine in quantification of it in biological fluids to determine the pharmacokinetic parameters of the alkaloid after administration of it in rats in vivo. The chromatographic method consisted of a gradient from 0-15 min (75 % B), 15-20 min (80 % B), 20-25 min (100 % B),  278 nm, and flow of 5.0 mL/min during 20 min, with mobile phase of methanol (B) and water (A) basified with ammonium to reach pH 8.0, and the amount of sample mass injected per experiment was 800 mg. The alkaloids isolated were warifteine (99.79 % of purity), methyl-warifteine (98.52 % of purity), the mixture of epimers of desmethyl-roraimine, and a new alkaloid not referred in literature that was elucidated and named as Sousine. Animals from Ratus novergicus species received an intravenous single dose of warifteine of 1.0 mg/Kg, and the blood samples were collected in 5, 15, 30, 60, 120 and 180 minutes. The blood samples were centrifuged to obtain the plasma and then were extracted by protein precipitation with acetonitrile. The pharmacokinetic parameters were calculated based on plasmatic concentrations versus time curves using non-compartmental model. The linearity range to chromatographic method was between 10 and 500 ng/mL e the kinetic parameters were Cmáx 16.08 μg/mL, Tmáx 12.5 min-1, Kel 0.01355 min-1. The method developed to isolation of alkaloids from C. sympodialis Eichl. is a practical, rapid and robust one. The HPLC-MS/MS method enabled to quantify warifteine in rat plasma with samples extraction by protein precipitation, yet, there was a great variability between animals in the kinetics experiment. / A aplicação da cromatografia a líquido de alta eficiência preparativa (CLAE-PREP) no isolamento de produtos naturais, mostra-se como uma técnica robusta, versátil e rápida, que garante a purificação e o isolamento de substâncias de matrizes complexas, como os produtos naturais. Essa técnica é uma ferramenta valiosa numa área em que a purificação e obtenção de amostras em quantidade é algo laborioso, e muitas vezes, há necessidade de reisolamento de amostras; assim, sua reprodutibilidade é uma grande vantagem. A combinação da CLAE com a espectrometria de massas permite unir as vantagens da cromatografia, como a alta seletividade e eficiência de separação, às vantagens da espectrometria de massas, como a obtenção de informação estrutural, massa molar e aumento adicional de seletividade. Cissampelos sympodialis Eichl. é uma espécie da flora brasileira, a infusão das raízes da planta é popularmente utilizada no nordeste do Brasil para tratamento de asma, bronquite e reumatismo, dentre outras enfermidades inflamatórias. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método rápido e reprodutível para o isolamento dos marcadores químicos estabelecidos e de outros alcaloides de C. sympodialis Eichl., e utilizar o padrão de warifteína para quantificação da mesma em fluidos biológicos com vistas à determinação de parâmetros farmacocinéticos do alcaloide após administração in vivo em ratos. O método cromatográfico utilizado consistiu em gradiente de 0-15 min (75 %), 15-20 min (80 %), 20-25 min (100 %),  de 278 nm, fluxo de 5,0 mL/min e tempo de corrida de 20 min, com fase móvel de metanol e água, ambos basificados com amônia para pH 8,0 e a massa de FATT-rz injetada por cada corrida cromatográfica na coluna foi 800 mg. Foram isolados os alcaloides warifteína (pureza 99,79%), metil-warifteína (pureza 98,52%), os epímeros de desmetil-roraimina, além de um alcaloide inédito na literatura que teve sua estrutura elucidada e foi denominado de Sousina. Animais da espécie Ratus wistar receberam dose única de 1,0 mg/Kg de warifteína intravenosa e as coletas de sangue foram realizadas nos tempos 5, 15, 30, 60, 120 e 180 min. As amostras sangue foram centrifugadas para obtenção do plasma e extraídas por precipitação de proteínas utilizando acetonitrila. Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados com base nas curvas de concentração plasmática versus tempo pelo modelo não-compartimental. A faixa de linearidade para o método cromatográfico foi entre 10 e 500 ng/mL e os parâmetros cinéticos foram Cmáx 16,08 μg/mL, Tmáx 12,5 min-1, Kel 0,01355 min-1. O método de isolamento por CLAE-PREP é uma alternativa prática, rápida e robusta para obtenção dos alcaloides de C. sympodialis. O método proposto por CLAE-EM/EM permitiu quantificar a warifteína em fluido plasmático de rato com a extração das amostras por precipitação de proteínas, ainda, houve grande variabilidade interindividual entre os animais usados no experimento cinético.

Submitted by Cristhiane Guerra (cristhiane.guerra@gmail.com) on 2017-02-01T16:10:08Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2145717 bytes, checksum: d5fdbc85b572e5bc3fbbb89985a24ef3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-01T16:10:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2145717 bytes, checksum: d5fdbc85b572e5bc3fbbb89985a24ef3 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The pulmonary hypertension (PH) is caracterized for the increase chronic pulmonary arterial pressure, vascular remodeling and ventricle right hypertrophy. The oxidative stress is a common disorders in the PH. Cissampelos sympodialis Eichl. is frequently used in the popular medicine for the treatement of deseases of the tract respiratory, rheumatism and arthritis. Furthermore many of these activites it has been proved scientifically making this plant an promising target. In this context this study had with aim to evaluate the acute effect of aqueous fraction of Cissampelos sympodialis Eichl (FAFCS) in pulmonary artery of normotensives rats and to avaluate the FAFCS potential in to prevent and/or to improve the pulmonary vascular dysfunction induced for the monocrotaline PH (MCT). In pulmonary artery rings precontracted with phenilefrine (PHE) (1uM) isolated of normotensive rats, FAFCS (10-3000ug/mL) induzed vasorelaxation, concentration dependent, with (MR=98±2%; EC50=599μg/mL) or without of endothelium (MR=102±2%; EC50 =700μg/mL), demostrate that FAFCS produces vasorelaxation independent of the endothelial factors. The PH was induced for the subcutaneous injection of MCT (60mg/kg, single dose). The animals receive FAFCS oral via (50 ou 100mg/kg/day), sildenafil or saline during 28 days. The MCT group presented increase of PAP (63±5 mmHg) and HVD (0,52±0,03g) in comparing to the control group (PAP=29±2mmHg; HVD=0,28±0,02g). The treatment with FAFCS 50mg/kg (PAP=46±3mmHg; HVD=0,36±0,04g) and 100mg/kg (30±5mmHg; HVD=0,37±0,05g) or sildenafil 50mg/kg (32±2mmHg; HVD=0,35±0,03g) showed a significant reduction in pressure and right ventricular hypertrophy compared to the MCT group. In the tests of vascular reactivity the MCT animals showed reduction of the response to PHE (Δ contraction=0,37±0,04g) and decrease of the reponse vasorelaxation to ACh and NPS (MR=45±6%) in relation to the control group (PHE, Δ contraction=0,86±0,09 g; NPS, MR=96±6%). The treatment with FAFCS or sildenafil not reversed to endothelial dysfunction caused for the exposition to MCT. However the effect to PHE and the NPS were restored with FAFCS 50mg/kg (PHE, Δcontraction =0,63±0,04g; MR=79±3%), FAFCS 100mg/kg (PHE, Δcontraction=0,77±0,06g; NPS, MR= 85±5 %) e sildenafil (PHE, Δcontraction = 0,8±0,08g; NPS, MR=72±2%). Furthermore FAFCS reduced significantly the levels of reactive oxygen species in the DHE staining in pulmonary artery. In conclusion these results suggests that FAFCS promotes relaxant effect endothelium independent in pulmonary artery of normotensive rats. In PH monocrotaline-induced the treatment with FAFCS reduced the oxidative stress and restore the damage on smooth muscle in pulmonary artery of rat and hypertrophy right ventricle induced by monocrotaline. / A hipertensão pulmonar (HP) é caracterizada pelo aumento crônico da pressão arterial pulmonar, remodelamento vascular e hipertrofia do ventrículo direito. O estresse oxidativo é uma das desordens comum na HP. Cissampelos sympodialis Eichl. é frequentemente utilizada na medicina popular para o tratamento de doenças do aparelho respiratório, reumatismos e artrites. Além disso, muitas dessas atividades têm sido cientificamente comprovadas tornando essa planta um alvo de pesquisa bastante promissor. Nesse contexto, o trabalho teve como objetivo avaliar o efeito agudo de fração aquosa de Cissampelos sympodialis Eichl. (FAFCS) em artéria pulmonar de rato saudável, bem como avaliar o potencial da FAFCS em prevenir e/ou melhorar disfunção vascular pulmonar promovida pelo modelo de HP induzido pela monocrotalina (MCT). Em anéis de artéria pulmonar isolada de rato normotenso, pré-contraídos com fenilefrina (FEN) (1μM), FAFCS (10-3000μg/mL) induziu vasorrelaxamento, dependente de concentração, na presença (Emáx=98±2%; CE50=599μg/mL) e ausência (Emáx=102±2%; CE50 =700μg/mL) do endotélio, demonstrando que FAFCS produz efeito vasorrelaxante independente dos fatores endoteliais. A HP foi induzida pela injeção subcutânea de MCT (60mg/kg, dose única). Os animais receberam FAFCS via oral (50 ou 100mg/kg/dia), sildenafil ou salina durante 28 dias. O grupo MCT apresentou aumento na PAP (63±5 mmHg) e HVD (0,52±0,03g) em comparação ao grupo controle (PAP=29±2mmHg; HVD=0,28±0,02g). O tratamento com FAFCS 50mg/kg (PAP=46±3mmHg; HVD=0,36±0,04g) e 100mg/kg (30±5mmHg; HVD=0,37±0,05g) ou sildenafil 50mg/kg (32±2mmHg; HVD=0,35±0,03g) apresentaram redução significativa da pressão e hipertrofia ventricular direita em comparação ao grupo MCT. Nos ensaios de reatividade vascular, os animais MCT apresentaram redução da resposta à FEN (Δcontração=0,37±0,04g) e diminuição das respostas vasorrelaxantes à ACh e NPS (Emáx=45±6%) em relação ao grupo controle (FEN, Δcontração=0,86±0,09 g; NPS, Emáx=96±6%). O tratamento com FAFCS ou sildenafil não reverteu à disfunção endotelial causada pela exposição a MCT. Entretanto, a resposta à FEN e ao NPS foram restauradas com o tratamento com FAFCS 50mg/kg (FEN, Δcontração =0,63±0,04g; Emáx=79±3%), FAFCS 100mg/kg (FEN, Δcontração=0,77±0,06g; NPS, Emáx= 85±5 %) e sildenafil (FEN, Δcontração = 0,8±0,08g; NPS, Emáx=72±2%). Além disso, o tratamento com FAFCS reduziu significativamente os níveis de espécies reativas de oxigênio em cortes de artéria pulmonar, detectado pela fluorescência emitida pela oxidação do DHE por ânions O2●-. Em conclusão, estes resultados sugerem que FAFCS promove efeito relaxante independente de endotélio em artéria pulmonar de rato normal. No modelo de HP adotado, o tratamento com FAFCS reduz o estresse oxidativo e restaura a resposta muscular lisa em artéria pulmonar de rato, prevenindo a HP e hipertrofia ventricular direita.