A produção citrícola se encontra dispersa por todos os continentes e no Brasil, os citros são a produção frutícola de maior volume de produção. A produção de citros de mesa, como as tangerinas, possibilita ao produtor obter maior valor pelo seu produto. O mercado consumidor é ávido por novas variedades e para tanto, um programa de melhoramento deve estar sempre em busca de genótipos que atendam ao mercado consumidor, bem como a cadeia produtiva. Na Estação Experimental Agronômica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, está localizada uma população de tangerineiras híbridas oriundas do cruzamento da tangerineira ‘Clementina Fina’ (Citrus clementina Hort. ex Tan.) e ‘Montenegrina’ (Citrus deliciosa Ten.) a qual foi caracterizada neste estudo, avaliando-se características morfológicas de acordo com os descritores propostos pelo International Board for Plant Genetic Resources, além da identificação da época de maturação, viabilidade de pólen, número cromossômico e caracterização molecular, utilizando marcadores do tipo microssatélites. Através da análise morfológica foi possível distinguir todas as 96 plantas avaliadas, porém não foi possível agrupar a F1 em grupos distintos de cada um dos genitores. A época de maturação de frutos das plantas se concentra entre a primeira quinzena de abril até a primeira quinzena de agosto. Todas as plantas analisadas apresentaram um alto grau de viabilidade de pólen, variando entre 79,04 e 98,08 %. Todas as plantas avaliadas são diplóides com um número cromossômico de 2n=18. Utilizando 12 pares de primers de microssatélites foi possível diferenciar 90 acessos do estudo, e agrupar a F1 em indivíduos mais próximos do genitor feminino e do genitor masculino. O PIC (Conteúdo de Informação de Polimorfismo) dos primers variou de 0,27 a 0,65. Não foi possível estabelecer uma relação entre a caracterização utilizando marcadores morfológicos e a caracterização utilizando marcadores moleculares. / Citrus production is widespread all over the world and in Brazil it represents the major volume of fruit production. Production of fresch fruit, as tangerines, allow the farmer to obtain a better value for the product. The consuming market is keen for new varieties and a breeding program should be always searching for genotypes that satisfy the market as well as the productive chain. At the Agronomic Experimental Station of Federal University of Rio Grande do Sul there is a population of hybrid tangerines, as result of crosses between ‘Clementina Fina’ (Citrus clementina Hort. ex Tan.) and ‘Montenegrina’ (Citrus deliciosa Ten.). In this study, this population was characterized using the morphological descriptors proposed by the International Board for Plant Genetic, besides other characteristics such as ripening period, pollen viability, chromosome number and a molecular characterization with SSR markers. It was possible to distinguish all the 96 evaluated plants by the morphological descriptors, but it was not possible to separate the F1 in groups distinct from the parents. Ripening occurred between mid April and mid August. All the analyzed plants had a high pollen viability, ranging from 79.04% to 98.08%. All plants are diploid, with 2n = 18. By using 12 pairs of primers it was possible to differentiate 90 of the analyzed accessions and group F1 individuals closer to the female and male parents. The PIC (polymorphism information content) ranged from 0.27 and 0.65. It was not possible to establish a relation between the morphological and the molecular characterizations. 1Master of Science dissertation in Agronomy, Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil. (67p.) March, 2006.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-02-08T17:58:33Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 606320 bytes, checksum: 39f5d5af70ea59ca04c8b23200d0b407 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-08T17:58:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 606320 bytes, checksum: 39f5d5af70ea59ca04c8b23200d0b407 (MD5) Previous issue date: 2016-07-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O estudo do cariótipo de plantas possibilita a identificação e classificação dos cromossomos provendo informações básicas e aplicadas à taxonomia, sistemática, evolução e melhoramento de plantas. Com o advento dos projetos genômicos e de sequenciamento de plantas, a caracterização do cariótipo da forma tradicional passou a ser insuficiente quanto a contribuição de informação de dados. Dessa forma, a quantificação do conteúdo de DNA dos cromossomos por citometria de imagem (CI) pode ser incorporada à caracterização do cariótipo. Essa metodologia fornece uma análise quantitativa a partir de imagens digitais. As imagens são convertidas em pixels, que estão relacionados a uma cor e uma intensidade em específico, e processadas pelo programa de análise de imagens, gerando valores de absorbância relacionados com a área, denominados valores de densidade óptica integrada (DOI). Por meio da quantificação de DNA cromossômico é possível resolver pequenas diferenças na quantidade de DNA de cromossomos morfologicamente semelhantes e pequenos. A utilização de técnicas que possibilitam uma melhor diferenciação dos homólogos, ou mesmo a análise do conteúdo de DNA cromossômico poderá agregar conteúdo informacional ao cariótipo de Z. mays e contribuir com projetos de sequenciamento de genoma. Portanto, o objetivo deste estudo foi determinar o conteúdo de DNA por cromossomo, bem como para os seus respectivos braços via CI em Zea mays L. Inicialmente, foi realizado a quantificação de DNA nuclear que resultou em um valor médio de 2C = 6,10 pg. As análises de CF mostraram variação nos genomas entre os acessos de Z. mays. Essa variação foi evidenciada pela comparação do conteúdo de DNA nuclear dos dois cultivares, o ‘CE-777’ e o ‘AL Bandeirante’. A variação no conteúdo nuclear em plantas tem sido atribuída principalmente aos elementos transponíveis. As técnicas de dissociação celular e secagem ao ar foram empregadas no preparo das lâminas, e essas hidrolisadas e coradas com reativo de Schiff. As imagens foram capturadas por uma vídeo-câmera CCD monocromática, acoplada a um microscópio, e analisadas com recursos digitais de análise de imagem. Distribuindo o valor 2C médio de DNA nuclear, estabelecido pela citometria de fluxo (CF), em relação aos valores médios da DOI, quantificado pela CI, o conteúdo de DNA foi mensurado para todos os cromossomos de Z. mays e seus braços. Essa metodologia possibilitou quantificar o conteúdo de DNA dos cromossomos, sendo que eles variaram de 2C = 0,803 pg (cromossomo 1) a 0,385 pg (cromossomo 10). A média dos valores para os braços cromossômicos em metáfases variaram para o braço curto de 0,376 (cromossomo 1) a 0,131 (cromossomo 10), e para o braço longo 0,427 a 0,255 dos mesmos cromossomos, respectivamente. O conteúdo de DNA da região satélite do cromossomo 6 também foi mensurado e apresentou 2C = 0,053 pg. No presente estudo, o cromossomo classificado como 9 apresentou uma maior quantidade de DNA que o cromossomo 8, devido a sua maior área. O conhecimento do conteúdo de DNA nuclear e cromossômico em plantas constitui uma informação básica, importante e útil para estudos taxonômicos e evolutivos. / The plant karyotype studies allows the identification and classification of chromosomes providing basic and applied information to the taxonomy, systematics, evolution and breeding of different crops. With the advent of plant genomic and sequencing projects, the traditional karyotype characterization became insufficient as to the contribution of data information. Thus, the quantification of DNA amount of chromosomes by image cytometry (ICM) can be incorporated to the karyotype characterization. This methodology provides a quantitative analysis from digital images. The images are converted to pixels, which are related specifically to a color and intensity, and processed by an image analysis program, generating absorbance values related with area, denominated values of integrated optical density (IOD). Through the chromosomal DNA quantification, it is possible to resolve small differences in DNA amount of morphologically similar and short chromosomes. Therefore, this study aimed to determine the DNA content by chromosome, as well for its arms by ICM in Zea mays L. Initially, nuclear DNA quantification was performed and resulted in medium value of 2C = 6.10 pg. The cell dissociation and air-drying techniques were employed in the slides preparations, and these were hydrolyzed and stained with Schiff’s reagent. The images were captured by a monochrome CCD video camera coupled to a microscope, and analyzed using digital image analysis capabilities. Distributing the average value 2C nuclear DNA, as established by the flow cytometry (FCM) in relation to the average values of IOD quantified by ICM, DNA content was measured for all Z. mays chromosomes and arms. This methodology allowed to quantify the DNA content of the chromosomes, which ranged from 2C = 0.803 pg (chromosome 1) to 0.385 pg (chromosome 10). The average values for the chromosomes arms in metaphase ranged from 0.376 short arm (chromosome 1) to 0.131 short arm (chromosome 10) 0.427 long arm to 0.255 long arm of the same chromosome, respectively. The DNA content of the satellite regions of chromosome 6 in metaphase was also measured and presented 0.053 pg. The knowledge of the plant nuclear and chromosomal DNA contents constitutes a basic, important and useful information for taxonomic and evolutionary studies. Furthermore, the results obtained in the present work may contributes to improve the informational content of maize karyotype and provides subsidies for genome sequencing projects.

A produção citrícola se encontra dispersa por todos os continentes e no Brasil, os citros são a produção frutícola de maior volume de produção. A produção de citros de mesa, como as tangerinas, possibilita ao produtor obter maior valor pelo seu produto. O mercado consumidor é ávido por novas variedades e para tanto, um programa de melhoramento deve estar sempre em busca de genótipos que atendam ao mercado consumidor, bem como a cadeia produtiva. Na Estação Experimental Agronômica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, está localizada uma população de tangerineiras híbridas oriundas do cruzamento da tangerineira ‘Clementina Fina’ (Citrus clementina Hort. ex Tan.) e ‘Montenegrina’ (Citrus deliciosa Ten.) a qual foi caracterizada neste estudo, avaliando-se características morfológicas de acordo com os descritores propostos pelo International Board for Plant Genetic Resources, além da identificação da época de maturação, viabilidade de pólen, número cromossômico e caracterização molecular, utilizando marcadores do tipo microssatélites. Através da análise morfológica foi possível distinguir todas as 96 plantas avaliadas, porém não foi possível agrupar a F1 em grupos distintos de cada um dos genitores. A época de maturação de frutos das plantas se concentra entre a primeira quinzena de abril até a primeira quinzena de agosto. Todas as plantas analisadas apresentaram um alto grau de viabilidade de pólen, variando entre 79,04 e 98,08 %. Todas as plantas avaliadas são diplóides com um número cromossômico de 2n=18. Utilizando 12 pares de primers de microssatélites foi possível diferenciar 90 acessos do estudo, e agrupar a F1 em indivíduos mais próximos do genitor feminino e do genitor masculino. O PIC (Conteúdo de Informação de Polimorfismo) dos primers variou de 0,27 a 0,65. Não foi possível estabelecer uma relação entre a caracterização utilizando marcadores morfológicos e a caracterização utilizando marcadores moleculares. / Citrus production is widespread all over the world and in Brazil it represents the major volume of fruit production. Production of fresch fruit, as tangerines, allow the farmer to obtain a better value for the product. The consuming market is keen for new varieties and a breeding program should be always searching for genotypes that satisfy the market as well as the productive chain. At the Agronomic Experimental Station of Federal University of Rio Grande do Sul there is a population of hybrid tangerines, as result of crosses between ‘Clementina Fina’ (Citrus clementina Hort. ex Tan.) and ‘Montenegrina’ (Citrus deliciosa Ten.). In this study, this population was characterized using the morphological descriptors proposed by the International Board for Plant Genetic, besides other characteristics such as ripening period, pollen viability, chromosome number and a molecular characterization with SSR markers. It was possible to distinguish all the 96 evaluated plants by the morphological descriptors, but it was not possible to separate the F1 in groups distinct from the parents. Ripening occurred between mid April and mid August. All the analyzed plants had a high pollen viability, ranging from 79.04% to 98.08%. All plants are diploid, with 2n = 18. By using 12 pairs of primers it was possible to differentiate 90 of the analyzed accessions and group F1 individuals closer to the female and male parents. The PIC (polymorphism information content) ranged from 0.27 and 0.65. It was not possible to establish a relation between the morphological and the molecular characterizations. 1Master of Science dissertation in Agronomy, Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil. (67p.) March, 2006.

A produção citrícola se encontra dispersa por todos os continentes e no Brasil, os citros são a produção frutícola de maior volume de produção. A produção de citros de mesa, como as tangerinas, possibilita ao produtor obter maior valor pelo seu produto. O mercado consumidor é ávido por novas variedades e para tanto, um programa de melhoramento deve estar sempre em busca de genótipos que atendam ao mercado consumidor, bem como a cadeia produtiva. Na Estação Experimental Agronômica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, está localizada uma população de tangerineiras híbridas oriundas do cruzamento da tangerineira ‘Clementina Fina’ (Citrus clementina Hort. ex Tan.) e ‘Montenegrina’ (Citrus deliciosa Ten.) a qual foi caracterizada neste estudo, avaliando-se características morfológicas de acordo com os descritores propostos pelo International Board for Plant Genetic Resources, além da identificação da época de maturação, viabilidade de pólen, número cromossômico e caracterização molecular, utilizando marcadores do tipo microssatélites. Através da análise morfológica foi possível distinguir todas as 96 plantas avaliadas, porém não foi possível agrupar a F1 em grupos distintos de cada um dos genitores. A época de maturação de frutos das plantas se concentra entre a primeira quinzena de abril até a primeira quinzena de agosto. Todas as plantas analisadas apresentaram um alto grau de viabilidade de pólen, variando entre 79,04 e 98,08 %. Todas as plantas avaliadas são diplóides com um número cromossômico de 2n=18. Utilizando 12 pares de primers de microssatélites foi possível diferenciar 90 acessos do estudo, e agrupar a F1 em indivíduos mais próximos do genitor feminino e do genitor masculino. O PIC (Conteúdo de Informação de Polimorfismo) dos primers variou de 0,27 a 0,65. Não foi possível estabelecer uma relação entre a caracterização utilizando marcadores morfológicos e a caracterização utilizando marcadores moleculares. / Citrus production is widespread all over the world and in Brazil it represents the major volume of fruit production. Production of fresch fruit, as tangerines, allow the farmer to obtain a better value for the product. The consuming market is keen for new varieties and a breeding program should be always searching for genotypes that satisfy the market as well as the productive chain. At the Agronomic Experimental Station of Federal University of Rio Grande do Sul there is a population of hybrid tangerines, as result of crosses between ‘Clementina Fina’ (Citrus clementina Hort. ex Tan.) and ‘Montenegrina’ (Citrus deliciosa Ten.). In this study, this population was characterized using the morphological descriptors proposed by the International Board for Plant Genetic, besides other characteristics such as ripening period, pollen viability, chromosome number and a molecular characterization with SSR markers. It was possible to distinguish all the 96 evaluated plants by the morphological descriptors, but it was not possible to separate the F1 in groups distinct from the parents. Ripening occurred between mid April and mid August. All the analyzed plants had a high pollen viability, ranging from 79.04% to 98.08%. All plants are diploid, with 2n = 18. By using 12 pairs of primers it was possible to differentiate 90 of the analyzed accessions and group F1 individuals closer to the female and male parents. The PIC (polymorphism information content) ranged from 0.27 and 0.65. It was not possible to establish a relation between the morphological and the molecular characterizations. 1Master of Science dissertation in Agronomy, Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil. (67p.) March, 2006.

Passiflora (Passifloraceae) é um grande gênero de espécies vegetais encontradas, principalmente, na flora tropical. Algumas passifloras são cultivadas como plantas ornamentais, frutíferas ou exploradas pelas suas propriedades medicinais. A principal espécie comercial brasileira, o maracujá-azedo (Passiflora edulis f. flavicarpa, 2n = 18), ocupa 95% da área plantada. Os frutos são consumidos in natura ou processados pela indústria de suco. Estudos genéticos e cromossômicos têm sido gerados para esta espécie. Entretanto, devido ao pequeno tamanho e a similaridade morfológica dos seus cromossomos, as medições do cariótipo convencional do maracujá-azedo têm levado a resultados inconsistentes, sendo necessário o desenvolvimento de marcadores cromossomos-específicos. Estes marcadores são produzidos a partir da identificação de sequências de cópia-única em clones de bibliotecas de BACs (Bacterial Artificial Chromosome), que são utilizadas como sondas em ensaios de FISH (Hibridização in situ Fluorescente). Neste trabalho, foi construída uma biblioteca genômica de maracujá-azedo em BACs contendo 82.944 clones, com tamanho médio dos insertos de 108 kb, e provendo uma cobertura de seis vezes o genoma. A biblioteca apresentou baixa contaminação com cpDNA e mtDNA (~0,04% e 0%, respectivamente), e foi possível o isolamento de oito clones contendo genes putativos de P. edulis f. flavicarpa. Estes clones foram marcados e utilizados como sondas em ensaios de FISH. Destas sondas, quatro apresentaram sinal único de hibridização, e foram mapeadas nos cromossomos 1 (gene ERS), 3 (gene ACCO) e 4 (genes G3PD e CYCD1). As demais sondas (genes LOX, NDID e MIPS) apresentaram sinais de hibridização subteloméricos ou pericentroméricos, indicando a presença de DNA repetitivo nos clones; a sonda contendo o gene EMB não revelou sinal fluorescente. Com base em análises de FISH, definiu-se, no presente trabalho, um novo cariótipo para o maracujá-azedo, com marcadores específicos para os cromossomos 1, 3 e 4, localizando, também, sítios de DNAr 45S nos cromossomos 7 e 8, e um sítio de DNAr 5S no cromossomo 5. A exploração da biblioteca de BAC, bem como o mapa físico aqui estabelecido, representa importantes avanços para guiar pesquisas futuras sobre o gênero Passiflora. / Passiflora (Passifloraceae) is a large genus of plant species essentially found in the tropical flora. Some passiflora are grown as ornamentals, cultivated for their edible fruits, or exploited due to their medicinal properties. The main Brazilian commercial species, the yellow passion fruit (Passiflora edulis f. flavicarpa, 2n = 18) occupies 95% of all planted orchards. The fruits are eaten fresh or used for industrial juice production. Genetic and chromosomal studies have been carried out on the species. However, due to the small size and morphological similarity of their chromosomes, the conventional measures of the karyotype have produced some inconsistent results, being imperative the development of chromosome-specific markers. These markers are produced by identifying BAC (Bacterial Artificial Chromosome) library clones that harbor single copy sequences, which are used as probes in FISH (Fluorescent in situ Hybridization) assays. In the present work, a yellow passion fruit genomic BAC library of 82.944 clones was constructed, with average insert sizes of 108 kb, and covering six times the genome equivalent. The library has shown a low level of cpDNA and mtDNA contamination (~0.04% and 0%, respectively), and it was possible the isolation of eight clones harboring putative genes of P. edulis f. flavicarpa. These clones were labeled and used as probes in FISH assays. Of these probes, four have shown single hybridization signals, and they were mapped on chromosome 1 (ERS gene), 3 (ACCO gene), and 4 (G3PD and CYCD1 genes). The other probes (LOX, NDID and MIPS gene) revealed subtelomeric or pericentromeric signals, suggesting the presence of repetitive DNA sequences in the clones; the probe harboring the EMB gene did not reveal any hybridization signal. Based on FISH analyses, a new karyotype for the passion fruit was established in the present work, with specific markers in chromosomes 1, 3 and 4; we also mapped 45S rDNA sites in chromosomes 7 and 8, and one 5S rDNA site in chromosome 5. The exploitation of the BAC library, as well as the physical map here established, represents novel and essential advances to guide future researches on the Passilfora genus.

O presente trabalho teve por objetivo compreender e analisar os mecanismos genéticos e epigenéticos da expressão diferencial de regiões organizadoras do nucléolo - RONs através do estudo de dois acessos (CRT-1 e CRT-2) de Crotalaria retusa. O acesso CRT-1 é uma cultivar, enquanto que o acesso CRT-2 é proveniente de uma população periférica da orla marítima de Ilhéus BA. Por serem temporalmente e espacialmente separados, acredita-se que os acessos foram submetidos a pressões seletivas diferentes, resultando em alterações dos padrões epigenéticos, principalmente nas RONs. Para o desenvolvimento deste trabalho foram realizadas medidas cromossômicas e nucleolares a partir de células coradas pelo método de Feulgen e por nitrato de prata, coloração com fluorocromos específicos às regiões cromossômicas ricas em nucleotídeos GC e AT, mapeamento físico dos locos de DNA ribossômico 45S por hibridação in situ fluorescente, análise qualitativa e quantitativa de modificações pós-traducionais de histonas por Western blot e eletroforese bidimensional de extrato protéico radicular com enfoque em proteínas envolvidas nos mecanismos epigenéticos. As análises citológicas demonstraram uma grande semelhança nos cariótipos dos dois acessos, diferindo apenas no tamanho do segmento proximal do braço curto do cromossomo 1. Em ambos os acessos foi observada uma expressão nucleolar diferencial em, aproximadamente, 50% das células; contudo, a expressão diferencial em CRT-2 apresentou-se consideravelmente maior. Além disso, os dois acessos demonstraram diferenças quantitativas nas modificações pós-traducionais de histonas e em proteínas possivelmente envolvidas em mecanismos epigenéticos. Uma vez que as variações epigenéticas podem ser modificadas por fatores ambientais, sugere-se que as diferenças nos padrões de modificações de histonas e nos perfis protéicos encontradas entre os acessos, como também a expressão diferencial mais expressiva em CRT-2, sejam devidas às diferentes pressões seletivas as quais as populações originais foram submetidas. O estudo dos mecanismos genéticos e epigenéticos na dominância nucleolar possibilita uma maior compreensão da ação do remodelamento da cromatina no controle da expressão gênica do rDNA, como também da expressão gênica em geral. / The aim of this present work was to understand and analyze the genetic and epigenetic mechanisms of differential expression of the nucleolus organizer regions - NORs through the study of two accesses (CRT-1 and CRT-2) of Crotalaria retusa. Access CRT-1 is a cultivar, while access CRT-2 is from a peripheral population of the shoreline of Ilhéus BA. Because they are temporally and spatially separated, it is believed that the accesses were submitted to different selective pressures, resulting in changes in epigenetic patterns, primarily in NORs. To develop this work, it was carried out chromosomal and nucleolar measurements from cell stained by Feulgen method and silver nitrate, staining with specific fluorochromes to chromosomal regions rich in GC and AT nucleotides, physical mapping of 45S ribosomal DNA loci by fluorescent in situ hybridization, qualitative and quantitative analysis of post-translational histone modifications by western blot, and two-dimensional electrophoresis of root extract protein focusing on proteins involved in epigenetic mechanisms. The cytological analysis showed a great similarity in karyotypes of two accessions, differing only in size of the proximal segment of the sort arm of chromosome 1. In both accesses, it was observed a differential nucleolar expression in approximately 50% of the cells; however, the differential expression in CRT-2 showed considerably larger. Furthermore, the two accesses showed quantitative differences in the posttranslational histone modifications, and in a protein possibly involved in epigenetic mechanisms. Since epigenetic variations can be modified by environmental factors, it is suggested that differences in patterns of histone modifications and protein profiles found between the accesses, but also the most significant differential expression in CRT-2, are due to different selective pressures to which the original populations were submitted. Studies of the epigenetic mechanisms in nucleolar dominance allows a better understanding of the action of the remodeling of chromatin in controlling the dosage of rRNA genes, but also in the control of gene expression in general.

Passiflora (Passifloraceae) é um grande gênero de espécies vegetais encontradas, principalmente, na flora tropical. Algumas passifloras são cultivadas como plantas ornamentais, frutíferas ou exploradas pelas suas propriedades medicinais. A principal espécie comercial brasileira, o maracujá-azedo (Passiflora edulis f. flavicarpa, 2n = 18), ocupa 95% da área plantada. Os frutos são consumidos in natura ou processados pela indústria de suco. Estudos genéticos e cromossômicos têm sido gerados para esta espécie. Entretanto, devido ao pequeno tamanho e a similaridade morfológica dos seus cromossomos, as medições do cariótipo convencional do maracujá-azedo têm levado a resultados inconsistentes, sendo necessário o desenvolvimento de marcadores cromossomos-específicos. Estes marcadores são produzidos a partir da identificação de sequências de cópia-única em clones de bibliotecas de BACs (Bacterial Artificial Chromosome), que são utilizadas como sondas em ensaios de FISH (Hibridização in situ Fluorescente). Neste trabalho, foi construída uma biblioteca genômica de maracujá-azedo em BACs contendo 82.944 clones, com tamanho médio dos insertos de 108 kb, e provendo uma cobertura de seis vezes o genoma. A biblioteca apresentou baixa contaminação com cpDNA e mtDNA (~0,04% e 0%, respectivamente), e foi possível o isolamento de oito clones contendo genes putativos de P. edulis f. flavicarpa. Estes clones foram marcados e utilizados como sondas em ensaios de FISH. Destas sondas, quatro apresentaram sinal único de hibridização, e foram mapeadas nos cromossomos 1 (gene ERS), 3 (gene ACCO) e 4 (genes G3PD e CYCD1). As demais sondas (genes LOX, NDID e MIPS) apresentaram sinais de hibridização subteloméricos ou pericentroméricos, indicando a presença de DNA repetitivo nos clones; a sonda contendo o gene EMB não revelou sinal fluorescente. Com base em análises de FISH, definiu-se, no presente trabalho, um novo cariótipo para o maracujá-azedo, com marcadores específicos para os cromossomos 1, 3 e 4, localizando, também, sítios de DNAr 45S nos cromossomos 7 e 8, e um sítio de DNAr 5S no cromossomo 5. A exploração da biblioteca de BAC, bem como o mapa físico aqui estabelecido, representa importantes avanços para guiar pesquisas futuras sobre o gênero Passiflora. / Passiflora (Passifloraceae) is a large genus of plant species essentially found in the tropical flora. Some passiflora are grown as ornamentals, cultivated for their edible fruits, or exploited due to their medicinal properties. The main Brazilian commercial species, the yellow passion fruit (Passiflora edulis f. flavicarpa, 2n = 18) occupies 95% of all planted orchards. The fruits are eaten fresh or used for industrial juice production. Genetic and chromosomal studies have been carried out on the species. However, due to the small size and morphological similarity of their chromosomes, the conventional measures of the karyotype have produced some inconsistent results, being imperative the development of chromosome-specific markers. These markers are produced by identifying BAC (Bacterial Artificial Chromosome) library clones that harbor single copy sequences, which are used as probes in FISH (Fluorescent in situ Hybridization) assays. In the present work, a yellow passion fruit genomic BAC library of 82.944 clones was constructed, with average insert sizes of 108 kb, and covering six times the genome equivalent. The library has shown a low level of cpDNA and mtDNA contamination (~0.04% and 0%, respectively), and it was possible the isolation of eight clones harboring putative genes of P. edulis f. flavicarpa. These clones were labeled and used as probes in FISH assays. Of these probes, four have shown single hybridization signals, and they were mapped on chromosome 1 (ERS gene), 3 (ACCO gene), and 4 (G3PD and CYCD1 genes). The other probes (LOX, NDID and MIPS gene) revealed subtelomeric or pericentromeric signals, suggesting the presence of repetitive DNA sequences in the clones; the probe harboring the EMB gene did not reveal any hybridization signal. Based on FISH analyses, a new karyotype for the passion fruit was established in the present work, with specific markers in chromosomes 1, 3 and 4; we also mapped 45S rDNA sites in chromosomes 7 and 8, and one 5S rDNA site in chromosome 5. The exploitation of the BAC library, as well as the physical map here established, represents novel and essential advances to guide future researches on the Passilfora genus.

O presente trabalho teve por objetivo compreender e analisar os mecanismos genéticos e epigenéticos da expressão diferencial de regiões organizadoras do nucléolo - RONs através do estudo de dois acessos (CRT-1 e CRT-2) de Crotalaria retusa. O acesso CRT-1 é uma cultivar, enquanto que o acesso CRT-2 é proveniente de uma população periférica da orla marítima de Ilhéus BA. Por serem temporalmente e espacialmente separados, acredita-se que os acessos foram submetidos a pressões seletivas diferentes, resultando em alterações dos padrões epigenéticos, principalmente nas RONs. Para o desenvolvimento deste trabalho foram realizadas medidas cromossômicas e nucleolares a partir de células coradas pelo método de Feulgen e por nitrato de prata, coloração com fluorocromos específicos às regiões cromossômicas ricas em nucleotídeos GC e AT, mapeamento físico dos locos de DNA ribossômico 45S por hibridação in situ fluorescente, análise qualitativa e quantitativa de modificações pós-traducionais de histonas por Western blot e eletroforese bidimensional de extrato protéico radicular com enfoque em proteínas envolvidas nos mecanismos epigenéticos. As análises citológicas demonstraram uma grande semelhança nos cariótipos dos dois acessos, diferindo apenas no tamanho do segmento proximal do braço curto do cromossomo 1. Em ambos os acessos foi observada uma expressão nucleolar diferencial em, aproximadamente, 50% das células; contudo, a expressão diferencial em CRT-2 apresentou-se consideravelmente maior. Além disso, os dois acessos demonstraram diferenças quantitativas nas modificações pós-traducionais de histonas e em proteínas possivelmente envolvidas em mecanismos epigenéticos. Uma vez que as variações epigenéticas podem ser modificadas por fatores ambientais, sugere-se que as diferenças nos padrões de modificações de histonas e nos perfis protéicos encontradas entre os acessos, como também a expressão diferencial mais expressiva em CRT-2, sejam devidas às diferentes pressões seletivas as quais as populações originais foram submetidas. O estudo dos mecanismos genéticos e epigenéticos na dominância nucleolar possibilita uma maior compreensão da ação do remodelamento da cromatina no controle da expressão gênica do rDNA, como também da expressão gênica em geral. / The aim of this present work was to understand and analyze the genetic and epigenetic mechanisms of differential expression of the nucleolus organizer regions - NORs through the study of two accesses (CRT-1 and CRT-2) of Crotalaria retusa. Access CRT-1 is a cultivar, while access CRT-2 is from a peripheral population of the shoreline of Ilhéus BA. Because they are temporally and spatially separated, it is believed that the accesses were submitted to different selective pressures, resulting in changes in epigenetic patterns, primarily in NORs. To develop this work, it was carried out chromosomal and nucleolar measurements from cell stained by Feulgen method and silver nitrate, staining with specific fluorochromes to chromosomal regions rich in GC and AT nucleotides, physical mapping of 45S ribosomal DNA loci by fluorescent in situ hybridization, qualitative and quantitative analysis of post-translational histone modifications by western blot, and two-dimensional electrophoresis of root extract protein focusing on proteins involved in epigenetic mechanisms. The cytological analysis showed a great similarity in karyotypes of two accessions, differing only in size of the proximal segment of the sort arm of chromosome 1. In both accesses, it was observed a differential nucleolar expression in approximately 50% of the cells; however, the differential expression in CRT-2 showed considerably larger. Furthermore, the two accesses showed quantitative differences in the posttranslational histone modifications, and in a protein possibly involved in epigenetic mechanisms. Since epigenetic variations can be modified by environmental factors, it is suggested that differences in patterns of histone modifications and protein profiles found between the accesses, but also the most significant differential expression in CRT-2, are due to different selective pressures to which the original populations were submitted. Studies of the epigenetic mechanisms in nucleolar dominance allows a better understanding of the action of the remodeling of chromatin in controlling the dosage of rRNA genes, but also in the control of gene expression in general.

A protease FtsH pertence à superfamília das proteínas AAA (ATPases Associadas à diversas Atividades celulares) cujos membros estão amplamente distribuídos entre procariotos e eucariotos. Nas plantas superiores, elas são codificadas por genes nucleares e sintetizadas por ribossomos citosólicos com uma seqüência de direcionamento na extremidade amino-terminal responsável pela translocação da pré-proteína para o interior das organelas, notadamente mitocôndrias e cloroplastos. Com o objetivo de caracterizar o processo de translocação da proteína aos tilacóides e sua regulação gênica em plantas, isolou-se um cDNA de frutos de tomate (Lycopersicon esculentum Mill. cv. MicroTom), cuja seqüência de aminoácidos revela a presença de todos os motivos clássicos pertencentes a uma protease do tipo FtsH-p1. A caracterização inicial da proteína indicou a presença de um típico peptídeo de trânsito cloroplástico em sua extremidade amino-terminal. A fim de definir qual região da proteína madura está envolvida no direcionamento da protease às membranas, foram realizadas construções gênicas contendo diferentes comprimentos da região amino-terminal da FtsH-p1 de tomate fusionados ao gene repórter GFP (green fluorescent protein). Estudos realizados a partir de frações enriquecidas de cloroplastos, estroma e tilacóide, provenientes de plantas transgênicas expressando estavelmente estas construções, revelaram que todas as proteínas de fusão acumularam-se no estroma sendo, portanto incapazes de associarem-se aos tilacóides. Estes dados indicam que a inserção da FtsH-p1 de tomate nas membranas dos tilacóides dependem de informação presente na proteína madura, necessária para a interação com as membranas ou mesmo com um fator adicional desconhecido. Alem disso, foi mostrado que membros da família das proteases do tipo das FtsHs em plantas não apresentam o clássico motivo RRXFLK, previamente descrito como essencial para a translocação dependente de uma dupla arginina (Tat). Devido ao envolvimento de ortólogos desta proteína em processos fisiológicos importantes nas plantas, abriu-se a possibilidade de estudar a regulação da FtsH-p1 de tomate via clonagem e caracterização da sua região promotora. Uma vez clonada, 4 deleções à partir da extremidade 5’ nesta região foram realizadas e fusionadas de forma a dirigirem a expressão do gene repórter uidA (GUS). Estas construções foram expressas estavelmente em plantas de tabaco, a fim de estudar sua regulação em diferentes tecidos, estádios de desenvolvimento e em resposta a estímulos ambientais ou situações de estresse. Os resultados preliminares mostraram que a seqüência regulatória clonada é responsível tanto à fatores ambientais, como luz, quanto aos hormônios auxina, citocinina e giberelina. Além disso, foi observada uma regulação negativa na presença de peróxido de hidrogênio. Entretanto, tratamentos envolvendo estresse salino, bem como variações na temperatura não geram nenhum efeito na atividade da enzima GUS. O mesmo ocorre quando as plantas são colocadas em presença de ácido abscísico (ABA). Os resultados deste estudo contribuem significativamente para um melhor entendimento dos mecanismos de regulação envolvidos no controle da expressão gênica da FtsH-p1 de tomate, bem como sugerem novas perspectivas no direcionamento de proteínas às membranas. / The FtsH protease belongs to the AAA family (ATPases associated with different cellular activities) whose members are widely distributed in prokaryotes and eukaryotes. In higher plants, these proteins are nuclear-encoded and synthesized by cytosolic ribosomes as larger molecular weight precursors. These molecules carry at the N-terminal extension a specific targeting sequence that directs translocation of the preproteins to the envelope membranes of mitochondria and chloroplasts. In the present work, a tomato (Lycopersicon esculentum Mill. cv. MicroTom) fruit cDNA encoding a plastid FtsH-p1 has been isolated, cloned and characterized. In order to define the protein domains involved on thylakoid targeting, several gene constructions were prepared carrying increasing lengths of the N-terminal region of tomato FtsH fused to the gfp (green fluorescent protein) reporter gene. In vivo expression studies based on onion cells or stable expression in transgenic tobacco plants showed that the chimeric proteins were translocated to plastids. In addition, sub-organellar fractionation indicated that GFP accumulated in the stromal fraction, instead of being translocated to the thylakoid membrane. These data suggest that membrane insertion of tomato FtsH-p1 requires information present in the mature protein. One remarkable finding was that members of the FtsH family do not present the classical RRXFLK motif, that has been shown to be essential for the Tat-dependent pathway. The FtsH-family members are involved in important physiological processes in plant cells. Therefore, this study opened up the possibility of studying the FtsH-p1 gene regulation by characterization of its regulatory region. After cloning a 1700 bp fragment corresponding to 5’ upstream region of the tomato FtsH coding sequence, four deletions of the promoter region were performed and the resulting fragments were fused to the uidA (GUS) reporter gene. These gene constructs were stable expressed in tobacco plants and further characterized. The results showed that the promoter region is positively regulated by light and the phytohormones auxin, cytokine and gibberelin. Besides, the promoter was down regulated by hydrogen peroxide. However, GUS activity was not affected by salt stress, variations on the temperature and abcisic acid treatment. The results presented here expand the current understanding of factors involved on FtsH gene regulation as well as bring new insights on the protein targeting to membranes.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 638342 bytes, checksum: 8e72262147ec2f82c5e75db8ecf80969 (MD5) Previous issue date: 2010-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Somatic embryogenesis is an alternative technique of clonal micropropagation in Carica papaya, taking into account the problems generated by the conventional seed propagation and the absence of an effective method for early sex determination of this trioecious species. Considering the interest in large-scale seedlings production of papaya, liquid system and the use of immature zygotic embryos as explant source have proved to be more efficient for the somatic embryos generation in quickly way and in relatively high amount. However, tissue culture techniques are frequently associated with somaclonal variation ocorrence. Therefore, detection and selection of somaclones become necessary, and different methodologies have been employed for this purpose. In this perspective, this study adapted a protocol for mass production of somatic embryos in liquid medium and adopted cytometry and cytogenetics strategies for monitoring somaclonal variation in papaya. Firstly, immature zygotic embryos, which show a high embryogenic potential, were cultured in semi-solid médium, in the presence of 2,4-D, for friable embryogenic callus induction. The transfering of these callus to a liquid system, under the 2,4-D and BAP regulators action, allowed the increase of the cell aggregates proliferation. This auxin and cytokinin ratio was ideal for allowing only cell proliferation rather than differentiation of the suspensions in somatic embryos. These were converted and matured after inoculation of aggregates in liquid medium supplemented with ABA. In this condition, somatic embryos suspensions were obtained, in the early heart, torpedo, pre-cotyledonary and cotyledonary stages. Direct somatic embryogenesis, without callus formation, was also observed from the primary somatic embryos. Cotyledonary embryos were extracted and germinated on semi-solid medium containing GA3. About 80% of plantlets were regenerated and subjected to in vitro acclimatization. The potential of the flow cytometry technique could be demonstrated by verifying the ploidy level of regenerants and, thus, the evaluation of somaclonal variation occurrence. In this screening, diploid (88%), tetraploid (6%) and aneuploid (6%) seedlings were detected. For cytogenetic methodology, known diploid seedlings had their karyograms assembled, in which it did not observe any numerical or structural change. The association of flow cytometry and cytogenetics methodologies has proven effective for somaclonal variants characterization and the interest diploid seedlings selection for clonal propagation. Mainly, flow cytometry can be considered a viable technique for commercial purposes. / A embriogênese somática é uma técnica alternativa de micropropagação clonal em Carica papaya, tendo em vista os problemas gerados pela propagação convencional, via seminífera, e a ausência de um método eficaz para determinação sexual precoce dessa espécie trióica. Considerando o interesse pela produção em larga escala de plântulas do mamoeiro, o sistema líquido e o uso de embriões zigóticos imaturos como fonte de explante têm se mostrado mais eficientes para a geração de embriões somáticos de forma rápida e em quantidade relativamente elevada. Entretanto, técnicas de cultura de tecidos estão, frequentemente, associadas com a ocorrência de variação somaclonal. Portanto, a detecção e a eliminação de somaclones tornam-se necessárias, e diferentes metodologias têm sido empregadas para tal fim. Nesta perspectiva, este estudo adaptou um protocolo para produção em massa de embriões somáticos em meio líquido e adotou estratégias citométricas e citogenéticas para o monitoramento de variação somaclonal, em mamoeiro. Inicialmente, embriões zigóticos imaturos, que apresentam alto potencial embriogênico, foram cultivados em meio semi-sólido, na presença de 2,4-D, para indução de calos embriogênicos friáveis. A transferência desses calos para um sistema líquido, sob a ação dos reguladores 2,4-D e BAP, possibilitou a ampliação da proliferação de agregados celulares. Esta combinação de auxina e citocinina foi ideal por possibilitar somente a proliferação celular e não a diferenciação das suspensões em embriões somáticos. A conversão e a maturação destes ocorreram após a inoculação dos agregados em meio líquido suplementado com ABA. Nesta condição, foram obtidas suspensões de embriões somáticos, nos estágios cordiforme, torpedo, pré-cotiledonar e cotiledonar. Embriogênese somática direta, sem a formação de calos, também foi observada a partir dos embriões somáticos primários. Embriões no estágio cotiledonar foram extraídos e germinados em meio semi-sólido contendo GA3. Cerca de 80% de plântulas foram regeneradas e submetidas à aclimatização in vitro. A potencialidade da técnica de citometria de fluxo pôde ser demonstrada pela verificação do nível de ploidia dos regenerantes e, consequentemente, pela avaliação da ocorrência de variação somaclonal. Neste escaneamento, foram detectadas plântulas diplóides (88%), tetraplóides (6%) e aneuplóides (6%). Pela metodologia citogenética, plântulas conhecidamente diplóides tiveram seus cariogramas montados, nos quais não foi observada nenhuma alteração numérica ou estrutural. A associação de metodologias citométricas de fluxo e citogenéticas se mostrou eficaz para a caracterização de variantes somaclonais e para a seleção das plântulas diplóides de interesse para a propagação clonal. Principalmente, a citometria de fluxo pode ser considerada uma técnica viável para fins comerciais.