Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-08-05Bitstream added on 2014-06-13T18:31:15Z : No. of bitstreams: 1 paulan_sc_me_araca_prot.pdf: 859556 bytes, checksum: f0e6fa2d3af33e24da91a0232d77060c (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A cisticercose bovina, causada pela forma metacestóide de Taenia saginata, é responsável por prejuízos econômicos devido à desvalorização de carcaças infectadas. A inspeção sanitária tem sido a principal forma de diagnóstico desta zoonose, porém apresenta baixa sensibilidade em identificar animais com infecção menos intensa. Ensaios imunoenzimáticos para detecção de anticorpos e de antígenos representam importante alternativa de diagnóstico ante mortem para a identificação de animais infectados, pois apresentam maior sensibilidade. Neste trabalho foram avaliadas a detecção de anticorpos anti-Taenia saginata e de antígenos do mesmo parasita em amostras de soro de bovinos naturalmente infectados, por meio dos testes ELISA indireto e ELISA sanduíche, respectivamente. Além das condições de realização dos testes, como o preparo das soluções e o tipo de extrato antigênico utilizados, a intensidade da infecção é um dos fatores que mais interferem nos resultados diagnósticos. Dessa forma, as características diagnósticas dos testes ELISA indireto, realizado com três diferentes extratos antigênicos, e ELISA sanduíche, realizado com o anticorpo monoclonal HP10, foram também relacionadas com a intensidade de infecção dos bovinos por Taenia saginata / Bovine cysticercosis caused by Taenia saginata metacestodes is responsible for economic losses due to depreciation of the infected carcasses. Sanitary inspection has been the main diagnostic tool but has low sensitivity in animals light infected. Immunoassays for antibodies and antigens detection are important ante mortem diagnosis, because present higher sensitivity. Antibodies anti-T. saginata and T. saginata antigens detection were evaluated in naturally infected bovine serum samples by indirect ELISA and sandwich ELISA. Besides reagents and test conditions the intensity of animal’s infection represents one of the most important interfering factors on the diagnostic results. Thus, diagnostic characteristics of indirect ELISA performed with three different antigenic extracts and sandwich ELISA, with monoclonal antibody HP10, were related to the intensity of infection in samples from Taenia saginata infected bovines

Orientador: Cáris Maroni Nunes / Banca: Valéria Marçal Félix de Lima / Banca: Hélio José Montassier / Resumo: A cisticercose bovina, causada pela forma metacestóide de Taenia saginata, é responsável por prejuízos econômicos devido à desvalorização de carcaças infectadas. A inspeção sanitária tem sido a principal forma de diagnóstico desta zoonose, porém apresenta baixa sensibilidade em identificar animais com infecção menos intensa. Ensaios imunoenzimáticos para detecção de anticorpos e de antígenos representam importante alternativa de diagnóstico ante mortem para a identificação de animais infectados, pois apresentam maior sensibilidade. Neste trabalho foram avaliadas a detecção de anticorpos anti-Taenia saginata e de antígenos do mesmo parasita em amostras de soro de bovinos naturalmente infectados, por meio dos testes ELISA indireto e ELISA sanduíche, respectivamente. Além das condições de realização dos testes, como o preparo das soluções e o tipo de extrato antigênico utilizados, a intensidade da infecção é um dos fatores que mais interferem nos resultados diagnósticos. Dessa forma, as características diagnósticas dos testes ELISA indireto, realizado com três diferentes extratos antigênicos, e ELISA sanduíche, realizado com o anticorpo monoclonal HP10, foram também relacionadas com a intensidade de infecção dos bovinos por Taenia saginata / Abstract: Bovine cysticercosis caused by Taenia saginata metacestodes is responsible for economic losses due to depreciation of the infected carcasses. Sanitary inspection has been the main diagnostic tool but has low sensitivity in animals light infected. Immunoassays for antibodies and antigens detection are important ante mortem diagnosis, because present higher sensitivity. Antibodies anti-T. saginata and T. saginata antigens detection were evaluated in naturally infected bovine serum samples by indirect ELISA and sandwich ELISA. Besides reagents and test conditions the intensity of animal's infection represents one of the most important interfering factors on the diagnostic results. Thus, diagnostic characteristics of indirect ELISA performed with three different antigenic extracts and sandwich ELISA, with monoclonal antibody HP10, were related to the intensity of infection in samples from Taenia saginata infected bovines / Mestre

A cisticercose bovina, causada por Taenia saginata, é uma zoonose de preocupação em saúde pública que ocorre em todo o território brasileiro. É causada pela ingestão de ovos de T. saginata por bovinos, oriundos de fezes humanas. Os ovos irão gerar cistos na musculatura e órgãos dos bovinos. Estes cistos podem ser ingeridos pelos humanos ao consumirem carne e vísceras cruas ou que não atingiram a temperatura mínima de cocção (65ºC). O poder público, além de trabalhar a questão de saneamento básico, controla o ciclo da cisticercose através da inspeção oficial em matadouros de bovinos que tem a obrigação de garantir a inocuidade do alimento destinado ao consumo humano diagnosticando a cisticercose nas carcaças abatidas e dando o destino adequado para as mesmas. Porém, a legislação da inspeção brasileira até 29 de março de 2017, era regida através do seu Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal – RIISPOA (BRASIL, 1952), que se apresentava de forma dúbia, sem especificações adequadas em relação ao destino que deve ser dado as carcaças nas diversas possibilidades de intensidade da infecção. Neste trabalho foi realizada uma verificação da interpretação de 37 (trinta e sete) fiscais estaduais agropecuários (FEA’s) do estado do Rio Grande do Sul, em um total de 70 (setenta), a respeito do julgamento dado as carcaças em diferentes intensidades de parasitose. Como resultado verificou-se que 89,19% dos FEA’s não consideravam claro o RIISPOA de 1952 Em algumas hipóteses de infecções realizadas através de questionário, foram obtidos pareceres completamente divergentes quanto ao destino das carcaças parasitadas. As hipóteses levantaram questões rotineiras em um frigorífico como, quando há em uma carcaça a presença de dois ou mais cisticercos viáveis nos cortes de inspeção dentro da área da palma de uma mão: 70,27% dos FEA’s responderam que adotariam o destino de encaminhamento para tratamento pelo frio (TF) e 29,73% destinariam à condenação total; se dois ou mais cisticercos viáveis fossem encontrados fora da área da palma de uma mão: 57,14% encaminharia as carcaças para TF, 40,00% para condenação total e 2,86% faria o aproveitamento sem tratamento térmico. Nas hipóteses levantadas com dois ou mais cisticercos calcificados as divergências foram ainda maiores, quando dentro da área da palma de uma mão: 69,44% dos FEA’s encaminhariam as carcaças para TF, 25,00% para condenação total e 5,56% aproveitaria as carcaças sem tratamento térmico; se dois ou mais cisticercos calcificados estivessem fora da área da palma de uma mão: 55,56% encaminhariam para TF, 27,78% para condenação total e 16,67% aproveitariam as carcaças sem tratamento térmico.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-11-29T18:34:51Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1306405 bytes, checksum: 1458047941be6c1d95930520f19df28c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-29T18:34:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1306405 bytes, checksum: 1458047941be6c1d95930520f19df28c (MD5) Previous issue date: 2016-09-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A cisticercose bovina é uma doença de caráter zoonótico que acarreta prejuízos tanto de ordem sanitária quanto de ordem econômica. Tradicionalmente seu diagnóstico é realizado durante a inspeção post mortem em matadouros-frigoríficos sob fiscalização sanitária, e consiste basicamente na visualização macroscópica através de cortes realizados em grupos musculares preditos como preferenciais para a implantação dos cisticercos. Ressalta-se que este método apresenta deficiências de desempenho, deixando passar despercebidas formas discretas da doença. Essa pesquisa foi desenvolvida com a meta de aprimorar o diagnóstico da cisticercose bovina, e sobretudo, dos testes sorológicos atualmente desenvolvidos, aumentando a confiabilidade do diagnóstico. A pesquisa caracterizou-se pela seleção de oito peptídeos sintéticos e desenvolvimento de uma proteína quimera recombinante com alto potencial no diagnóstico da cisticercose bovina. Foram selecionadas três diferentes proteínas de Taenia saginata (GenBank) (18 kDa oncosphere antigen [Taenia saginata]; Antigen TSA16 [Taenia saginata]; Antigen TSA36 [Taenia saginata] Heat shock protein 20 homolog [Taenia saginata]), e realizada a predição de oito peptídeos (EP1-EP8) selecionados por diferentes programas de bioinformática. Após sintetização e análise do desempenho dos peptídeos pelo ELISA, foram selecionados os três peptídeos que alcançaram melhores resultados (EP1, EP4 e EP6) para compor uma proteína recombinante quimérica, que posteriormente foi denominada de rqTSA-25. A proteína rqTSA-25 obteve as seguintes taxas de desempenho no ELISA: sensibilidade de 88% (IC=76-94%), especificidade de 96% (IC=84-99%), valor preditivo positivo 96% (IC=86-99%), valor preditivo negativo 87% (IC=74-94%) e acurácia de 92%, sendo que, ao submeter diferentes amostras de soro grupo controle ao teste imunoblot, não foi verificada nenhuma reação falso positiva ou falso negativa. Dessa forma, destaca-se a inovação na produção da proteína rqTSA-25 e seu alto desempenho relatado, sendo um importante aliado na melhoria do teste diagnóstico sorológico para o diagnóstico da cisticercose bovina. / Bovine cysticercosis is a zoonotic disease that causes losses both for health and economic order. Traditionally the diagnosis is performed during the post-mortem inspection in slaughterhouses under sanitary inspection, and consistent basically in macroscopic visualization by means of cuts carried out in predicted muscle groups such as preferred for the implementation of cysticercosis. It is emphasized that this method has performance deficiencies, leaving pass unnoticed discrete forms of the disease. This research was developed with the goal of improving the performance of the diagnosis of bovine cysticercosis and serologic tests currently developed, allowing the presence of cysticercosis in live animals and increasing the reliability of the diagnosis. The research was characterized by the selection of synthetic peptides and development of a recombinant chimera protein with high potential for diagnosis of bovine cysticercosis. First, three different proteins were selected from Taenia saginata (GenBank) (18 kDa oncosphere antigen [Taenia saginata]; Antigen TSA16 [Taenia saginata]; Antigen TSA36 [Taenia saginata] Heat shock protein 20 homolog [Taenia saginata]), being carried out the prediction of eight peptides (EP1-EP8) with antigenic power by different bioinformatic programs. After synthesis and performance analysis of peptides by ELISA test, we selected three peptides that have reached the best performance rates (EP1, EP4 and EP6) to compose a chimeric recombinant protein, subsequently named rqTSA-25, which was inserted into pET 29a (+) for subsequent expression in bacterial system. The rqTSA-25 protein allowed the following performance ratios by ELISA: sensitivity 88% (CI = 76- 94%), specificity 96% (CI = 84-99%), positive predictive value 96% (CI = 86- 99%), negative predictive value 87% (CI = 74-94%) and 92% accuracy, and subjecting different samples of serum control group to immunoblotting, it was not found any false positive reaction or false negative. Thus, first it stands out of innovation in the production of rqTSA-25 protein and its reported performance, combined with important improvement in in the serologic test for the diagnosis of bovine cysticercosis.

A cisticercose bovina, causada por Taenia saginata, é uma zoonose de preocupação em saúde pública que ocorre em todo o território brasileiro. É causada pela ingestão de ovos de T. saginata por bovinos, oriundos de fezes humanas. Os ovos irão gerar cistos na musculatura e órgãos dos bovinos. Estes cistos podem ser ingeridos pelos humanos ao consumirem carne e vísceras cruas ou que não atingiram a temperatura mínima de cocção (65ºC). O poder público, além de trabalhar a questão de saneamento básico, controla o ciclo da cisticercose através da inspeção oficial em matadouros de bovinos que tem a obrigação de garantir a inocuidade do alimento destinado ao consumo humano diagnosticando a cisticercose nas carcaças abatidas e dando o destino adequado para as mesmas. Porém, a legislação da inspeção brasileira até 29 de março de 2017, era regida através do seu Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal – RIISPOA (BRASIL, 1952), que se apresentava de forma dúbia, sem especificações adequadas em relação ao destino que deve ser dado as carcaças nas diversas possibilidades de intensidade da infecção. Neste trabalho foi realizada uma verificação da interpretação de 37 (trinta e sete) fiscais estaduais agropecuários (FEA’s) do estado do Rio Grande do Sul, em um total de 70 (setenta), a respeito do julgamento dado as carcaças em diferentes intensidades de parasitose. Como resultado verificou-se que 89,19% dos FEA’s não consideravam claro o RIISPOA de 1952 Em algumas hipóteses de infecções realizadas através de questionário, foram obtidos pareceres completamente divergentes quanto ao destino das carcaças parasitadas. As hipóteses levantaram questões rotineiras em um frigorífico como, quando há em uma carcaça a presença de dois ou mais cisticercos viáveis nos cortes de inspeção dentro da área da palma de uma mão: 70,27% dos FEA’s responderam que adotariam o destino de encaminhamento para tratamento pelo frio (TF) e 29,73% destinariam à condenação total; se dois ou mais cisticercos viáveis fossem encontrados fora da área da palma de uma mão: 57,14% encaminharia as carcaças para TF, 40,00% para condenação total e 2,86% faria o aproveitamento sem tratamento térmico. Nas hipóteses levantadas com dois ou mais cisticercos calcificados as divergências foram ainda maiores, quando dentro da área da palma de uma mão: 69,44% dos FEA’s encaminhariam as carcaças para TF, 25,00% para condenação total e 5,56% aproveitaria as carcaças sem tratamento térmico; se dois ou mais cisticercos calcificados estivessem fora da área da palma de uma mão: 55,56% encaminhariam para TF, 27,78% para condenação total e 16,67% aproveitariam as carcaças sem tratamento térmico.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 414918 bytes, checksum: 9cdf78f58a88854b69201c78bf0c0899 (MD5) Previous issue date: 2011-07-29 / Bovine cysticercosis is a disease of cosmopolitan distribution and zoonotic feature caused by the larval form of Taenia Saginata. Severe infections are uncommon in cattle, the vast majority of cases found in slaughterhouses are mild infection, and however, it leads to the condemnation of the organ and, in some cases, the conditional avail of the carcass. Considering the risk to public health and economic losses caused by bovine cysticercosis, measures of sanitary control of this zoonosis should be taken not just at slaughterhouses, but also during the production phase. The aim of this study was to evaluate the performance of serological diagnosis in the detection of bovine cysticercosis in field samples, track properties in the city of Colatina-ES that sent animals to slaughtering and to assess the likely risk factors for the animals to be contaminated with Taenia eggs. The study was conducted from the animals slaughter and from the data of Official Inspection Services in three slaughterhouses in Colatina. Three hundred sixteen samples were collected, in which one there were a hundred eighty-three positive samples, sixty-two negative samples from healthy animals and seventy-one negative samples from animals with other diseases such as fascioliasis, hydatidosis and tuberculosis. The samples were analyzed by ELISA and immunoblot methods, and the results were organized in contingency table to calculate the performance of tests determined by the rates of sensitivity and specificity, positive and negative predictive values and agreement. From the Animal Transit Guide (GTA) the addresses of the properties included in the study were obtained, the tracing allowed the realization of the epidemiological survey to assess the risk factors related to the presence of cysticercosis in the region, mapping of the studied region distribution and analysis of cases and controls. The ELISA test did not show sufficient reliability to be used in detecting animals with cysticercosis in mild level, due to the high rate of false-negatives results. On the other hand, the immunoblot showed to be a more reliable method to detect positive samples. The main risk factors associated with cysticercosis in the properties in Colatina were: properties size, animal origin, age of the animals acquired and sewer destination. The diagnosis of cysticercosis in the refrigerator,added to the source information of the animal, allowed to define the areas of disease occurrence and its quantification. / A cisticercose bovina é uma enfermidade de distribuição cosmopolita de caráter zoonótico, causada pela forma larval da Taenia saginata. Infecções graves em bovinos são pouco frequentes, a grande maioria dos casos encontrados em matadouros consiste em infecção discreta, mesmo assim, levam a condenção do órgão e, em alguns casos, aproveitamento condicional da carcaça. Levando em consideração o risco para a saúde pública e os prejuízos econômicos provocados pela cisticercose bovina, medidas de controle sanitário dessa zoonose devem ser tomadas não só no momento do abate, mas também na fase de produção dos bovinos. O objetivo dessa pesquisa foi avaliar o desempenho do diagnóstico sorológico na detecção da cisticercose bovina em amostras de campo, rastrear propriedades localizadas no município de Colatina-ES que enviaram animais para abate e avaliar os prováveis fatores de risco de contaminação dos animais com larvas de T. saginata. Foi realizado estudo a partir do abate de animais e de dados dos Serviços Oficiais de Inspeção em três matadouros localizados no município de Colatina-ES. Foram coletadas 316 amostras de sangue, sendo 183 amostras positivas, 62 negativas provenientes de animais sadios e 71 negativas provenientes de animais com outras patologias como fasciolose, hidatidose e tuberculose. As amostras foram analisadas através das técnicas ELISA e immunoblot e os resultados foram organizados em tabela de contingência para cálculo do desempenho dos testes determinado pelas taxas de sensibilidade e especificidade, valores preditivos positivo e negativo e concordância. A partir da Guia de Trânsito Animal (GTA) foram obtidos os endereços das propriedades incluídas no estudo, a rastreabilidade permitiu a realização de inquérito epidemiológico, para avaliação dos fatores de risco relacionados à presença da cisticercose na região, mapeamento da região estudada e análise de distribuição dos casos e controles. O teste ELISA não apresentou confiabilidade suficiente para ser utilizado na detecção de animais portadores de cisticercose com apresentação discreta da doença, em decorrência da alta taxa de falso-cegativos. Por outro lado, o immunoblot demonstrou ser um método mais confiável na detecção de amostras positivas. Os principais fatores de risco associados às propriedades com cisticercose no município de Colatina foram tamanho das propriedades,origem dos animais, idade dos animais adquiridos e destino do esgoto. O diagnóstico da cisticercose no frigorífico, somado a informação de origem do animal, possibilitou definir as áreas de ocorrência da doença e sua quantificação.

A cisticercose bovina, causada por Taenia saginata, é uma zoonose de preocupação em saúde pública que ocorre em todo o território brasileiro. É causada pela ingestão de ovos de T. saginata por bovinos, oriundos de fezes humanas. Os ovos irão gerar cistos na musculatura e órgãos dos bovinos. Estes cistos podem ser ingeridos pelos humanos ao consumirem carne e vísceras cruas ou que não atingiram a temperatura mínima de cocção (65ºC). O poder público, além de trabalhar a questão de saneamento básico, controla o ciclo da cisticercose através da inspeção oficial em matadouros de bovinos que tem a obrigação de garantir a inocuidade do alimento destinado ao consumo humano diagnosticando a cisticercose nas carcaças abatidas e dando o destino adequado para as mesmas. Porém, a legislação da inspeção brasileira até 29 de março de 2017, era regida através do seu Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal – RIISPOA (BRASIL, 1952), que se apresentava de forma dúbia, sem especificações adequadas em relação ao destino que deve ser dado as carcaças nas diversas possibilidades de intensidade da infecção. Neste trabalho foi realizada uma verificação da interpretação de 37 (trinta e sete) fiscais estaduais agropecuários (FEA’s) do estado do Rio Grande do Sul, em um total de 70 (setenta), a respeito do julgamento dado as carcaças em diferentes intensidades de parasitose. Como resultado verificou-se que 89,19% dos FEA’s não consideravam claro o RIISPOA de 1952 Em algumas hipóteses de infecções realizadas através de questionário, foram obtidos pareceres completamente divergentes quanto ao destino das carcaças parasitadas. As hipóteses levantaram questões rotineiras em um frigorífico como, quando há em uma carcaça a presença de dois ou mais cisticercos viáveis nos cortes de inspeção dentro da área da palma de uma mão: 70,27% dos FEA’s responderam que adotariam o destino de encaminhamento para tratamento pelo frio (TF) e 29,73% destinariam à condenação total; se dois ou mais cisticercos viáveis fossem encontrados fora da área da palma de uma mão: 57,14% encaminharia as carcaças para TF, 40,00% para condenação total e 2,86% faria o aproveitamento sem tratamento térmico. Nas hipóteses levantadas com dois ou mais cisticercos calcificados as divergências foram ainda maiores, quando dentro da área da palma de uma mão: 69,44% dos FEA’s encaminhariam as carcaças para TF, 25,00% para condenação total e 5,56% aproveitaria as carcaças sem tratamento térmico; se dois ou mais cisticercos calcificados estivessem fora da área da palma de uma mão: 55,56% encaminhariam para TF, 27,78% para condenação total e 16,67% aproveitariam as carcaças sem tratamento térmico.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2838276 bytes, checksum: ab260e36167467b459860c7472987dd6 (MD5) Previous issue date: 2012-05-29 / The bovine cysticercosis is a zoonotic disease that causes damage both in terms of health and in terms of economy. This research was developed in order to better understand the anatomical and microscopic characteristics related to the implantation of cysticerci and the immune evolution of the disease, and evaluate the performance of the immunoassay ELISA in the diagnosis of nine experimentally infected animals by oral administration of Taenia saginata eggs. Field work with the animals included the monthly collection of blood every 30 days, being that from 120 days post-infection an animal was slaugthered every 30 days to perform the anatomic-pathological examination and proceed with the collection of cysticerci. The samples from naturally infected animals were obtained by collecting in commercial slaughterhouse. Regarding muscular location of cysticercus in Group 1, the sites routinely inspected with predominance of occurrence were the heart (37.7%), head muscles (17.1%) and the tongue (2.3%). In relation to the assessed commercial cuts, 8.2% of cysticerci were found in the sparerib, 6.6% in the shoulder, 6.2% in the tenderloin and 5.8 in the rump. Other not-routinely inspected tissues that presented cysticerci were the diaphragm, the liver and the esophagus with 2.7%, 12.0% and 1.2% of the total cysticerci. Not viable cysticercus was the majority in head muscles (77.3%), followed by 76.3% in heart muscle and 71.0% in the liver and tongue (50%). Concerning viability, liver presented 87.5% of the not viable cysticerci, followed by the tongue 66.7%, and the heart with 63.2%, but the highest frequency of viable cysticerci was found in the head muscles (68.3%). Of the nine animals studied, five had the kinetics of antibody production against the cysticerci in a similar way when measured the production of antibodies of the IgM and IgG classes, once the peak of antibody production occurred in the period of 0-30 days post-infection followed by a natural decline and maintained detectable until the end of the study. However, the other two groups, each containing two animals, showed the kinetics of antibody production different from most animals, being that one group had a delayed response to the presence of cysticerci and the other group showed no immune response against antigens secreted by cysticerci. For the production of IgG1, it was possible to detect increased levels of antibodies from 30 days post-infection, having the production peak at 270 days, and IgG2 at 60 days. Regarding the cellular response observed against the cysticerci, it was possible to observe that in the case of viable cysticerci, inflammatory cells were present in the major part; and in the case of unviable cysticerci, the presence of repairing tissue cells, being also correlated the amount of calcareous corpuscles with the parasite's stage of death. With regard to the performance of the ELISA test against experimentally and naturally infected animals using a cut-off 1 and 2 added with 2 standard-deviation (SD), it was of 12% and 24.4%, respectively; and when using the cut-off 1 and 2 added with 3 SD the test sensitivity was at 1.99% and 14.4%, respectively. As for the samples from experimentally infected animals using the cut point 1 and 2 added with 2 SD the sensitivity was at 55.9% and 92.5%; and adding 3 SD the values found were 31.2% and 86%, respectively; the specificity of the test in all situations tested was at 100%. The combination of these results should be considered for diagnosis of bovine cysticercosis through the ELISA test, suggesting its use in combination with the anatomic-pathological test routinely performed in slaughterhouses. / A cisticercose bovina é uma doença de caráter zoonótico que acarreta prejuízos tanto de ordem sanitária quanto de ordem econômica. Essa pesquisa foi desenvolvida com o objetivo de conhecer melhor as características macroscópicas e microscópicas relacionadas à implantação dos cisticercos e a evolução imunológica da doença, bem como avaliar o desempenho do imunoensaio ELISA no diagnóstico de bovinos com infecção natural e experimental, através da administração oral de ovos de Taenia saginata. Os trabalhos de campo com os nove animais infectados experimentalmente envolveram coleta mensal de sangue nos intervalos de 30 dias, sendo que a partir de 120 dias pós-infecção um animal era abatido a cada 30 dias para realizar o exame anátomo-patológico e proceder com a coleta de cisticercos. As amostras dos animais naturalmente infectados foram obtidas através da coleta em matadouro-frigorífico comercial. Com relação à localização muscular dos cisticercos no grupo 1 (animais experimentalmente infectados), os sítios inspecionados rotineiramente predominantes de ocorrência foram o coração (37,7%), músculos mastigatórios (17,1%) e língua (2,3%). Em relação aos cortes comerciais estudados, foram encontrados os valores de 8,2% de cisticercos no acém, 6,6% na paleta, 6,2% no contra-filé e 5,8% na alcatra. Os outros tecidos não inspecionados rotineiramente que apresentaram cisticercos foram o diafragma, fígado e o esôfago, com 2,7%, 12,0% e 1,2% dos cisticercos totais. Houve predominância de cisticercos inviáveis nos músculos mastigatórios (77,3%), seguidos de 76,3% na musculatura do coração e 71,0% do fígado e na língua (50%). Os cisticercos viáveis predominaram na alcatra (80,0%), diafragma (71,4%) e esôfago (66,7%). Nos sítios de predileção dos animais naturalmente infectados, foram encontrados 61,78% dos cisticercos totais no coração, seguido dos músculos mastigatórios (38,21%) e fígado (10,19%). Em relação à viabilidade, o fígado apresentou 87,5% de cisticercos inviáveis, seguidos da língua com 66,7%, coração 63,2%, entretanto nos tecidos mastigatórios foi encontrada a maior frequência de cisticercos viáveis (68,3%). Dos nove animais estudados, cinco apresentaram a cinética de produção de anticorpos contra os cisticercos de forma semelhante quando mensurados a produção de anticorpos da classe IgM e IgG, constituindo-se o grupo 1. O pico de produção de anticorpos do grupo 1 ocorreu no período de 0-30 dias pós-infecção seguido de um declínio natural, mantendo-se detectável até o final do estudo, no entanto os outros dois grupos contendo dois animais cada apresentaram a cinética de produção de anticorpos diferente do grupo 1, sendo que, o grupo 2 não apresentou resposta imunológica contra os antígenos secretados pelos cisticercos e o grupo 3 apresentou resposta tardia à presença dos cisticercos. Em relação à produção média de IgG1 para todos os grupos, foi possível detectar elevação dos níveis de anticorpos a partir de 30 dias pós-infecção, tendo-se o pico de produção aos 270 dias e IgG2 aos 60 dias. Já em relação à resposta celular hospedeiro-parasito, foi possível observar que no caso de cisticercos viáveis estavam presentes em sua maioria células inflamatórias, e no caso de cisticercos inviáveis a presença de células reparadoras de tecido, sendo também correlacionada a quantidade de corpúsculos calcáreos com o estádio de morte do parasito. Com relação ao desempenho do teste ELISA frente a animais infectados naturalmente e experimentalmente utilizando o ponto de corte 1 (calculado a partir de amostras de animais negativos para a cisticercose durante inspeção de rotina em matadouro-frigorífico) e ponto de corte 2 (amostras de animais negativos para a cisticercose criados em isolamento) adicionados de 2 desvios-padrão (SD), a sensibilidade do teste foi de 12% e 24,4%. Ao utilizar o ponto de corte 1 e 2 adicionados de 3 SD a sensibilidade ficou em 1,99% e 14,4%, respectivamente. Já para as amostras de animais experimentalmente infectados utilizando o ponto de corte 1 e 2 adicionados de 2 SD a sensibilidade ficou em 55,9% e 92,5% e, adicionando 3 SD foram encontrados os valores de 31,2% e 86%. A especificidade do teste em todas as situações testadas ficou em 100%. A combinação desses resultados deve ser valorizada no diagnóstico da cisticercose bovina por meio do teste ELISA sugerindo sua utilização em associação com o teste anátomo-patológico realizado rotineiramente em matadouros-frigoríficos.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1196324 bytes, checksum: 0760aa5309df096b43864d5ebdabc40a (MD5) Previous issue date: 2013-03-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The bovine cysticercosis, caused by the larval form of Taenia saginata, is a current problem in Brazilian beef cattle, determining economic losses to the meat industry due to the carcass condemnation, also represents risks to public health. The main control measure of this zoonosis is applied after post-mortem examination at meat inspection; however, this method fails in detecting cysticerci in cases of low infections, reinforcing the need for additional research to develop alternatives for diagnosis, such as serological tests. The objectives of this study were: to evaluate different laboratory protocols of ELISA for the diagnosis of bovine cysticercosis using Taenia crassiceps (Tcra) larvae antigens to assess their performance against different categories of control sera from slaughtered cattle and, through immunoblotting, to identify peptides with significant diagnostic potential for bovine cysticercosis. Serum samples of cattle experimentally infected with eggs of T. saginata and negative for cysticercosis were also used in the evaluation of different laboratory protocols of ELISA, which involved six antigens of Tcra: total (T), total sonicated (Ts), total dialysate (Td), membrane (M), vesicular fluid (VF) and sonicated vesicular fluid (sVF). From previously defined protocols, we evaluated the performance of ELISA in a final step with the antigens T, Ts and M against sera of positive bovines (experimental and natural) and negative for cysticercosis, and of bovine with other pathologies. The immunoblotting assays were conducted with the T antigen, using four groups of control sera and then reactive peptides were identified and their frequencies and performance ratios were set. With previous evaluation of the protocols we have defined antigen concentrations of 10 μg/ml for VF and sVF antigens and 40 μg/ml for T, Ts, Td and M antigens; the established conjugate dilutions were 1:1.250 ( T, Ts and M) and 1:2,500 (Td, VF and sVF); the best serum dilution tested was 1:100 and the best blocking substance was 5% skimmed milk powder; and the antigens that best differed positive and negative animals were M and T antigens, followed by Ts and Td. The sensitivity rates obtained by ELISA were, respectively, with 2 and 3 standard deviations, 85 and 81.25% for T antigen, 82.5 and 78.75% for Ts antigen, and 80 and 80% for M antigen; specificity rates, with 2 and 3 standard deviations, were, respectively: 47.5 and 58.75% for T antigen, 65 and 73.75% for Ts antigen, and 58.75 and 62.5% for M antigen. In the immunoblotting, the most important diagnostical peptides, in descending order of accuracy were: 6-8 kDa (90.8%), 129-143 kDa (74.2%), 99-105 kDa (71.7%) and 14-19 kDa (71.1%). The suitable combination of various tested parameters contributed to increase the reliability of the ELISA test, once it facilitates the distinction between positive and negative animals. These protocols provided high sensitivity rates, which enables the practical applicability of the test, because it complements the post-mortem examination that shows high specificity, but low sensitivity in detecting carcasses with discrete infections. The results obtained by immunoblotting showed that the T antigen has peptides with a high diagnostic potential; hence, another serological test is useful in the diagnosis of bovine cysticercosis. / A cisticercose bovina, causada pela forma larvar da Taenia saginata, constitui um problema atual na pecuária de corte brasileira, determinando prejuízos econômicos para a indústria da carne em decorrência da condenação de carcaças parasitadas, além de representar riscos à saúde pública. A principal medida de controle desta zoonose é aplicada após o exame post mortem realizado na rotina de inspeção de carnes, no entanto, este método apresenta falhas na detecção de cisticercos em casos de infecções discretas, reforçando a necessidade de pesquisas adicionais para o desenvolvimento de alternativas para o diagnóstico, como os testes sorológicos. Os objetivos deste estudo foram avaliar diferentes protocolos laboratoriais do ELISA para o diagnóstico da cisticercose bovina utilizando antígenos de larva de Taenia crassiceps (Tcra), avaliar o seu desempenho frente a diferentes categorias de soros-controle de bovinos abatidos e, através do immunoblot, identificar os peptídeos com importante potencial diagnóstico para a cisticercose bovina. Amostras de soro de bovinos experimentalmente infectados com ovos de T. saginata e negativos para a cisticercose também foram utilizadas na avaliação de diferentes protocolos laboratoriais do ELISA, que envolveu seis antígenos de Tcra: total (T), total sonicado (Ts), total dialisado (Td), membrana (M), líquido vesicular (LV) e líquido vesicular sonicado (LVs). A partir de protocolos definidos previamente, foi avaliado o desempenho do ELISA numa etapa final com os antígenos T, Ts e M frente soros de bovinos positivos (experimentais e naturais) e negativos para a cisticercose e de bovinos com outras patologias. Os ensaios de immunoblot foram realizados, com o antígeno T, utilizando os quatro grupos de soros-controle e, em seguida, os peptídeos reativos foram identificados e estabelecidas as suas frequências e taxas de desempenho. Com a avaliação prévia dos protocolos ficaram definidas as concentrações de antígeno de 10 μg/ml para os antígenos LV e LVs e de 40 μg/ml para os antígenos T, Ts, Td e M; as diluições de conjugado estabelecidas foram 1:1.250 (T, Ts e M) e 1:2.500 (Td, LV e LVs); a melhor diluição de soro testada foi 1:100 e a melhor substância bloqueadora, o leite em pó desnatado a 5%; e os antígenos que melhor diferenciaram animais positivos e negativos foram o M e o T, seguidos pelos antígenos Ts e Td. As taxas de sensibilidade obtidas pelo teste ELISA foram respectivamente, com 2 e 3 desvios-padrão, 85 e 81,25% para o antígeno T, 82,5 e 78,75% para o antígeno Ts e 80 e 80% para o antígeno M; as taxas de especificidade, com 2 e 3 desvios-padrão, foram respectivamente: 47,5 e 58,75% para o antígeno T, 65 e 73,75% para o antígeno Ts e 58,75 e 62,5% para o antígeno M. Já no immunoblot os peptídeos de maior importância diagnóstica, em ordem decrescente de acurácia foram: 6-8 kDa (90,8%), 129-143 kDa (74,2%), 99-105 kDa (71,7%) e 14-19 kDa (71,1%). A combinação adequada dos diversos parâmetros testados contribuiu para ampliar a confiabilidade do teste ELISA, uma vez que facilita a diferenciação entre animais positivos e negativos. Estes protocolos proporcionaram altas taxas de sensibilidade o que facilita a aplicabilidade prática do teste, pois complementa o exame post mortem que apresenta alta especificidade, porém baixa sensibilidade em detectar carcaças com infecções discretas. Os resultados obtidos pelo immunoblot mostraram que o antígeno T possui peptídeos com alto potencial diagnóstico, sendo, portanto, outro teste sorológico útil no diagnóstico da cisticercose bovina.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:46:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 928214 bytes, checksum: f836c005563b3eda57ceef56008490fb (MD5) Previous issue date: 2007-07-17 / The bovine cisticercosis is an illness caused by the larva of Taenia saginata called Cysticercus bovis. Recently the implementation of immunologic tests has been suggested as alternative for the diagnosis of the illness, amongst these tests the Immunoblotting, that basically detect antibodies in the serum. The present work objectives the evaluation of the Immunoblotting performance in the immunodiagnosis of bovine cisticercosis as well as of Taenia saginata and Taenia crassiceps antigens. The Taenia saginata antigens (Tsag) was gotten from the calves through the experimental infection and the Taenia crassiceps (LVcra and Tcra) antigen was gotten through experimental infection in mice balb/c. The antigens had been tested in four groups of Immunoblot control-serum: 28 samples of animals experimentally infected, 32 from naturally infected animals, 28 samples without illnesses and 19 samples with other pathologies. The peptides that had only reacted with the positive serum had been selected and identified as important, observing the localization criteria (molecular weight) as well as its physical appearance, particularly the color intensity. Related to these characteristics, valid for three tested antigens, the bands of 4-6, 14 and 18KDa had been distinguished between the others, showing the highest taxes of performance and a differentiated profile, with bigger area and height, similar to a spot. The 4-6KDa peptides presented the taxes of 66.7, 66.7 and 50% of sensitivity and 97.5, 84.6 and 96.2% of specificity when used the LVcra, Tcra and Tsag antigens, respectively. The 14KDa peptide presented 87.5, 87.5 and 77.8% of sensitivity and 97.5 94.9 and 100% of specificity with the LVcra, Tcra and Tsag antigens, respectively. The 18KDa peptide presented for LVcra, Tcra and Tsag, respectively, 75, 41.7 and 88.9% sensitivity values and 97.5, 89.7 and 92.3% of specificity. Crossed reactions with other illnesses between the three antigenic preparations and the 4-6, 14 and 18KDa peptides had not been observed. The values reached in this experiment indicate that the peptides with molecular weight of 4-6, 14 and 18KDa, can be considered important in the diagnosis of bovine cisticercosis. Low sensitivity values of Immunoblot had been observed when serum of animals with natural infection, generally discrete, had been considered. On the other hand, serum samples of antibodies from the studied bovines demonstrated high taxes of performance in the recognition of the 4-6, 14 and 18 Kda peptides, what characterize the test qualitatively, becoming it useful for the diagnosis of cisticercosis, as well as teste antigens. / A cisticercose bovina é uma doença causada pela larva de Taenia saginata, denominada Cysticercus bovis. Recentemente, tem sido sugerida, como alternativa para o diagnóstico da doença, a implementação de testes imunológicos, dentre eles o Imunoblot, que tem por princípio a detecção de anticorpos no soro. O presente trabalho objetiva a avaliação do desempenho do imunoblot no imunodiagnóstico da cisticercose bovina, bem como, dos antígenos de Taenia saginata e Taenia crassiceps. Os antígenos de Taenia saginata (Tsag) foram obtidos através da infecção experimental dos bezerros e os de Taenia crassiceps (LVcra e Tcra), através da infecção experimental em camundongos balb/c. Os antígenos foram testados no Immunoblotting frente a quatro grupos de soros-controle: 28 amostras de soro de animais experimentalmente infectados, 32 de animais naturalmente infectados, 28 sem doenças e 19 com outras patologias. Foram selecionados os peptídeos que reagiram somente com os soros positivos, os quais foram identificados como importantes, observando os critérios de localização (peso molecular), bem como sua aparência física, particularmente a intensidade de cor. As bandas de 4-6, 14 e 18KDa destacaram-se entre as outras, mostrando as mais altas taxas de desempenho e um perfil diferenciado, com área e altura maiores, semelhantes a uma mancha. Os peptídeos de 4-6KDa apresentaram as taxas de 66,7, 66,7 e 50% de sensibilidade e 97,5, 84,6 e 96,2% de especificidade quando utilizados os antígenos LVcra, Tcra e Tsag, respectivamente. O peptídeo de 14KDa apresentou 87,5, 87,5 e 77,8% de sensibilidade e 97,5 94,9 e 100% de especificidade com os antígenos LVcra , Tcra e Tsag , respectivamente. O peptídeo de 18KDa apresentou para LVcra, Tcra e Tsag, respectivamente, valores de 75, 41,7 e 88,9% de sensibilidade e 97,5, 89,7 e 92,3% de especificidade. Não foram observadas reações cruzadas com outras doenças entre as três preparações antigênicas e os peptídeos de 4-6, 14 e 18KDa. Os valores alcançados neste experimento indicam que os peptídeos com peso molecular de 4-6, 14 e 18KDa, podem ser considerados importantes no diagnóstico da cisticercose bovina. Observaram-se baixos valores de sensibilidade do imunoblot quando se consideraram soros de animais com infecção natural, geralmente discreta. Por outro lado, as altas taxas de desempenho demonstradas no reconhecimento dos peptídeos de 4-6, 14 e 18KDa, pelos anticorpos presentes nas amostras de soros dos bovinos estudados, caracterizam qualitativamente o teste, tornando-o útil no diagnóstico da cisticercose.