Mon travail de thèse s’est focalisé sur l’étude fonctionnelle de deux méthyltransférases (MTases) de la structure coiffe des ARNs, les protéines nsp14 et nsp16, chez le coronavirus responsable du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV). Notre étude a démonté un processus de méthylation séquentiel. La coiffe est d’abord méthylée en position N7 par nsp14 formant la coiffe-0 (7mGpppN). La coiffe-0 est ensuite méthylée en position 2’OH du premier nucléotide de l’ARN par nsp16 stimulée par nsp10 formant une coiffe 1 (7mGpppN2’Om). De plus, nos résultats suggèrent un mécanisme de régulation allostérique de l’activité de nsp16 par nsp10. Nos résultats indiquent que l’interaction nsp10/nsp16 est régulée par la variation de concentration du SAM et/ou de SAH. Le SAM présent à une concentration physiologique, environ 100 µM dans les cellules, favorise l’assemblage du complexe nsp10/nsp16. La faible concentration intracellulaire du SAH produit accélère la dissociation du complexe nsp10/nsp16 permettant le « turnover » de la réaction enzymatique. Par ailleurs, nous avons cartographié les résidus essentiels au recrutement de l’ARN par nsp16. Les méthylations étudiées jouent un rôle important dans la réplication virale. Nous avons donc criblé des inhibiteurs des deux MTases nsp14 et nsp10/nsp16 respectivement à partir des chimiothèques « Prestwick » et « 2P2I3D ». En résumé, mon travail de thèse a décortiqué les bases moléculaires de méthylation de la coiffe chez le MERS-CoV et a permis d’identifier des inhibiteurs de MTases représentant un point de départ crucial pour le développement d’antiviraux contre les CoV. / My PhD work focused on the functional study of two cap RNA methyltransferases (MTases), nsp14 and nsp16, of the Middle-East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV). Our study demonstrates a sequential methylation process. The cap is first methylated at the N7 position by nsp14 forming a cap-0 (7mGpppN). It is next methylated at the 2’OH position of the first transcribed nucleotide by nsp16 stimulated by nsp10 forming a cap-1 (7mGpppN2’Om). Furthermore, our results suggest an allosteric regulation mechanism of the nsp16 activity by nsp10. Moreover, our results indicate that the nsp10/nsp16 interaction is regulated by the variation of SAM and/or SAH concentration. SAM present at physiologic concentration, around 100µM in cells, enhances the assembly of nsp10/nsp16. The weak intracellular concentration of SAH by-product speeds up the dissociation of nsp10/nsp16 allowing the enzymatic reaction turnover. In addition, we have mapped the essential residues for the recruitment of the RNA by nsp16. The methylations studied in this work play an important role for viral replication. We have therefore screened inhibitors of nsp14 and nsp10/nsp16 MTases respectively from chemical libraries « Prestwick » and « 2P2I3D ». In summary, my PhD work deciphers the molecular bases of cap RNA methylation of MERS-CoV and identifies MTase inhibitors that represent a crucial starting point for the development of antivirals against CoV.

Ce travail de thèse a porté sur l’étude d’activités enzymatiques virales impliquées dans la réplication de deux genres viraux : les Flavivirus et les Coronavirus. Dans un premier temps, nous avons étudié des activités enzymatiques impliquées dans la formation de la structure coiffe des ARNm viraux. En effet, du fait de leur cycle réplicatif cytoplasmique, ces virus n’ont pas accès à la machinerie de formation de la coiffe cellulaire et expriment donc une machinerie dédiée. Le processus canonique de formation de la coiffe fait appel à quatre activités enzymatiques, une ARN 5’-triphosphatase, une guanylyltransférase et deux méthyltransférases.Chez les flavivirus, nous avons développé des outils permettant d’identifier l’activité guanylyltransférase ainsi que des essais enzymatiques nécessaires à la caractérisation des activités méthyltransférases. Ces outils nous ont notamment permis d’évaluer l’effet inhibiteur de molécules choisies par des méthodes de criblages virtuels sur les deux activités méthyltransférases de la protéine NS5 nécessaires à la formation de la coiffe.Chez les coronavirus, nous nous sommes intéressés à une activité méthyltransférase impliquée dans la formation de la coiffe et notamment à sa régulation par un partenaire viral. Nous avons démontré que le processus de méthylation de la coiffe suit un ordre obligatoire, initié par la méthylation de la position N7 par la protéine nsp14. Dans une seconde étape, les structures coiffe-0 (7MeGpppA) sont converties en coiffe-1 (7MeGpppA2’OMe) par la protéine nsp16 en complexe avec nsp10. Nous avons démontré que l’activité 2’O-méthyltransférase portée par la protéine nsp16 nécessite une interaction spécifique avec la protéine nsp10 qui joue probablement un rôle d’échafaudage.Dans un second temps, nous avons démontré que l’activité exoribonucléase portée par la protéine nsp14 est également régulée par la protéine nsp10. La stimulation de l’activité passe par une interaction directe entre les deux protéines et il semble que les surfaces d’interaction de nsp10 avec nsp14 et nsp16 soient chevauchantes. Enfin, la caractérisation de l’activité exoribonucléase confirme la possibilité de son implication dans un mécanisme de réparation des erreurs incorporées lors de la synthèse d’ARN par la polymérase virale. / This work focused on enzymatic activities of two RNA virus genera, Flavivirus and Coronavirus.We first studied the mRNA cap synthesis machinery of these viruses. Indeed, as they replicate in the cytoplasm of the infected cell, these viruses encode their own mRNA cap-forming enzymes. The canonical mechanism of cap synthesis uses four enzymatic activities, a RNA 5’-triphosphatase, a guanylyltransferase and two methyltransferases.We tried to identify the guanylyltransferase activity involved in this process for flaviviruses and we developed enzymatic assays to characterize both guanylyltransferase and methyltransferase activities. We used the methyltransferase assay in order to test the inhibitor effect of molecules, selected by virtual screening, on the methyltransferase activities of the NS5 protein involved in the capping process.Concerning coronaviruses, we first focused on the methyltransferase activities of the nsp14 and nsp16 proteins. We have reconstituted the complete SARS-CoV mRNA cap methylation in vitro. We showed that mRNA cap methylation requires a third viral protein, nsp10, which acts as an essential trigger to complete RNA cap-1 formation. The obligate sequence of methylation events is initiated by nsp14, which first methylates capped RNA transcripts to generate cap-0 7MeGpppA-RNAs. The latter are then selectively 2′O-methylated by the 2′O-methyltransferase nsp16 in complex with its activator nsp10 to give rise to cap-1 7MeGpppA2′OMe-RNAs. Then, we took interest in the exoribonuclease activity of the nsp14 protein and found that this activity is also regulated by the same cofactor, the nsp10 protein. The interaction between the proteins is required to observe the stimulatory effect and it seems that the surface areas of nsp10 interacting with nsp14 and nsp16 overlap. The in vitro characterization of the nuclease activity of nsp14 is according with its potential implication in RNA proofreading mechanism.

Ma thèse a porté sur l’étude des activités enzymatiques impliquées dans la formation de la coiffe de deux virus à ARN: le virus du Nil Occidental (WNV) et le métapneumovirus humain (hMPV). Ces virus codent pour des enzymes assurant l’ajout de la coiffe de type-1 (m7GpppN2’Om) à l’extrémité 5’ de leur ARNm.Le domaine N-terminal de la protéine NS5 (NS5MTase) du WNV porte les activités N7- et 2’O-méthyltransférases (N7- et 2’O-MTases) et il a été proposé que NS5MTase puisse également porter l’activité guanylyltransférase (GTase). J’ai identifié in vitro des résidus clés impliqués dans l’interaction entre NS5MTase et des ARN substrats de chaque activité MTase. Nos résultats démontrent que le site de fixation de la coiffe est nécessaire lors de la 2’O-méthylation et ne l’est pas pour la N7-méthylation. En parallèle, j’ai recherché des résidus catalytiques de la GTase par la méthode de génétique inverse. Des résultats préliminaires indiquent que la mutation K29A induit un défaut de réplication. Ce résidu pourrait donc être impliqué dans l’activité GTase de NS5MTase.Concernant hMPV, j’ai effectué une analyse fonctionnelle du domaine CR-VI+ de la protéine L. J’ai démontré que CR-VI+ possède les activités N7- et 2’O-MTases et j’ai identifié les résidus impliqués dans le recrutement de l’ARNm. L’ordre de méthylation est non canonique avec la 2’O-méthylation qui précède la N7-méthylation. Enfin, j’ai également démontré que CR-VI+ possède une activité d’hydrolyse du GTP.Ce travail démontre que ces MTases possèdent 2 voire 3 des activités enzymatiques nécessaires à la formation de la coiffe, et représentent donc une cible de choix pour le développement d’inhibiteurs. / My PhD project is focus on the study of the enzymatic activities involved in the RNA capping pathway of two RNA viruses: the West Nile Virus (WNV) and the human metapneumovirus (hMPV). These viruses encode for enzymes allowing the addition of a cap-1 structure (m7GpppN2’Om) to their mRNA 5’ ends. The NS5 N-terminal domain (NS5MTase) of WNV harbours the N7- and 2’O-methyltransferase activities (N7- and 2’O-MTase); and it has been proposed that NS5MTase also bears a guanylyltransferase activity (GTase). I have identified residues involved in the NS5MTase interaction sites with their RNAs substrate. My assays demonstrate the importance of the cap-binding site for the 2’O-methylation but not for the N7-methylation. In parallel, I have tried to identify putative catalytic residues of the GTase activity by reverse genetics. Preliminary results suggest that NS5MTase K29 could be a catalytic residue.Concerning hMPV, I performed a functional analysis of CR-VI+ domain of the protein L. I demonstrated that the CR-VI+ domain harbours the N7- and 2’O-MTase activities and identified the residues involved in the mRNA recruitment. I showed that the methylation order is not canonical with the 2’O-methylation preceding the N7-methylation. Finally, I showed that the domain harbours an additional GTP hydrolysis activity, representing the first step of RNA cap formation for Mononegavirales.This work demonstrates that this MTase domains harbour 2 or 3 of the enzymatic activities required for viral RNA cap synthesis and represent attractive targets for the development of antivirals.